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白桦三萜的合成和调控



全 文 :植物生理学通讯 第 45卷 第 5期,2009年 5月520
收稿 2008-10-09 修定  2009-03-30
资助 黑龙江省科技攻关项目(GA06B301-4-3)和中国博士后
基金(2 00 804 308 73 )。
* 通讯作者(E-mail: yaguangzhan@126.com; Tel: 0452-
8 2 1 9 1 7 5 2 )。
白桦三萜的合成和调控
尹静 1, 詹亚光 1,*, 肖佳雷 2
1东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨 150040; 2黑龙江省农业科学院, 哈尔滨 150086
Synthesis and Regulation of Triterpene from Betula platyphylla Suk.
YIN Jing1, ZHAN Ya-Guang1,*, XIAO Jia-Lei2
1College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,
Harbin 150086, China
提要: 白桦树叶和树皮中含有次生代谢产物白桦三萜, 其中白桦树外皮中含有丰富的羽扇豆烷型的三萜白桦酯醇和白桦酯
酸, 这两种天然产物具有抑制人免疫缺陷病毒复制和选择性杀死癌细胞等药理活性, 并显示出与以往药物不同的作用机制,
疗效高而毒性低, 被认为是具有一定开发潜力的抗癌、抗艾滋病类先锋药物。本文就天然药物成分白桦三萜组成、分布的
组织特异性、药理活性、代谢途径、环境调控和白桦三萜生物合成关键酶基因克隆的研究进展作一介绍。
关键词: 白桦三萜; 组织特异性; 代谢调控; 关键酶基因
白桦(Betula platyphylla Suk.)属桦木科桦木属,
为落叶乔木, 是我国东北地区多种地带性植被的先
锋树种, 因其生长迅速, 适应性强, 材质优良而成为
重要的经济树种。早在《本草纲目》中就有记
载, 桦树皮可用于黄疸、乳痛、疥疮等疾病的治
疗, 此外, 在民间还用于治疗慢性痢疾及清热解毒、
止咳、平喘、消炎、杀菌等(Marston和Hostetman
1987; Steele等 1999), 但其药用成分研究开发甚
少。自从 Fujioka等(1994)和 Pisha等(1995)先后报
道了白桦酯酸可以抑制H9淋巴细胞中HIV病毒复
制和选择性地抑制黑色素瘤细胞的生长以来, 白桦
三萜类物质(triterpenes of Betula platyphylla, TBP)
药理作用也越来越受到国内外学者的广泛重视, 大
量研究表明, 其药理活性多样, 且显示出了与以往
药物不同的作用机制(Sun等2002; Valentin等2002)
疗效高而毒性低, 具有抗肿瘤、抗艾滋病及抗菌、
抗病毒、降脂、利胆和保肝等作用(Soler等 1996;
Zhukova等 2005; Kovalenko等 2007), 作为有潜力
的新型药物制剂, 具有广阔的应用前景。
1 白桦三萜的组成及其分布的组织特异性
白桦三萜的主要成分是白桦树外皮中的白桦
酯醇(betulin, lup-20(29)-ene-3β,28-diol, C30H50O2)、
白桦酯酸(betulinic acid, 3β-hydroxy-lup-20(29)-ene-
28-oicacid, C30H48O3)及树叶中桦叶烯三醇(betulafole-
nentriol)、桦叶烯四醇(betulafolienetetraol)等, 都是
重要的天然次生代谢产物。白桦酯醇、白桦酯酸
为羽扇豆烷型的五环三萜, 广泛分布于桦木属植物
及其它许多属植物中。白桦酯醇又称桦木脑、桦
木醇, 溶于乙醇、乙醚、氯仿和苯, 微溶于冷水、
石油醚等, 含1 mol乙醇的溶剂化物为针状结晶, 干
燥后, 170~180 ℃ (10.67 Pa)升华。白桦酯酸约占
白桦树外皮干重的0.025%左右, 是白桦酯醇经两步
合成的, 与白桦酯醇有类似的药理活性(Sun等
2002)。桦叶烯三醇、桦叶烯四醇为达玛烷型四
环三萜物质, 主要分布在白桦树叶中, 约占树叶干
重 0.25%。另有少量树种的根皮也有分布, 而树干
部的树皮中则没有, 且不同白桦树种叶中的达玛烷
型三萜结构也存在差异。由于与人参皂苷的苷元
结构相似, 所以表现出一些特殊的生物活性, 如桦
叶烯三醇与人参皂苷的苷元的差别仅在于C-3羟基
的构型不同, 也是治疗癌症和心血管疾病及提高机
体免疫功能的候选药物。
白桦树外皮含有不同类型的三萜化合物, 主要
类型是羽扇醇, 在白桦树外皮干重的10%~40%, 含
