全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (6): 797~805　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0044 797
收稿 2015-01-19　　修定 2015-05-12
资助 “973”计划前期研究专项(2014CB160306)、重庆市教委创
新团队建设基金(KJTD201307)和重庆师范大学引进人才
启动基金项目(12XLR36)。
* 通讯作者(E-mail: hanmazhang@126.com; Tel: 023-65912976)。
植物组织特异性基因表达技术及其应用
方彦昊, 南文斌, 梁永书, 张汉马
重庆师范大学生命科学学院, 重庆市植物环境适应分子生物学重庆重点实验室, 重庆 401331
摘要: 研究表明在植物以及其它多细胞生物体中, 有些基因只在生长发育的特定阶段、器官、组织或细胞中表达。对这类
基因的研究一方面有助于我们了解该基因自身的功能, 另一方面也可以作为工具应用到其他相关研究当中, 例如利用植物
中具特异表达特性的基因的调控元件将特定基因在特定器官、组织或细胞中表达的技术, 即植物组织特异性基因表达技
术。本文主要介绍目前被广泛使用的两种植物组织特异性基因表达技术, 即组织特异性启动子驱动法和GAL4/UAS激活
标签法及其应用, 为今后的研究工作提供一定的参考。
关键词: 基因; 启动子; 组织特异性; GAL4/UAS
Plant Tissue-Specific Gene Expression System and Its Applications
FANG Yan-Hao, NAN Wen-Bin, LIANG Yong-Shu, ZHANG Han-Ma*
Chongqing Key Laboratory of Molecular Biology of Plants Environmental Adaptations, College of Life Sciences, Chongqing Nor-
mal University, Chongqing 401331, China
Abstract: It is known that, in plants as well as in all other multicellular organisms, there are genes that are only
expressed at specific developmental stage, organs, tissues or cells. The research on those genes not only can
help us to understand their functions, but also can provide valuable tools for other studies, such as developing
plant tissue-specific expression systems using the regulatory elements of tissue-specifically expressed genes. In
this review, we provided a brief overview of two currently wildly used methods for achieving tissue-specific
expression of genes in plants, i.e. tissue-specific promoters or GAL4/UAS activation tagging method, and some
examples of their applications. This brief review was intended to provide guidance to future research in this im-
portant field.
Key words: gene; promoter; tissue-specific; GAL4/UAS
多细胞生物体内存在不同类型的器官、组
织、细胞, 它们有各自的特性, 担负着不同的功
能。例如, 植物根表皮中的根毛细胞, 主要负责从
周围土壤中吸收水分与矿质营养。与这一功能相
适应, 它们在发育过程中向外突起形成管状结构
以增加其表面积和吸收水分、养分的能力(Grier-
son和Schiefelbein 2002); 植物根里的内皮层细胞在
发育过程中通过特殊的细胞壁加厚和特定部位胼
胝质的沉积形成“凯氏带”, 阻止矿质养分向维管束
和地上部分渗透, 控制皮层和维管柱之间的物质
运输; 在茎和叶片中, 保卫细胞可以调节内部叶肉
细胞与外部环境之间的气体交换, 这一过程需要
依赖周围细胞通过K离子交换来创造一个调节气
孔关闭与打开的膨压(Raschke和Fellows 1971)。这
些不同类型器官、组织、细胞的形成, 以及它们
之间功能的差异, 在很大程度上取决于特异性表
达的基因。因此, 研究不同器官、组织、细胞中
呈特异性表达的基因, 对了解植物生长发育调控机
理, 细胞类型与功能之间的关系都有重要意义。
此外, 研究组织特异性表达的基因的调控机
理, 可帮助我们构建植物组织特异性表达体系, 有
目的地在特定器官、组织、细胞中表达特定靶基
因, 以便进行靶基因功能分析。组织特异性表达
技术在植物基因工程中具有一定的应用前景, 如
利用植物的特定组织细胞合成所需要的代谢产物,
综　述 Reviews
植物生理学报798
还可以用于作物改良的基因工程等。组织特异性
表达技术是近年来植物学研究中的一个重要领域
(Ubeda-Tomas等2008; Plett等2010; Duan等2013)。
本文主要介绍目前被广泛使用的两种植物组织特
异性基因表达方法, 即特定启动子驱动法和GAL4/
UAS激活标签法。
1 组织特异性启动子驱动法
1.1 植物组织特异性启动子
启动子是一段位于功能基因5端上游的DNA
序列, 包含特定的保守序列, 长度因基因而异。启
动子上的多种顺式作用元件能识别RNA聚合酶,
并指导相应类型的RNA聚合酶与模板正确结合,
