全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (8): 785~791 785
收稿 2011-06-10　　修定 2011-07-30
资助 广东省科技攻关项目(2010B020301011)、广东省自然
科学基金(8152404801000011、10152404801000005、
10452404801004328)、湛江市科技攻关项目(2011C-
3104010)、湛江师范学院校级项目(ZL0905和QL0913)。
* 通讯作者(E-mail: zengfuhua@gmail.com; Tel: 0759-3183622)。
新型分裂素PBU对尾巨桉胚性愈伤组织诱导及植株再生的影响
欧阳乐军1,2, 黄真池1, 沙月娥1,2, 张美萍1, 曾富华1,*, 卢向阳2
1湛江师范学院生命科学与技术学院, 广东湛江524048; 2湖南农业大学生物科学技术学院, 长沙410128
摘要: 以尾巨桉优良无性系无菌苗茎段为外植体, 通过对噻唑基脲类新型分裂素(N-phenyl-N′-[6-(2-chlorobenzothiazol)-yl]
urea, PBU)等多种不同浓度生长调节剂组合的优化, 进行胚性愈伤组织诱导及植株再生研究。结果表明, 在添加了2 mg·L-1
PBU和0.05 mg·L-1 IAA的改良MS培养基上, 茎段外植体培养5 d后愈伤组织诱导率达96%以上。将愈伤组织接种在添加1
mg·L-1 6-BA和0.05 mg·L-1 NAA的MS培养基上, 诱芽率达90.8%。随后在添加了0.8 mg·L-1 PBU与0.05 mg·L-1 IAA的1/2MS培
养基上诱导芽伸长, 用1/2MS培养基附加0.5 mg·L-1 IBA诱导生根, 移栽后得到完整再生植株。
关键词: 尾巨桉; PBU; 胚性愈伤组织诱导; 再生
Effects of a New Synthetic Cytokinin PBU on Embryogenic Callus Induction
and Plant Regeneration of Eucalyptus urophylla×E. grandis
OUYANG Le-Jun1,2, HUANG Zhen-Chi1, SHA Yue-E1,2, ZHANG Mei-Ping1, ZENG Fu-Hua1,*, LU Xiang-Yang2
1Life Science and Technology School, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang, Guangdong 524048, China; 2College of Biosci-
ence and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
Abstract: The embryogenic callus induction and shoot regeneration were studied systematically in elite clone
of Eucalyptus urophylla×E. grandis by comparing the variety of combinations of different plant growth regula-
tors, such as N-phenyl-N′-[6-(2-chlorobenzothiazol)-yl] urea (PBU). Stem segments were used as explants and
cultured on a modified MS medium supplemented with the synthetic growth regulators, 2 mg·L-1 PBU and 0.05
mg·L-1 IAA. After cultivation for 5 d, 96% of explants formed callus. Callus were transferred to MS medium
containing 1 mg·L-1 6-BA and 0.05 mg·L-1 NAA to induce bud formation, and 90.8% of the callus induced by
PBU exhibited adventitious bud formation. Shoot elongation was then stimulated on 1/2MS supplemented with
0.8 mg·L-1 PBU and 0.05 mg·L-1 IAA for 20 d. For rooting, the elongated shoots were cultivated on root induc-
tion medium containing 0.5 mg·L-1 IBA. Plantlets were then successfully transplanted to a greenhouse for grow-
ing into mature plants.
Key words: Eucalyptus urophylla×E. grandis; N-phenyl-N′-[6-(2-chlorobenzothiazol)-yl] urea; embryogenic
callus induction; regeneration
桉树是桃金娘科桉属(Eucalyptus)植物的统
称, 是世界三大速生树种之一(祁述雄2006)。尾巨
桉(E. urophylla×E. grandis)是尾叶桉(E. urophylla)
与巨桉(E. grandis)的杂交种, 具有明显的杂种优
势, 其树干通直、均匀, 具有适应性广、耐寒性
强、速生丰产等优点, 是优良的工业材料, 其种植
面积已占到了桉树人工林面积的40%, 成为我国南
方热带、亚热带地区最重要的速生丰产造林树种
之一(韦大器等2008)。由于桉属树种是异花授粉
的多年生木本植物, 杂种后代严重分离变异, 用有
性繁殖方法很难保持优良树种的特性, 而采用扦
插、压条、驳枝等无性繁殖方法效率低下, 不适
应大规模商品化育苗的需求, 采用组培快繁是一
条经济有效的途径(谢耀坚2000)。特别是随着桉
树产业化不断推进, 对优良速生、抗病的无性系
品种需求越来越多。基因工程育种具有周期短、
针对性强等优点, 可弥补常规育种的不足(欧阳乐
军和曾富华2008)。建立高效稳定离体再生体系是
桉树基因工程育种的重要前提。因此, 研究如何
经过愈伤组织诱导建立桉树稳定再生体系是相当
植物生理学报786