量多少取决于白桦树品种、生长条件、树龄和生
植物生理学与农业及生产应用 Plant Physiology and Agriculture and Applications
植物生理学通讯 第 45卷 第 5期,2009年 5月 521
长季节。有报道, 每公斤白桦树外皮中含三萜系化
合物 434.4 g, 其中白桦酯醇为 423.2 g。同时有人
以树径分别为 16.6、22.3、33.1 cm的白桦树研
究桦木内皮与外皮的化学组成及其含量与树径的关
系, 结果认为, 不同树木径级内、外皮的化学组成
及其含量(其中包括三萜系化合物的数量和组成)无
明显波动(崔艳霞和郑志方 1994)。也有研究发现,
白桦植株中还含有齐墩果烷型又称β-香树脂烷(β-
amyrane)型的齐墩果酸、环阿屯烷型的 β-谷甾醇
等三萜类物质。另外, 由白桦组织培养的无菌苗茎
段和叶柄诱导的愈伤组织中也具有一定含量的三萜
物质(Zhang等 2003; 王博 2008), 这为通过细胞培
养技术或生物反应器生产白桦三萜物质, 提供了要
线索。
除桦木属植物白桦外, 白桦酯醇和白桦酯酸也
广泛分布在干草根皮、草药酸枣仁、棍栏树皮、
菊科植物云木香的根、槐花等, 另外在蜂胶、花
粉、马兰、大枣、葡萄干等也有分布, 在这些植
物中的发现印证了它们的一些特殊功效, 如抗炎活
性、抗衰老功效。含白桦酯醇的植物虽然很多,
但含量超过10%的很少, 从白桦树皮中提取白桦酯
醇, 得率可达 35%, 纯度在 95%以上, 是很好的植
物资源。
2 白桦三萜的合成代谢途径和关键酶
三萜类物质是以乙酰辅酶A原料经甲羟戊酸
途径(mevalonic pathway, MVA, 又称 cytosolic
pathway)在细胞质中合成的(Newman和 Chappell
1999)。甲羟戊酸是在第一个限速酶 3-羟基 3-甲
基戊二酰辅酶 a还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl
coenzyme a reductase, HMGR)的作用下生成的(Rosa
等 2007), 经MVA途径形成异戊烯基焦磷酸酯
(isopentenyl diphosphate, IPP)和其双键异构体二甲
基烯丙焦磷酸酯(dimethylallyl diphosphate, DMAPP),
进一步缩合形成倍半萜、三萜和甾体。而单萜
(monote rpene )、二萜(d i t er pene )是以丙酮酸
(pyruva te)和磷酸甘油醛(glycera ldehydes-3-
phos pha t e )为原料, 经丙酮酸 /磷酸甘油醛途径
(pyruvate/glyceralde-hyde-3-phosphate pathway,
DXP途径)合成的。倍半萜生物合成的 IPP既可来
源于MVA途径, 也可来源于DXP途径, 或者同时
来源两条途径。在萜类化合物生物合成的两条途
径中, 最后都是由 5个碳原子的 IPP和其双键异构
体DMAPP缩合而成各种萜类的前体。IPP是 “ 活
化” 的异戊二烯单元, 是所有萜类生物合成的中心
前体。在烯丙基转移酶(prenylt ransferase)的催化
作用下, IPP与其异构体DMAPP经头尾缩合生成
具 C10骨架的香叶基焦磷酸(geranyl diphosphate,
GPP); GPP加上第 2个 IPP单元形成具C15骨架的
法呢基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP) (Lange等
1999), 最后 2个倍半萜缩合形成共同的三萜前体 -
2,3-氧化角鲨烯(2,3-oxidosqualene, 2,3-OSC), 在不
同三萜合酶作用下, 如羽扇醇合酶(lupeol synthases,
LUS)作用下合成羽扇醇、白桦酯醇、白桦酯酸;
在环阿齐醇合酶(cycloartenol synthase, CAS)作用
下合成固醇、甾酮类三萜; 在达玛烷烯二醇合酶
(dammarenediol synthases, DS)作用下合成达玛烯二
醇; 在 β-香树酯醇合酶(β-amyrin synthase, β-AS)
作用下合成齐墩果酸类、香树酯醇或干草皂苷等
三萜物质(Hiroaki等 2001, 2004; Zhang等 2003)。
白桦酯醇是白桦酯酸的合成前体, 两者的差别仅在
于C28位是CH2OH而不是COOH。其合成过程和
化学结构如图 1。
萜类次生代谢的特征之一就是种属和组织特
异性, 许多单萜、倍半萜和三萜成分往往来源于特
定的种属、特定的物种, 而这些化合物在某一植物
体内仅存在于某一类器官、组织、细胞或细胞器
中, 并受到独立的调控(Lange等 2000; Hiroaki等