形成转录起始复合体, 控制转录的时空特性和强
度, 从而精确有效地启动基因的表达。有些启动
子, 如花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子(Odell等
1985)、水稻Actin1基因的Act1启动子(McElroy等1990)
和玉米Ubiquitin基因的Ubi启动子(Christensen等
1992)等, 其调控的基因不受时空及外界因素的影
响, 几乎在植物所有组织都有表达, 而且表达水平
在不同组织部位没有明显差异, 被称之为组成型
启动子或非特异性表达启动子。
组织特异性启动子, 又称为器官特异性启动
子或细胞特异性启动子, 则不同于组成型启动子,
其所控制的基因只在或主要在特定的组织中表
达。除具有一般启动子的特性外, 组织特异启动
子还具有一些调控目的基因特异表达的调控元件,
这些调控元件的位置、数目、种类决定了目的基
因表达的时空专一性 , 是基因特异表达所必需
的。因此, 组织特异型启动子已成为转基因研究
中常用的外源基因的启动元件。
目前研究人员已经在不同植物中分离并证实
了多种具有组织表达特异性的启动子, 按照其驱
动基因的表达部位, 可分为植物营养器官, 如根、
块茎、维管组织和茎叶绿色组织等表达的组织特
异性启动子, 植物生殖器官如花器、果实和种子
表达的组织特异性启动子(表1)。根据调控的组织
特异性基因表达模式是否受光、热等条件的诱导,
又可分为可诱导和无需诱导的组织特异性启动子,
比如水稻绿色组织特异表达的Rca基因和LP2基因
的启动子要受到光的诱导(Thilmony等2009; Yang
等2012)。研究人员也发现, 许多植物的内含子也
有调控基因时空表达的作用, 例如拟南芥花同源
基因AGAMOUS中内含子中有增强子序列, 它和该
基因在花器官中的特异区域表达相关(Busch等
1999)。水稻OsTubA1基因由4个外显子和3个内含
子组成, 在不同的组织如根尖、幼叶和花中有表
达 , 而这一表达模式需要第一个内含子的调控
(Jeong等2000)。矮牵牛花PhADF1基因中第1个内
含子会增强其在维管组织的特异性高表达, 后来
研究证明, 这一内含子改变PhADF1基因组织特异
表1 植物中一些具有组织特异性的启动子
Table 1 Some tissue-specific promoter in plant
启动子 植物 表达组织 参考文献
rbcS-3A 豌豆(Pisum sativum) 叶 Gilmartin和Chua 1990
PDX1 (GSE1) 水稻(Oryza sativa) 叶片、叶鞘和穗茎 Ye等2012
PDX1 (GSE2) 水稻(Oryza sativa) 叶鞘和茎 Ye等2012
LAT52 番茄(Lycopersicon esculentum) 花粉 Twell等1989
SK2 土豆(Solanum tuberosum) 雌蕊 Ficker等1997
ZmC5 玉米(Zea mays) 花粉 Wakeley等1998
PsTL1 梨 (Pyrus serotina) 雌蕊 Sassa等2002
LlCCR 合欢(Leucaena leucocephala) 维管组织 Prashant等2012
GhACT1 棉花(Gossypium hirsutum) 纤维细胞 Li等2005
napA 油菜 (Brassica napus) 胚、胚乳 Ellerstrom等1996
csp1 咖啡(Coffea arabica) 种子 Marraccini等1999
Alpha-globulin 棉花(Gossypium hirsutum) 种子 Sunilkumar等2002
gbssl 小麦(Triticum aestivum) 种子 Kluth等2002
zE19 玉米(Zea mays) 种子(胚乳) Chen等2007
RCc3 水稻(Oryza sativa) 根 Xu等1995
Pyk10 拟南芥(Arabidopsis thaliana) 根 Nitz等2001
方彦昊等: 植物组织特异性基因表达技术及其应用 799
性表达的过程是一种转录后调控机制, 而且进化
比较保守(Mun等2002; Jeong等2007)。
1.2 植物组织特异性启动子的一般研究方法
研究植物的启动子一般采用如下手段, 首先
通过PCR扩增法, 从植物基因组中扩增已知全部或
部分序列的启动子片段, 然后通过PLACE (Higo等
1999)和PLANTCARE (Lescot等2002)网站, 对得到
的启动子片段进行生物信息学分析, 预测启动子
的核心结构和功能, 并在启动子片段的后面融合
GUS和GFP等报告基因, 通过瞬时和稳定的转化,
对启动子的表达模式进行分析, 最后通过点突变、
片段缺失等分析, 得到该启动子的核心调控元件
(Ellerstrom等1996; Li等2005; Konishi和Yanagisawa
2010)。
cDNA微阵列的数据给开发新的启动子提供
了有利条件。Ye等(2012)人利用水稻cDNA微阵列
数据库CREP (Collection of Rice Expression Profiles,
http://crep.ncpgr.cn), 鉴定得到一个只在绿色组织
中特异表达的基因, 与水稻基因组数据库中数据进
行序列比对发现, 该基因编码一个蛋白DX1。RT-
PCR分析表明, DX1确实是在叶、叶鞘、茎和穗茎
中表达, 而在根、花药和胚乳中都没有表达。通
过将编码区上游1 505 bp和下游558 bp序列作为该
基因的候选启动子, 并提交到PlantCARE网站与已
有数据进行比较分析, 采用片段缺失分析和凝胶
阻滞实验EMSA (Electrophoretic Mobility Shift As-
say), 得到位于–71至–61的序列5 CAGGACATATT
3 (GSE1)和位于+1至+86的5 ATGAACTCAAA-
GAGCC 3 (GSE2)的2个绿色组织特异的顺式调控
元件。点突变分析表明这两个顺式调控元件都是
正调控因子。
近些年来, 由于基因组、转录组学技术和测
序技术的快速发展, 使得大规模预测启动子序列
和找到发挥作用的调控原件变得可行。Verelst等
人(2007)通过分析拟南芥花粉的4个发育阶段中不