2001, 2004; Dudareva等 1996), 这与生物合成关键
酶的定位有关。如Hiroaki (2001)发现, 甘草中甘
草皂苷(齐墩果烷类三萜皂角苷)是植物根中产生的,
仅在增厚的根和匍匐枝的木质部合成, 大豆皂苷(齐
墩果烷类三萜皂苷)大体分布在甘草的种子和枝根
中。甘草中的白桦酯酸主要分布在粗根的软木
层。干草悬浮培养细胞不具备生产甘草皂苷的能
力, 但能够产生甾醇类、大豆皂苷和白桦酯酸三萜
化合物。这种现象与其相应的组织中的三萜基因
表达是相吻合的。另外, 人们也发现三萜基因的表
达具有时序性, 以三年生的甘草为材料, 采用
Northen杂交的方法对粗根中OSC表达水平的季节
性变化进行确认。5月份 β-AS表达水平最高, 此
时也是甘草迅速生长的时期; 6月、7月、9月份
β-AS的表达水平也很高, 此时地上部分也正在成长;
8月份β-AS表达水平非常低, 此时许多叶已脱落, 这
可能与正所处环境的高温多雨有关。冬季地上部
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分停止生长, β-AS不再表达。而 CAS基因的表达
却无组织或时间表达的特异性, 暗示其可能是一个
持家基因(housekeeping gene)。白桦三萜基因
CAS、β-AS和 LUS在悬浮细胞中能够被检测到
(Zhang等 2003)。
3 环境对三萜合成及其关键基因表达的调控
范桂枝等(2007)以13种八年生白桦为试材, 研
究不同部位及种源间白桦酯醇含量的结果表明, 在
白桦不同部位的含量分布差异显著, 依次分别为: 外
皮>枝皮>内皮>芽>叶>根>花粉; 13种八年生白桦
种源树皮内白桦酯醇的含量为 132.45~257.11 mg·g-1
(DW), 且种源间差异呈极显著水平, 东北地区的小
北湖和凉水两个白桦种源的含量最高, 达到257.11
和 240.36 mg·g-1 (DW), 而采自辽宁、内蒙和宁夏
的白桦种源的含量最低,分别为 139.24、136.26和
132.45 mg·g-1 (DW)。并认为白桦酯醇的含量不仅
受自身种源及遗传背景的影响, 同时也受到其所处
地理位置和气候因素的影响, 即属于基因与环境互
作的表现性状。关于环境因子对植株和细胞中单
萜和二萜类物质的合成和关键基因的表达研究已有
较多报道(Diane等 2002; 鲁守平等2006; 王海斌等
2007; Baltazar等 2007), 但关于三萜物质的研究起
步较晚。Hiroaki等(2001, 2004)以干草悬浮细胞为
材料, 研究表明茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)
和GA3对 3种OSC酶的调节效应是不同的。在培
养的细胞中添加MeJA, 可以促进β-AS表达和大豆
皂苷的合成, 但 L US 表达水平下降, 而赤霉素
(gibberellic acid, GA3)对 LUS表达影响不大。CAS
基因对MeJA和GA3的反应不明显。
最近, 我校森林生物工程研究室(詹亚光等
2002; 王博等 2008)以白桦无菌苗茎段为外植体在
IS固体培养基上诱导愈伤组织, 研究白桦细胞中三
萜物质的积累的结果表明, 白桦愈伤组织具有合成
三萜物质的能力, 但含量较低, 仅为 0.8~1.5 mg·g-1
(DW)。为了提高三萜物质的含量, 还研究了环境
因子, 包括光强、光质、光照时间、碳源和激素
等因素对三萜物质的积累调节效应, 结果表明, 培
养基中添加不同浓度(10~50 g·L-1)葡萄糖和果糖的
白桦愈伤组织中三萜物质含量先上升后下降, 而添
加蔗糖的则呈直线上升, 其中以 30 g·L-1蔗糖的最
高, 总三萜积累量达到 4.04 mg·g-1 (DW)。相对蓝
光、黄光而言, 白光更有利于三萜积累, 强光照高
于弱光照和黑暗, 白桦愈伤组织中三萜物质含量在
0~9 d呈上升趋势, 9~18 d 呈下降趋势, 18~21 d 略
微回升, 于第 9天达到最大值。白桦愈伤组织进行
悬浮培养发现, B5和NT培养基比MS、1/2MS、
WPM (木本植物培养基)和IS更有利于三萜积累, 含
量可达 11.2633 mg·g-1 (DW) 和 11.9671 mg·g-1
(DW); 激素 0.6 mg·L-1 TDZ+0.2 mg·L-1 6-BA和 0.2
mg·L-1 TDA+ 0.4 mg·L-1 6-BA配比可使三萜含量达
到11.136 mg·g-1 (DW)和14.2264 mg·g-1 (DW); 紧密
型愈伤组织三萜含量高于松散型的, 三萜含量达到
14.3075 mg·g-1 (DW) (王博等 2008)。这些研究为
采用细胞工程手段提高白桦三萜类化合物含量建立