同组织的ATH1基因芯片结果, 找到了很多花粉特
异表达的基因, 启动子分析发现约22.9%的TCP-
MPG类基因启动子中含有一个MEF2基序。差异
基因表达也常被用来研究组织特异的启动子, 通
过cDNA-AFLP (cDNA扩增长度多态性), 得到具有
差异表达的转录片段, 通过这种方法, 在马铃薯中
得到了一个具有在块茎和匍匐茎等茎组织特异表
达的StCCS启动子(Trinade等2003)。转录组测序也
有助于非模式物种的差异基因表达研究, Geng等
(2014)通过在花生中建立一个基于高通量测序的
筛选系统, 获得584条根特异和316条种子特异表
达的基因片段, 其中的55.3%和64.6%经半定量RT-
PCR验证为组织特异表达基因, 并从中分离鉴定了
一个根特异表达的启动子Asy。
1.3 植物组织特异性启动子的应用
目前, 植物基因工程中使用的多是组成型启
动子, 其中CaMV 35S启动子主要用于双子叶植物
的遗传转化, Ubi启动子主要用于单子叶植物的遗
传转化。虽然这类启动子驱动的基因在转基因植
物的不同组织、不同生长阶段均有高水平表达
(Ranjan等2011; Park等2012), 也易于构建目的基因
过表达的载体, 但在应用中逐渐暴露出一些问题
和局限性。例如, 组成型的启动子不能用于研究
不同类型细胞和组织的功能, 而且靶基因在发育
过程的错误时间和错误空间过量表达有时会对植
物生长发育产生影响(Potenza等2004)。组成型的
基因表达可能会造成转基因植物生长延缓, 开花
延迟, 减产, 品质降低, 甚至不育等现象(Kasuga等
1999和2004; Pino等2007)。此外, 在同一个植物中
重复使用同一个组成型启动子驱动多个不同基
因表达容易造成基因沉默现象(Palauqui等1996;
Vaucheret等1998; Galili和Hofgen 2002; Lessard等
2002)。
组织特异性启动子则可克服上述缺点, 它们
可以驱动外源基因在植物发育过程中某一特定的
时空表达, 使目的基因的表达产物在特定细胞或
组织中积累(Jeong等2010)。伸展作用因子(expan-
sin)是调控植物生长过程中细胞壁伸长的主要调
节因子。在烟草中用拟南芥根系特异表达的启动
子Pyk10 (Nitz等2001)驱动β型伸展基因TaEXPB23,
不仅增加了侧根的数目, 而且与35S组成型启动子
表达该基因的植株和野生型相比, 根系生物量明
显提高; 在缺水胁迫条件下, 与野生型相比, 根系
特异表达该基因的植株光合速率增加, 积累的活
性氧(reactive oxygen species, ROS)更少, 具有较高
水平的抗氧化酶的活性, 使转基因植株的抗胁迫
能力提高(Li等2015)。植物发达的根系会增加其
植物生理学报800
抗胁迫能力。水稻根系特异表达的RCc3启动子的
分离给提高作物抗胁迫能力和作物产量提供了有
效工具(Xu等1995)。Jeong等(2010)用RCc3启动子
驱动水稻受干旱、高盐和脱落酸等胁迫诱导表达
的OsNAC10基因, 使其在根中过量表达, 转基因水
稻根直径是非转基因水稻的1.25倍, 根的中柱、皮
层和表皮都变大; 在干旱胁迫和正常条件下, 水稻
产量与野生型相比都有不同程度的提高。
油菜是世界上广泛种植的油料作物, 含有高
不饱和的C18脂肪酸和低芥酸, 具有很高的营养价
值。Ellerstrom等(1996)从油菜中分离得到一个只
在胚和胚乳特异表达的启动子napA。利用napA驱
动调控不饱和脂肪酸合成的LEC1和L1L基因, 使它
们在种子中特异表达, 转基因植株种子含油量提
高2%~20%, 但油分品质没有发生明显改变, 也没
有影响其他主要的农业性状, 而且这些改良与作
物生长条件无关(Tan等2011)。
木质素是一类酚类次生代谢产物, 在植物体
内行使重要的生理功能, 但对于造纸工业而言是
有害成分, 必须从木纤维中去除, 木材中的木质素
是形成造纸污染的主要来源。编码咖啡酸酸-O-甲
基转移酶(caffeic acid O-methyl-transferase, COMT)
相关基因的克隆, 使研究者可以下调杨树中COMT
的含量, 通过RNAi可以减少转基因杨树中约90%
COMT活性, 木质素的含量没有受到影响, 但使木
质素的结构发生明显变化, 转基因杨树更加适用于
纸浆工业(Lapierre等1999)。在烟草中用组成型启动
子35S表达木质素合成途径相关基因肉桂酰辅酶A
还原酶(cinnamoyl-CoA reductase, CCR)反义基因
虽然可以下调CCR基因的表达, 减少木质素的含
量, 但也会影响整个植株的生长发育, 出现延迟生
长, 皱叶等表型; 为了克服这样的困难, 用维管组
织特异表达的启动子LlCCR和LlCAD可能会避免
对整个植株造成的伤害, 从而实现特异性地降低
木材中木质素的含量, 减少造纸工业中为去除木质
素而消耗的能源和化学原料(Prashant等2011,
2012)。
2 GAL4/UAS激活标签法
2.1 GAL4/UAS系统简介
GAL4/UAS双因子反式激活体系介导的基因
异位表达可实现转基因的空间控制, 加上适当的
修饰可以实现时空双重控制。Brand和Perrimon
(1993)首次在果蝇中构建GAL4/UAS体系, 建立了
一个可将任何外源基因以果蝇自身细胞或组织特
异的方式被选择性激活表达的系统, 并利用该系
统来研究果蝇even-skipped蛋白的功能。Guyer等
(1998)将修饰过的GAL4/UAS系统GAL4/C1首次
运用到双子叶模式植物拟南芥中, 在植物中建立
了GAL4/UAS外源基因异位表达系统(图1)。
GAL4/UAS是由酵母的GAL4基因和GAL4基
因的上游激活因子序列UAS两部分组成。GAL4/
UAS系统的建立, 首先需要将GAL4基因与组织特
异性的启动子或增强子相连接, 建立以细胞和组
织特异性的方式调控表达的GAL4转基因系; 同时
将UAS与感兴趣的靶基因融合, 建立带有UAS-靶
基因的转基因系。在UAS-靶基因转基因系中, 靶
图1 GAL4/UAS系统原理示意图
Fig.1 The schematic of GAL4/UAS system
方彦昊等: 植物组织特异性基因表达技术及其应用 801
基因只需和UAS序列相连接, 不再需要特定的启
动子。因为GAL4蛋白只能与UAS相结合之后才
能调控GAL4基因的表达, 所以只有将2个转基因
系进行杂交, 在杂交后代中, 特异性表达的GAL4
才能以同样的方式调节UAS-靶基因的表达(Brand
和Perrimon 1993)。
为了便于检测GAL4/UAS系统杂交子代中靶
基因表达的位置, 通常采用的方式为运用GUS和
GFP等报告基因建立UAS-靶基因-报告基因, 将靶
基因的编码区域与报告基因融合, 整合到宿主的
基因组中; 此UAS转基因系与GAL4系杂交后, 子
代中报告基因由于GAL4与UAS的结合, 伴随着靶
基因开始表达, 通过检测报告基因在不同细胞中
的活性, 就可方便地对靶基因的表达模式进行更
为准确的分析, 再对其表达产生的生物学效应做
进一步的研究(Wu等2003)。此外, 为了方便在建
立的GAL4系亲本中提前检测GAL4在不同细胞组
织中的表达 , 可将报告基因GUS或GFP融合到
GAL4片段后, 随着GAL4随机的插入受体植物基
因组中, 由于和它邻近的基因表达位置的不同, 就
可以得到标记了绿色荧光蛋白的表达GAL4基因
的株系(Laplaze等2005)。
2.2 植物GAL4/UAS体系的建立
2.2.1 拟南芥中GAL4/UAS体系构建及应用
Haseloff (1999)发现由于GAL4序列中存在高
A/T含量, 这些序列会影响植物中mRNA的加工,
使GAL4不能在拟南芥中表达。为了解决这一问
题, 他们用VP16代替GAL4中的激活部位, 建立了
一个高A/U含量的GAL4-VP16体系, 使得其在植物
前mRNA拼接过程中起到很好的识别内含子的作
用, 从而在拟南芥中高效表达。GAL4-VP16随机插
入到拟南芥基因组中, 其表达依赖于与它邻近的
基因增强子序列。为了检测GAL4-VP16的表达, 他
们还将mGFP5基因融合到这段插入片段中, 由于
和它邻近的基因表达位置的不同, 这样就得到标
记了绿色荧光蛋白的表达GAL4基因的不同细
胞。在这些细胞中, 筛选收集到了250株只在拟南
芥根尖不同细胞中稳定表达的GAL4株系(图2)。
后续研究者可以将感兴趣的目标基因融合到UAS
编码框后 , 得到UAS-目标基因系 , 通过与这些
GAL4-VP16系杂交, 或者用UAS-目标基因农杆菌,
直接转化GAL4-VP16系, 获得在根尖不同细胞中
稳定表达目的基因的子代, 有利于更精确地研究
目的基因的功能。
图2 拟南芥根尖组织特异表达的GAL4/UAS株系
Fig.2 Tissue-specific GAL4/UAS lines in Arabidopsis root tip
根据Duan等(2013)文献修改。
植物生理学报802
除上述最初筛选到的250个株系外, 其他研究
者还从Haseloff等建立的GAL4-VP16株系中筛选
到了新的组织特异性表达株系, 如Laplaze等(2005)
筛选得到401株在侧根不同发育阶段特异性表达
的株系; Gardner等(2009)筛选得到了4株在气孔保
卫细胞特异表达的株系, 并发现其中大部分只在
气孔保卫细胞表达, 且其表达特异性不受外界环
境变化。
这些制备并经过验证的细胞和组织特异表达
的GAL4-VP16株系为研究植物信号传导及其作用
机制提供了有效工具。赤霉素(gibberellin, GA)可
以通过促进拟南芥根中细胞的有丝分裂来调节分
生组织大小, 进而调控根细胞的伸长, 维持根生
长。为了确定GA是通过分生区中哪些细胞来控制
根细胞的增殖, Ubeda-Tomas等(2008, 2009)利用上
述Haseloff等建立的在不同根组织中表达的GAL4-
VP16株系, 包括J0571 (在皮层和内皮层表达)、
Q2500 (内皮层)、J0631 (根伸长区)和J2341 (根柱
干细胞), 使突变基因GAI在这些组织中特异性表
达, 结果发现在柱干细胞和伸长区细胞中表达GAI
后, 分生组织大小与野生型一样; 而在皮层或内皮
层中表达GAI则导致分生组织明显变小, 从而说明
GA是通过促进内胚层中细胞的增殖来控制根分生
组织的大小, 控制根的生长。同样Duan等(2013)利
用Haseloff等建立的株系研究高盐胁迫对拟南芥幼
苗侧根的抑制作用中的细胞特异性。他们在前期
研究中发现ABA参与这一抑制作用。为了验证
ABA的这一调控是否具有组织特异性, 作者首先
利用上述Haseloff等建立的在不同根细胞中表达的
GAL4/UAS株系, 特异表达能引起ABA不敏感的突
变基因abi1-1, 发现在这一调控中ABA信号传导主
要在内皮层和皮层; 然后他们进一步利用内皮层
和皮层特异表达的启动子, 锁定了内皮层为ABA
信号传导的关键场所。
Haseloff等建立的组织特异性表达株系也被
用来研究植物对环境因子的响应机理。如Moller
等(2009)利用在拟南芥根中细胞特异性表达的
GAL4/UAS株系研究钠离子转运蛋白的组织特异
性表达对植物抗盐性的影响。作者选用两种在根
和中柱中稳定表达的GAL4株系, J2731 (只在主根
和侧根的中柱鞘表达)和E2586 (在主根和侧根的
维管柱和中柱表达), 使HKT基因在这些细胞中特
异表达。发现在根中柱细胞中表达HKT1.1会增强
钠离子流入的能力, 减少钠离子从根中到茎中的
转移, 并导致茎中钠离子浓度降低, 使植物的抗盐
能力增强。Plett等(2010)用在表皮和皮质细胞层
特异表达的GAL4株系发现在拟南芥根表皮和皮
层特异表达HKT1.1会增加茎中钠离子的积累。
2.2.2 水稻GAL4/UAS体系构建及应用
Wu等(2003)在水稻‘中花11’和‘中花15’中建
立了GAL4-VP16/UAS体系, 将经过修饰的GUS报
告基因(GUS Pluse)放在6×UAS启动子上, 用来检
测基因在不同位置的表达, 得到了约31 443株F1代
有GUS标记的单株(表2)。通过用GAL4/VP16编码
区的引物进行PCR扩增和GAL4/VP16特异探针进
行核酸杂交验证 , 大部分F 1代GAL4株系都有
T-DNA插入, 其中约有一半为单拷贝插入。
由于GUS标记需要经过组织化学染色、固定
等步骤才能确定表达位置。Johnson等(2005)以