了基础。
4 三萜基因克隆
萜类生物的合成可分为3个阶段, 中间体的生
成、萜类化合物的合成以及最后的修饰。相应的
酶可分为 3类, 包括生成 IPP和DMAPP以前的酶,
如MVP途径的HMGR; 生成萜类的各种环化酶, 它
图 1 高等植物中氧化鲨烯环化酶及白桦树中的三萜化合物(Zhang等 2003)
植物生理学通讯 第 45卷 第 5期,2009年 5月 523
们的作用是生成 IPP、DMAPP后, 催化其形成各
种不同分子量大小的形式各异的萜类化合物和中间
体, 是萜类生物合成关键酶; 第三类酶催化形成的
产物进行复杂的结构修饰, 主要包括羟基化、甲基
化、异构化、加成和还原等过程。其中关于前
两类酶研究及其基因克隆的报道已取得显著进展。
自 1992 年开始有植物合成酶基因克隆的报道, 迄
今为止, 已有 30 种以上的植物萜类合酶的 cDNA
被克隆, 其中已经从马铃薯(Korth等 1997)、棉花
(Loguercio等 1999)、番茄(Rodriguez-Concepcion
和Gmissem 1999)中克隆HMGR; 从绿薄荷的油腺
细胞中分离GPP, 并克隆其基因(Burke 等1999), 从
拟南芥中克隆了编码 F P P 合成酶的 c D N A 等
(Homann等 1996)。另外, 包括烟草(Facchini和
Chappell 1992)、番茄(Colby等 1998)、红豆杉
(Wildung和 Croteau 1996)、冷杉(Bohlmann和
Crotean 1999)、天仙子(Back和 Chappell 1995)、
棉花(Chen等1995)、蓖麻(Hill等1996)等植物的单
萜、倍半萜、二萜环化酶。
三萜化合物是以 2,3-OSC为共同的三萜前体,
在不同的三萜合酶, 其中包括 LUS、DS、CAS和
β-AS和多功能三萜合酶作用下合成的。一些三萜
合成酶能催化生成若干种三萜产物, 这种多功能的
三萜合成酶是植物中乌苏烷和齐墩果烷往往同时存
在的根本原因。最近, 关于三萜基因的克隆也陆
续见到报道, 其中包括十几种植物的33个三萜基因
(Mohammad等2007), 它们是5个编码β-AS的基因,
分别为人参的 PNY、PNY2 (Kushiro等 1999), 豌
豆的PSY (Morita等2000), 甘草的GgbAS1 (Hiroaki
等2001), 白桦的BPY (Zhang等2003); 6个编码LUS
合酶基因, 包括来自拟南芥的 LUP1、橄榄的OEW
(Kushiro等 1999)、蒲公英的TRW、干草的GgLUS
(Hiroaki等 2004)、白桦的 BPW (Zhang等 2003); 3
个编码 CAS合酶的基因, 来自白桦的 BPX、BPX2
(Zhang等 2003)、甘草的GgCAS (Hiroaki等 2000),
以及编码多功能三萜合酶的丝瓜LcIMS1, 拟南芥的
YuPH12R.43 (Kushiro等 1999)、豌豆 PSM (Morita
等2000)以及闭鞘姜和莲属多功能三萜基因。三萜
基因GgbAS1、GgLUS和GgCAS来自干草悬浮培
养细胞, 另外 BPX、BPX2、BPW 和 BPY 4个三
萜基因也是由东京大学的Zhang等(2003)以日本白
桦无菌苗叶柄诱导愈伤, 进行悬浮细胞培养, 以MS
培养基悬浮培养10 d的细胞为cDNA来源, 用PCR
方法克隆的, BPX、BPX2、BPW和 BPY的 cDNA
片段长度分别为 2 274、2 304、2 268和 2 340
bp, 均包含完整的开放阅读框(open reading frames,
OR F)。
萜类合酶在植物中有以下几个特点: 首先一种
植物中有多种萜类合酶基因, 如Steele等(1999)从愈
伤组织诱导的冷杉的茎构建的cDNA文库中得到了
11个防御相关的萜类合酶基因的克隆, 白桦和甘草
悬浮培养细胞中也被检测出具有 CAS、LUS和 β-
AS 三萜合酶基因的表达(Zhang等 2003)。其次有
表达的时空特异性, 在特定的细胞和组织中表达, 并
受到独立的调控(Lange等 2000; Hiroaki等 2004;
Schuhly等1999), 这与生物合成关键酶的定位密切
相关。有研究表明, 白桦三萜的合成也具有明显的
种属和植株分布部位的特异性, 如白桦酯醇和白桦
酯酸主要集中在树外皮, 而桦木烯二醇也仅分布在
桦树叶中, 另外, 在甘草植株中也发现, 三萜基因
β-AS 和 LUS在 5~7和 9~10月份有表达, 而高温多
雨的 8月份基因表达受抑制(Hiroaki等 2004)。大
多数萜类合酶基因都是在植物材料高表达其mRNA
时得到的。如烟草、棉花、莨菪、等植物的倍