GFP为报告基因, 得到具有不同表达强度的GFP转
化株, 在水稻中建立了一个可快速、跟踪检测的
GLA4/UAS系统。Plett等(2010)利用Johnson等人
建立的水稻GAL4-GFP系统中在木质和皮层有
GFP特异表达的AGF03和AOHB03株系, 将拟南芥
HKT1.1基因在这些GAL4系中特异表达。发现当
表2 水稻组织特异表达的GAL4/UAS株系及GUS表达模式
Table 2 Examples of GUS staining patterns in tissue-specific
GAL4/UAS lines of rice
GAL4株系 GUS表达区间
a101/f856 雌蕊
a130 外稃和颖片的尖
a137 茎结、雄蕊、雌蕊、花序
a140/f2271 雄蕊和雌蕊除外的结构
a171 茎节间、叶鞘
a201/f2080 花药
f1381 茎结、外稃和颖片的尖
f1478 外稃和颖片
F1951 穗颈节、叶、外稃和颖片
F2000 叶
f2257 茎结、雌蕊、茎节间、外稃和颖片
f2439 叶耳
f2471 穗颈节、雄蕊、雌蕊、叶耳
　　参考Wu等(2003)文献修改。
方彦昊等: 植物组织特异性基因表达技术及其应用 803
用盐胁迫处理时, 与对照相比, 水稻皮层中特异表
达HKT1.1的转化株(AOHB03)干重明显增加, 根中
钠离子增加, 茎中钠离子浓度变低; 而木质部中
HKT1.1的特异表达转化株(ASGF03)干重减轻, 茎
中钠离子浓度升高, 而根中降低。这些结果与在
拟南芥中得到的结果相同, 说明钠离子在特定细
胞中的转运与植物抗盐性间的关系在拟南芥和水
稻中非常相似。可见组织特异性表达这一研究工
具在粮食作物的重要农艺性状研究中具有广阔的
应用前景。
3 讨论与展望
虽然现在已经分离得到了许多细胞或组织特
异的启动子, 但对于多细胞和组织器官复杂的高
等植物来说, 还是远远不够的, 而且启动子具有物
种特异性, 在不同物种中其驱动的基因表达位置
可能存在差异。目前, 由于转录组、蛋白质组和
基因组测序技术的发展, 给分离更多的特异性启
动子提供大量数据, 尤其是转录组数据的分析可
以帮助我们更快的认识基因在时间和空间的表达
模式, 进而开发更多新的有用的特异性启动子(Po-
tenza等2004; Shelenkov和Korotkov 2009), 实现对
外源基因表达的定时、定点、定量三维精确调控,
使其在可控条件下为基础研究和作物性状改良创
造更多可能(Jeong等2010; Ye等2013; Li等2015)。
由于GAL4-UAS系统在建立时GAL4基因是
随机插入基因组的, 这就使它存在不可避免的缺
点: (1)单一株系在多个不同细胞和组织中都有目
的基因的表达; (2)这种多细胞表达的组合是随机
的, 强弱不同, 不是研究想要的组合; (3)得到的不
同组织特异的GAL4群体可能不能完全包含研究
所需要的全部细胞类型。因此, 在研究特定基因
的功能或信号响应和应答的特异组织定位时, 不
仅需要筛选分离和验证更多细胞或组织特异的启
动子, 建立和扩大组织特异的GAL4/UAS群体, 优
化得到有规律或实验所需的细胞表达组合, 还要
将组织特异的启动子和GAL4/UAS株系结合起来,
利用各自特点先通过在多个不同细胞和组织中都
有目的基因表达的GAL4/UAS株系, 将信号响应目
标细胞定位到很小的区间(一到两种细胞类型), 再
通过已知的细胞特异的启动子驱动目的基因在其
表达, 最终将响应特定信号的细胞类型确定下来。
目前文献中报道和广泛使用的GAL4/UAS系
统大多是以果蝇(Brand和Perrimon 1993)、老鼠
(Mallo 2006)、斑马鱼(Halpern等2008)、拟南芥
(Haseloff 1999)和水稻(Wu等2003)等模式生物建立
的, 主要用于研究特定基因的功能或者信号响应
的特异组织定位, 或者在特定细胞或组织中表达
致死的基因, 达到切除靶细胞的作用(Brand和Per-
rimon 1993)。随着测序技术和遗传转化技术的进
步, 使得GAL4/UAS技术日益成熟, 我们有望在更
多的动植物中建立这种细胞和组织特异表达的库,
用于改良作物的产量和品质, 疾病治疗等。
参考文献
Brand AH, Perrimon N (1993). Targeted gene expression as a means
of altering cell fates and generating dominant phenotypes. De-
velopment, 118: 401~415
Busch MA, Bomblies K, Weigel D (1999). Activation of a floral
homeotic gene in Arabidopsis. Science, 285: 585~587
Chen X, Wang Z, Wang J, Wang M, Zhao L, Wang G (2007). Isolation
and characterization of Brittle2 promoter from Zea Mays and its
comparison with Ze19 promoter in transgenic tobacco plants.
Plant Cell Tiss Org, 88: 11~20
Christensen AH, Sharrock RA, Quail PH (1992). Maize polyubiquitin
genes: structure, thermal perturbation of expression and tran-
script splicing, and promoter activity following transfer to proto-
plasts by electroporation. Plant Mol Biol, 18: 675~689
Duan L, Dietrich D, Ng CH, Chan PM, Bhalerao R, Bennett MJ,
Dinneny JR (2013). Endodermal ABA signaling promotes lateral