半萜合成酶及干草、白桦的三萜合酶都是通过诱
导培养细胞表达而获得, cDNA文库也由这些诱导
细胞来构建, 所以构建经诱导的细胞cDNA文库能
富积萜类合酶基因。再次, 萜类合酶在植物中一般
表达量较低, 难于分离纯化。由于萜类合成酶基因
的表达和有效调控在植物的特异细胞中(Crock等
1997; Lange等2000; Mohammad等2007)进行,或者
在一定的生长发育阶段和短暂的防御反应发生期
间, 因此, 大多数基因的克隆都采用富集含量的植
物材料来分离mRNA。
植物萜类合成酶基因的克隆主要有两种策
略。 (1)酶纯化基础上的反向推测基因的方法: 通过
分离纯化蛋白质, 测定并获得氨基酸序列信息, 设
计合成与氨基酸序列相对应的核苷酸序列, 以合成
的核苷酸片断制备探针。采用探针筛选 cDNA文
库, 分离克隆酶的基因。(2)序列相似基础上的 PCR
方法: 根据萜类合成酶的共有序列片段设计简并引
物, 进行 PCR扩增, 得到相关酶的特异探针。再
利用探针筛选 cDNA文库, 分离克隆酶的基因。由
于植物萜类合成酶的纯化常常十分困难, 因此, 基
植物生理学通讯 第 45卷 第 5期,2009年 5月524
因序列相似基础上的克隆技术发展较快, 在裸子植
物和被子植物的许多萜类合成酶的基因克隆中广泛
应用。
5 结束语
据世界卫生组织国际癌症研究中心统计(http://
tech.sina.com.cn/ae/2003-04-08/0944176269.shtml),
根据目前癌症的发病趋势, 2020年全世界癌症发病
率将比现在增加50%, 全球每年新增癌症患者人数
将达到 1 500万人。而仅 2007年全世界新增加艾
滋病患者就达500万人(http://bbs.163.com/bbs/soci-
ety/39966523.html)。同时市场上用于治疗癌症和
艾滋病药物的需求量, 在以每年 20%的速度递增。
临床上应用的长春花碱、喜树碱等药物对细胞毒
性作用广, 专一性差, 白桦三萜对肿瘤细胞毒性是
正常细胞 2~10倍, 可高效的、有选择的抑制肿瘤
生长。但因其结构复杂, 化学合成产量低, 成本高,
一株三十年生白桦树含三萜也不足 0.5 kg, 因此严
重制约临床应用。致使如何有效利用白桦树植株
或组织为材料, 来提高白桦三萜化合物的积累, 成
为人们需要亟待解决的问题。另一方面, 白桦三萜
物质大多都为醇溶或酯溶性, 不易溶于水, 这也是
其未能大规模应用的一个原因。目前为止, 各国科
学家大多致力于白桦酯醇和白桦酯酸的药理活性及
作用机制研究, 在最近开始对其化学结构进行改造,
以开发其更具活性的衍生物和提高其水溶性。
关于这一领域的研究, 以下几点可以考虑: (1)
采用环境调控促进三萜物质高效合成。利用各种
生物和非生物诱导子促进三萜合成, 如在白桦植
株、细胞或组织发育的不同时期进行各种激素、
碳源、光、温调控及进行各种诱导子处理等, 建
立调控白桦三萜高效合成的技术体系。(2)加入三
萜合成前体物质, 进行微生物的生物转化。大规模
植物细胞培养技术因具有不受地区、季节、资源
的影响, 不破坏环境, 通过自动化控制细胞生长和
合理调节代谢过程来降低成本和提高生产率等优
点, 已成为植物药品的新来源。尤其是目前已检测
到白桦悬浮培养细胞中具有三萜合成的能力, 可通
过各种培养条件的优化以筛选出高产三萜的白桦悬
浮细胞系或细胞株, 为通过生物反应器和微生物转
化等技术和工艺进行大规模白桦三萜的生产奠定了
基础。(3)采用化学方法对白桦三萜进行改造。以
白桦酯酸或酯醇为母体, 设计开发新的衍生物以改
善其本身作为临床用药的某些弱点, 如水溶性差
等。如在三萜类化合物的分子上结合上若干糖基,
其形成的分子同时具有亲脂性的苷元结构和亲水性
的糖基。这种结构有类似于表面活性剂的结构, 其
水溶液振摇后能产生持久的泡沫, 且不影响其生物
活性。即把三萜类物质的糖苷化合物制成皂苷。
(4)克隆高效表达基因和进行分子调控。明确三萜
高效和限速合成基因, 采用cDNA文库筛选和PCR
同源性方法, 克隆三萜基因, 并进行特定植株或细
胞的转化, 促进其高效表达。另外, 通过MVA途
径其它非三萜合成基因表达沉默或miRNA方法抑
制其表达, 关闭有毒次生物的合成或改变代谢流的
方向, 从而大量合成有用的三萜物质。
可以预见, 随着医药工程和现代生物技术的不
断进步, 人们以白桦为材料, 尤其是白桦细胞, 通过
基因工程和细胞工程方法进行白桦三萜的高效生产
与合成, 将这一极具潜力的抗癌和艾滋病类药物应
用于生产实际和临床, 定会更加有效, 更好地满足
人类的需求。
参考文献
崔艳霞, 郑志方(1994). 白桦皮化学组成的研究. 东北林业大学学
报, 22: 53~58
范桂枝, 詹亚光, 王博, 邱磊, 刘桂丰, 王会仁(2007). 白桦不同部位
及种源间白桦酯醇含量的差异分析. 林产化学与工业, 27:
103~106
鲁守平, 隋新霞, 孙群, 孙常启, 王海斌, 熊君, 方长旬, 邱龙, 吴文
祥, 何海斌(2006). 药用植物次生代谢的生物学作用及生态
环境因子的影响. 天然产物研究与开发, 8: 1027~1032
王博, 范桂枝, 詹亚光(2008). 不同培养基类型和植物生长调节剂
配比对白桦愈伤组织中三萜积累的影响. 林业科学, 144 (10):
153~158
王海斌, 熊君, 方长旬, 邱龙, 吴文祥, 何海斌, 林文雄(2007). 氮素
胁迫下强、弱化感水稻萜类代谢途径中关键酶基因差异表
达的 FQ-PCR分析. 作物学报, 33 (8): 1329~1334
詹亚光, 杨传平(2002). 白桦愈伤组织高效诱导和不定芽分化. 植
物生理学通讯, 38 (2): 132~137
Back K, Chappell J (1995). Cloning and bacterial expression of a
sesquiterpene cyclase from Hyoscyamus muticus and its
molecular comparison to rela ted terpene cyclases. J Biol
Chem, 270: 7375~7381
Baltazar A, Espina-Lucero J, Ramos-Torres I, Gouzález-Aguilar G
(2007). Effect of methyl jasmonate on properties of intact
tomatofruit monitored with destructive and nondestructive
tests. J Food Engineer, 80: 1086~1095
Bohlmann J, Croteau R (1999). Diversity and variability of
terpenoid defences in conifers: molecular genetics, biochem-
istry and evolution of the terpene synthase gene family in
grand fir (Abies grandis). Novartis Found Symp, 223: 132~140
植物生理学通讯 第 45卷 第 5期,2009年 5月 525
Burke CC, Wildung MR, Croteau R (1999). Geranyl diphosphate
synthase: cloning, expression and characterization of this
prenyltrans ferase as a heterodimer. Proc Natl Acad Sci USA,
96: 13062~13070
Chen XY, Chen Y, Heinstein P, Davisson VJ (1995). Cloning,
expression, and characterization of (+)-δ-cadinene synthase:
a catalyst for cotton phytoalexin biosynthesis. Arch Biochem
Biophys, 324: 255~261
Colby SM, Crock J, Dowdle-Rizzo B, Lemaux PG, Croteau R
(1998). Germacrene C synthase from Lycopersicon esculentum
cv. VFNT Cherry tomato: cDNA isolation, characterization,
and bacterial expression of the multiple product sesquiter-
penecyclase. Proc Natl Acad Sci USA, 95: 2216~2221
Crock J, Wildung M, Croteau R (1997). Isolation and bacterial
expression of a sesquiterpene synthase cDNA clone from
peppermint (Mentha × piperita, L.) that produces the aphid
alarm pheromone E-beta-farnesene. Proc Natl Acad Sci USA,
94: 2833~2840