root quiescence during salt stress in Arabidopsis seedlings. Plant
Cell, 25: 324~341
Ellerstrom M, Stalberg K, Ezcurra I, Rask L (1996). Functional dis-
section of a napin gene promoter: identification of promoter ele-
ments required for embryo and endosperm-specific transcription.
Plant Mol Biol, 32: 1019~1027
Ficker M, Wemmer T, Thompson RD (1997). A promoter directing
high level expression in pistils of transgenic plants. Plant Mol
Biol, 35: 425~431
Galili G, Hofgen R (2002). Metabolic engineering of amino acids and
storage proteins in plants. Metab Eng, 4: 3~11
Gardner MJ, Baker AJ, Assie JM, Poethig RS, Haseloff JP, Webb AA
(2009). GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal
guard cell development and gene expression. J Exp Bot, 60:
213~226
Geng L, Duan X, Liang C, Shu C, Song F, Zhang J (2014). Mining
tissue-specific contigs from peanut (Arachis hypogaea L.) for
promoter cloning by deep transcriptome sequencing. Plant Cell
Physiol, 55: 1793~1801
Gilmartin PM, Chua NH (1990). Spacing between GT-1 binding sites
within a light-responsive element is critical for transcriptional
activity. Plant Cell, 2: 447~455
植物生理学报804
Grierson C, Schiefelbein J (2002). Root hairs. The Arabidopsis Book,
1: e0060
Guyer D, Tuttle A, Rouse S, Volrath S, Johnson M, Potter S, Gorlach
J, Goff S, Crossland L, Ward E (1998). Activation of latent trans-
genes in Arabidopsis using a hybrid transcription factor. Genet-
ics, 149: 633~639
Halpern ME, Rhee J, Goll MG, Akitake CM, Parsons M, Leach SD
(2008). Gal4/UAS transgenic tools and their application to ze-
brafish. Zebrafish, 5: 97~110
Haseloff J (1999). GFP variants for multispectral imaging of living
cells. Method Cell Biol, 58: 139~151
Higo K, Ugawa Y, Iwamoto M, Korenaga T (1999). Plant cis-acting
regulatory DNA elements (PLACE) database: 1999. Nucleic Ac-
ids Res, 27: 297~300
Jeon JS, Lee S, Jung KH, Jun SH, Kim C, An G (2000). Tissue-prefer-
ential expression of a rice alpha-tubulin gene, OsTubA1, mediat-
ed by the first intron. Plant Physiol, 123: 1005~1014
Jeong JS, Kim YS, Baek KH, Jung H, Ha SH, Do CY, Kim M, Re-
uzeau C, Kim JK (2010). Root-specific expression of OsNAC10
improves drought tolerance and grain yield in rice under field
drought conditions. Plant Physiol, 153: 185~197
Jeong YM, Mun JH, Kim H, Lee SY, Kim SG (2007). An upstream
region in the first intron of petunia actin-depolymerizing factor 1
affects tissue-specific expression in transgenic Arabidopsis (Ara-
bidopsis thaliana). Plant J, 50: 230~239
Johnson AA, Hibberd JM, Gay C, Essah PA, Haseloff J, Tester M,
Guiderdoni E (2005). Spatial control of transgene expression in
rice (Oryza sativa L.) using the GAL4 enhancer trapping system.