Diane M, Dorothea T , Jonathan G, Jorg B (2002). Methyl
jasmonate induces traumatic resin ducts, terpenoid resin
biosynthesis, and terpenoid accumulation in developing xy-
lem of norway spruce stems1. Plant Physiol, 129: 1003~1018
Dudareva N, Cseke L, Blanc VM, Pichersky E (1996). Evolution
of floral scent in Clarkia : novel patterns of S-linalool
synthase gene expression in the C. breweri flower. Plant Cell,
8: 1137~1140
Facchini PJ, Chappell J (1992). Gene family for an elicitor-induced
sesquiterpene cyclase in tobacco. Proc Natl Acad Sci USA, 89:
11088~11095
Fujioka T, Kashiwada Y, Kilkuskie RE, Cosentino LM, Ballas L M,
Jiang JB, Janzen WP, Chen IS, Lee KH (1994). Anti-AIDS
agents.11. Betulinic acid and platanic acid as anti-HIV prin-
ciples from Syzigium claviflorum, and the anti-HIV activity
of structurally related triterpenoids. J Nat Prod (Lloydia),
57: 243~247
Hill AM, Cane DE , Mau CJ , West CA (1996). High level expression
of Ricinus communis casbene synthase in Escherichia coli and
characterization of the recombinant enzyme. Arch Biochem
Biophys, 336: 28~33
Hiroaki H, Pengyu H, Ar K, Kenichiro I, Noboru H, Yasumasa I,
Tetsuo K, Masaaki S, Yutaka E (2001). Cloning and charac-
terization of a cDNA encoding b-amyrin synthase involved
in glycyrrhizin and soyasaponin biosyntheses in licorice. Biol
Pharm Bull, 24: 912~916
Hiroaki H, Pengyu H, Satoko T, Megumi O, Kenichiro I, Masaaki
S, Yuta ka E (20 04) . Differentia l expression of three
oxidosqualene cyclase mRNAs in Glycyrrhiza glabra . Biol
Pharm Bull, 27: 1086~1092
Homann V, Mende K, Arntz C, Ilardi V, Macino G, Morelli G, Böse
G, Tudzynski B (1996). The isoprenoid pathway:cloning
and characterization of fungal FPPS genes. Curr Genet, 30:
232~240
Korth KL, Stermer BA, Bhattacharyya MK (1997). HMG-CoA
reductase gene families that differentially accumulate tran-
scripts in potato tubers are developmentally expressed in
floral tissues. Plant Mol Biol, 33: 545~560
Kovalenko LP, Balakshin VV, Presnova GA, Chistyakov AN,
Sh ipa e va E V, A lek s eeva SV, D u r nev AD ( 2 0 0 7 ) .