Plant J, 41: 779~789
Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K
(1999). Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by
gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nat
Biotechnol, 17: 287~291
Kasuga M, Miura S, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2004).
A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress-in-
ducible rd29A promoter improved drought- and low-temperature
stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiol,
45: 346~350
Kluth A, Sprunck S, Becker D, Lorz H, Lutticke S (2002). 5 deletion
of a gbss1 promoter region from wheat leads to changes in tissue
and developmental specificities. Plant Mol Biol, 49: 669~682
Konishi M, Yanagisawa S (2010). Identification of a nitrate-responsive
cis-element in the Arabidopsis NIR1 promoter defines the pres-
ence of multiple cis-regulatory elements for nitrogen response.
Plant J, 63: 269~282
Lapierre C, Pollet B, Petit-Conil M, Toval G, Romero J, Pilate G, Lep-
le JC, Boerjan W, Ferret VV, De Nadai V et al (1999). Structural
alterations of lignins in transgenic poplars with depressed cin-
namyl alcohol dehydrogenase or caffeic acid O-methyltransferase
activity have an opposite impact on the efficiency of industrial
kraft pulping. Plant Physiol, 119: 153~164
Laplaze L, Parizot B, Baker A, Ricaud L, Martiniere A, Auguy F,
Franche C, Nussaume L, Bogusz D, Haseloff J (2005). GAL4-
GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root
development in Arabidopsis thaliana. J Exp Bot, 56: 2433~2442
Lescot M, Dehais P, Thijs G, Marchal K, Moreau Y, Van de Peer Y,
Rouze P, Rombauts S (2002). PlantCARE, a database of plant
cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico
analysis of promoter sequences. Nucleic Acids Res, 30: 325~327
Lessard PA, Kulaveerasingam H, York GM, Strong A, Sinskey AJ
(2002). Manipulating gene expression for the metabolic engi-
neering of plants. Metab Eng, 4: 67~79
Li AX, Han YY, Wang X, Chen YH, Zhao MR, Zhou S, Wang W
(2015). Root-specific expression of wheat expansin gene TaEX-
PB23 enhances root growth and water stress tolerance in tobac-
co. Environ Exp Bot, 110: 73~84
Li XB, Fan XP, Wang XL, Cai L, Yang WC (2005). The cotton AC-
TIN1 gene is functionally expressed in fibers and participates in
fiber elongation. Plant Cell, 17: 859~875
Mallo M (2006). Controlled gene activation and inactivation in the
mouse. Front Biosci, 11: 313~327
Marraccini P, Deshayes A, Pétiard V, Rogers WJ (1999). Molecular
cloning of the complete 11S seed storage protein gene of Coffea
arabica and promoter analysis in transgenic tobacco plants. Plant
Physiol Bioch, 37: 273~282
McElroy D, Zhang W, Cao J, Wu R (1990). Isolation of an efficient
actin promoter for use in rice transformation. Plant Cell, 2:
163~171
Moller IS, Gilliham M, Jha D, Mayo GM, Roy SJ, Coates JC, Hasel-
off J, Tester M (2009). Shoot Na+ exclusion and increased salin-
ity tolerance engineered by cell type-specific alteration of Na+
transport in Arabidopsis. Plant Cell, 21: 2163~2178
Mun JH, Lee SY, Yu HJ, Jeong YM, Shin MY, Kim H, Lee I, Kim SG
(2002) Petunia actin-depolymerizing factor is mainly accumulat-
ed in vascular tissue and its gene expression is enhanced by the
first intron. Gene, 292: 233~243
Nitz I, Berkefeld H, Puzio PS, Grundler FM (2001). Pyk10, a seedling
and root specific gene and promoter from Arabidopsis thaliana.
Plant Sci, 161: 337~346
Odell JT, Nagy F, Chua NH (1985). Identification of DNA sequences
required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promot-
er. Nature, 313: 810~812
Palauqui JC, Elmayan T, De Borne FD, Crete P, Charles C, Vaucheret
H (1996). Frequencies, timing, and spatial patterns of co-sup-
pression of nitrate reductase and nitrite reductase in transgenic
tobacco plants. Plant Physiol, 112: 1447~1456
Park SH, Bang SW, Jeong JS, Jung H, Redillas MC, Kim HI, Lee
KH, Kim YS, Kim JK (2012). Analysis of the APX, PGD1 and
R1G1B constitutive gene promoters in various organs over three
homozygous generations of transgenic rice plants. Planta, 235:
1397~1408
Pino MT, Skinner JS, Park EJ, Jeknic Z, Hayes PM, Thomashow MF,
Chen TH (2007). Use of a stress inducible promoter to drive
ectopic AtCBF expression improves potato freezing tolerance
while minimizing negative effects on tuber yield. Plant Biotech-
nol J, 5: 591~604
Plett D, Safwat G, Gilliham M, Skrumsager MI, Roy S, Shirley N, Ja-
cobs A, Johnson A, Tester M (2010). Improved salinity tolerance
方彦昊等: 植物组织特异性基因表达技术及其应用 805
of rice through cell type-specific expression of AtHKT1;1. PLoS
ONE, 5: e12571
Potenza C, Aleman L, Sengupta-Gopalan C (2004). Targeting trans-
gene expression in research, agricultural, and environmental ap-
plications: promoters used in plant transformation. In Vitro Cell
Dev-Pl, 40: 1~22
Prashant S, Srilakshmi SM, Pramod S, Gupta RK, Anil KS, Rao KS,
Rawal SK, Kavi KP (2011). Down-regulation of Leucaena leu-
cocephala cinnamoyl CoA reductase (LlCCR) gene induces sig-
nificant changes in phenotype, soluble phenolic pools and lignin
in transgenic tobacco. Plant Cell Rep, 30: 2215~2231
Prashant S, Sunita MSL, Sirisha VL, Bhaskar VV, Rao AM, Narasu
ML, Kishor PK (2012). Isolation of cinnamoyl CoA reductase
and cinnamyl alcohol dehydrogenase gene promoters from Leu-
caena leucocephala, a leguminous tree species, and characteri-
zation of tissue-specific activity in transgenic tobacco. Plant Cell
Tiss Org, 108: 421~436
Ranjan R, Patro S, Kumari S, Kumar D, Dey N, Maiti IB (2011). Ef-
ficient chimeric promoters derived from full-length and sub-ge-
nomic transcript promoters of Figwort mosaic virus (FMV). J
Biotechnol, 152: 58~62
Raschke K, Fellows MP (1971). Stomatal movement in Zea mays:
Shuttle of potassium and chloride between guard cells and sub-
sidiary cells. Planta, 101: 296~316
Sassa H, Ushijima K, Hirano H (2002). A pistil-specific thaumatin/
PR5-like protein gene of Japanese pear (Pyrus serotina): se-
quence and promoter activity of the 5 region in transgenic to-
bacco. Plant Mol Biol, 50: 371~377
Shelenkov A, Korotkov E (2009). Search of regular sequences in
promoters from eukaryotic genomes. Comput Biol Chem, 33:
196~204
Sunilkumar G, Connell JP, Smith CW, Reddy AS, Rathore KS (2002).
Cotton alpha-globulin promoter: isolation and functional charac-
terization in transgenic cotton, Arabidopsis, and tobacco. Trans-
genic Res, 11: 347~359
Tan H, Yang X, Zhang F, Zheng X, Qu C, Mu J, Fu F, Li J, Guan R,
Zhang H et al (2011). Enhanced seed oil production in canola
by conditional expression of Brassica napus LEAFY COTYLE-
DON1 and LEC1-LIKE in developing seeds. Plant Physiol, 156:
1577~1588
Thilmony R, Guttman M, Thomson JG, Blechl AE (2009). The LP2
leucine-rich repeat receptor kinase gene promoter directs or-
gan-specific, light-responsive expression in transgenic rice. Plant
Biotechnol J, 7: 867~882
Trindade LM, Horvath BM, Bergervoet MJ, Visser RG (2003). Isola-
tion of a gene encoding a copper chaperone for the copper/zinc
superoxide dismutase and characterization of its promoter in
potato. Plant Physiol, 133: 618~629
Twell D, Wing R, Yamaguchi J, McCormick S (1989). Isolation and
expression of an anther-specific gene from tomato. Mol Gen
Genet, 217: 240~245
Ubeda-Tomas S, Federici F, Casimiro I, Beemster GT, Bhalerao R,
Swarup R, Doerner P, Haseloff J, Bennett MJ (2009). Gibberellin
signaling in the endodermis controls Arabidopsis root meristem
size. Curr Biol, 19: 1194~1199
Ubeda-Tomas S, Swarup R, Coates J, Swarup K, Laplaze L, Beemster
GT, Hedden P, Bhalerao R, Bennett MJ (2008). Root growth in
Arabidopsis requires gibberellin/DELLA signalling in the endo-
dermis. Nat Cell Biol, 10: 625~628
Vaucheret H, Béclin C, Elmayan T, Feuerbach F, Godon C, Morel
JB, Mourrain P, Palauqui JC, Vernhettes S (1998). Transgene‐
induced gene silencing in plants. Plant J, 16: 651~659
Verelst W, Saedler H, Munster T (2007). MIKC* MADS-protein com-
plexes bind motifs enriched in the proximal region of late pol-
len-specific Arabidopsis promoters. Plant Physiol, 143: 447~460
Wakeley PR, Rogers HJ, Rozycka M, Greenland AJ, Hussey PJ (1998).
A maize pectin methylesterase-like gene, ZmC5, specifically ex-
pressed in pollen. Plant Mol Biol, 37: 187~192
Wu C, Li X, Yuan W, Chen G, Kilian A, Li J, Xu C, Li X, Zhou DX,
Wang S et al (2003). Development of enhancer trap lines for
functional analysis of the rice genome. Plant J, 35: 418~427
Xu Y, Buchholz WG, DeRose RT, Hall TC (1995). Characterization
of a rice gene family encoding root-specific proteins. Plant Mol
Biol, 27: 237~248
Yang Z, Lu Q, Wen X, Chen F, Lu C (2012). Functional analysis of
the rice rubisco activase promoter in transgenic Arabidopsis.
Biochem Biophys Res Commun, 418: 565~570
Ye R, Zhou F, Lin Y (2012). Two novel positive cis-regulatory ele-
ments involved in green tissue-specific promoter activity in rice
(Oryza sativa L ssp.). Plant Cell Rep, 31: 1159~1172