Immunotoxicity and allergenic properties of betulin-con-
taining birch bark dry extract. Pharmaceutical Chemi J, 41:
18~20
Kushiro T, Shibuya M, Ebizuka Y (1999). Beta-amyrin synthase—
cloning of oxidosqualene cyclase that catalyzes the formation
of the most popular triterpene among higher plants. Tetra-
hedron Lett, 40: 5553~5556
Lange BM, Wildung MR, Stauber EJ, Sanchez C, Pouchnik D,
Croteau R (2000). Probing essential oil biosynthesis and
secretion by functional evaluation of expressed sequence
tags from mint glandular trichomes. Proc Natl Acad Sci USA,
97: 2934~2940
Loguercio LL, Scott HC, Trolinder NL, Wilkins TA (1999). Hmg-
CoA reductase gene family in cotton (Gossypium hirsutum
L.): unique structural features and differential expression of
hmg-potentia lly associ a ted with synthesis of specific
isoprenoids in developing embryos. Plant Cell Physiol, 40:
750~756
Marston A, Hostettman K (1987). Antifungal, molluscicidal and
cytotoxic compounds from plants used in tr adi tional
medicine. In: Hostettmann K, Lea PJ (eds). Biologically
Active Natural Products. Oxford: Oxford University Press,
65~83
Mohammad B, Hirosuke O, Etsuko T, Kazuhiko K, Shigeyuki B,
Kensaku T (2007). Triterpene synthases from the Okinawan
mangrove tribe, Rhizophoraceae. FEBS J, 274: 5028~5042
Morita M, Shibuya M, Kushiro T, Masuda K, Ebizuka Y, Eur J
(2000). Molecular cloning and functional expression of
triterpene synthases from pea (Pisum sativum). Biochemistry,
267: 3453~3460
Newman JD, Chappell J (1999). Isoprenoid biosynthsis in plants:
carbon partit ioning within the cytoplasmic pathway. Crit
Rev Biochem Mol Biol, 34: 95~106
Pisha EH, Chai IL, Chagwedera TE, Farnsworth NR, Cordell GA,
Beecher CW, Fong HH, Kinghorn AD, Brown DM, Wani
MC (1995). Discovery of betulinic acid as a selective inhibi-
tor of human melanoma that functions by induction of
apoptosis. Nat Med, 1: 1046~1051
Rodriguez-Concepcion M, Gruissem W (1999). Arachidonic acid
alters tomato HMG expression and fruit growth and induces
3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase-indepen-
dent lycopene accumulation. Plant Physiol, 119: 41~47
Rosa EC, Marı RH, Juan AV, Fran GA, Llobell EM, Santiago G
(2007). Partial silencing of a hydroxy-methylglutaryl-CoA
reductase-encoding gene in Trichoderma harzianum CECT
2413 results in a lower level of resistance to lovastatin and
lower antifungal activity Fungal. Genet Biol, 44: 269~283
Schuhly W, Heilmaim J, Calls I, Sticher O (1999). New triterpenoids
with antibacterial activity from Zizyphus joozeiro L. J Planter
Med, 65: 740~750
Soler F, Poujade C, Evers M, Carry JC, Henin Y, Bausseau A, Huet
T, Pauwels R, Clercq E, Mayaux JF (1996). Betulinic acid
植物生理学通讯 第 45卷 第 5期,2009年 5月526
derivatives: a new class of specific inhibitors of human
immunodeficiencyvirus type 1 entry. J Med Chem, 39:
1069~1083
Steele JC, Warhurst IC, Kirby GC (1999). In vitro and in
vitaevaluation of betulinic acid as an antimalarial. Phytother
Res, 13: 115~121
Sun IC, Chen CH, Kashiwada Y, Wu JH, Wang HK, Lee KH (2002).
Anti-AIDS agents 49. synthesis, anti-HIV, and anti-fusion
activities of IC9564 analogues based on betulinic acid. J Med
Chem, 45: 4271~4275
Valentina Z, Rosanna S, Sabina C (2002). Selective cytotoxicit of
betulinic acid on tumor cell lines but not on normal cells.
Cancer lette, 175: 17~22
Wildung MR, Croteau R (1996). A cDNA clone for taxadiene
synthase , the diterpene cyclase that catalyzes the commit-
ted step of taxol biosynthesis. J Biol Chem, 271: 9201~9211
Zhang H, Shibuya M, Yokota S, Ebizuka Y (2003). Oxidosqualene
cyclases from cell suspension cultures of Betula platyphylla
var. japonica: molecular evolution of oxidosqualene cyclases
in higher plants. Biol Pharm Bull, 26: 642~650
Zhukova N A, Semenov DE, Sorokina IV, Tolst ikova TG,
Pozdnyakova SV, Grek OR (2005). Effect of betulonic acid
a nd i t s der iva t ive [3 -oxo-2 0 (2 9 ) -lu pene-28 -oyl ] -3 -
Aminopropionic acid on liver structure in mice with RLS
lymphoma. Biol Pharm Bull, 9: 348~351