重要的。桉树作为含酚类和多糖丰富的木本植物,
其再生体系建立有相当大的难度(Dibax等2010,
2005; Prakash和Gurumurthi 2009; Sartorett等
2002)。目前, 国内对尾巨桉再生体系建立的报导
还不多, 且诱芽率普遍都不高(韦大器等2007; 赖家
业等2007)。
噻唑基脲类新型分裂素(N-phenyl-N′-[6-(2-
chlorobenzothiazol)-yl] urea, PBU)是新合成的一种
具有促进细胞分裂功能的活性物质(李再峰和罗富
英2001)。我们在开展尾巨桉愈伤组织诱导和植株
再生研究中, 应用PBU获得了胚性愈伤组织和高达
90%以上的不定芽诱导率, 建立了尾巨桉高效再生
体系, 为生产上尾巨桉商品化大规模育苗提供一
定的参考, 也为尾巨桉胚性细胞遗传转化体系的
建立打下基础。
材料与方法
1 材料
供试材料为国家林业局桉树研究中心提供的
尾巨桉(Eucalyptus urophylla×E. grandis) DH32-29
无菌苗。挑取粗壮的幼苗, 将其嫩茎切成0.5~0.8
cm长的不带芽点的茎段作为外植体。
2 试剂
PBU由本实验室李再峰教授合成, 先溶于少
量二甲基甲酰胺 , 再加水定容至终浓度为100
mg·L-1母液备用。2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲
哚 - 3 -丁酸 ( I B A )、萘乙酸 ( N A A )、吲哚乙酸
(IAA)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、亚精胺(Spd)、腐胺
(Put)、维生素C (Vc)、N-苯基-N′-1,2,3-噻二唑-5-
脲(TDZ)均购置生工生物工程(上海)有限公司。基
本培养基采用MS培养基, 培养条件为温度(25±
2) ℃, 光照强度约32.5 μmol·m-2·s-1, 光照时间12
h·d-1。
3 实验方法
3.1 PBU与不同植物生长调节剂组合对愈伤组织
诱导的影响
将外植体接种于愈伤组织诱导培养基(MS+30
g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂+100 mg·L-1 Vc, 添加不同浓
度的KT与2,4-D组合以及PBU与IAA组合, pH为
5.8~6.0)上, 于(25±2) ℃下暗培养。14 d后计算愈伤
组织形成情况及诱导率。
3.2 不同植物生长调节剂组合对不定芽分化的影
响
将外植体接种于愈伤组织诱导培养基(MS+30
g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂+100 mg·L-1 Vc+2 mg·L-1
PBU+0.05 mg·L-1 IAA, pH为5.8~6.0)上, 经暗培养
14 d、光暗交替培养7 d后, 再将外植体接种于不定
芽分化培养基(1/2MS+500 μmol·L -1 Put+100
μmol·L-1 Spd+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂+100 mg·L-1
Vc, 添加不同浓度梯度的6-BA和NAA组合、KT和
NAA组合, pH为5.8~6.0)上, 40 d后统计生长情况
和诱芽率。
3.3 愈伤组织暗培养时间对不定芽分化的影响
将外植体接种于愈伤组织诱导培养基(MS+30
g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂+100 mg·L-1 Vc+2 mg·L-1
PBU+0.05 mg·L-1 IAA, pH为5.8~6.0)上, 分别暗培
养8、10、12、14、16、18 d, 再光暗交替培养7 d,
然后接种于不定芽分化培养基(1/2MS+500 μmol·L-1
Put+100 μmol·L -1 Spd+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼
脂+100 mg·L-1 Vc+1.0 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1
NAA, pH为5.8~6.0)上, 40 d后统计生长情况和诱
芽率。
3.4 不同植物生长调节剂组合诱导的愈伤组织对
不定芽分化的影响
将外植体接种于愈伤组织诱导培养基(MS+30
g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂+100 mg·L-1 Vc, 分别添加2
mg·L-1 PBU和0.05 mg·L-1 IAA组合、2.0 mg·L-1
2,4-D与0.5 mg·L-1 KT组合, pH为5.8~6.0)上, 经暗
培养14 d、光暗交替培养7 d后, 再将外植体接种于
不定芽分化培养基(1/2MS+500 μmol·L-1 Put+100
μmol·L-1 Spd+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂+100 mg·L-1
Vc+1.0 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA, pH为
5.8~6.0)上, 40 d后统计生长情况和诱芽率。
3.5 不同浓度PBU对不定芽伸长的影响
将高约0.5 cm且长势较好的芽丛切割成单株,
保留部分愈伤组织基部, 转移到不定芽伸长培养
基(1/2MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂+100 mg·L-1 Vc,
添加不同浓度梯度的PBU与NAA组合 , pH为
5.8~6.0)上培养, 20 d后统计不定芽伸长情况。
3.6 不同浓度的IBA对生根的影响
将高为3~4 cm的无菌苗转入生根培养基
(1/2MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂+100 mg·L-1 Vc,
欧阳乐军等: 新型分裂素PBU对尾巨桉胚性愈伤组织诱导及植株再生的影响 787
添加不同浓度梯度的IBA, pH为5.8~6.0)上, 培养20
d后统计生根情况及生根率(即生根苗数占总苗数
的百分率)。
4 数据统计与分析
每个试验处理均设置5个重复的培养皿, 每个
培养皿接种30个外植体, 外植体愈伤组织以切口
基部能观察到球状突起, 即生长出直径大于2 mm
的愈伤组织计数, 愈伤组织诱导率为诱导出愈伤
组织的外植体数占接种外植体数的百分比。不定
芽分化率以愈伤组织表面生长出大于4 mm芽的愈
伤组织数占接种愈伤组织数的百分比(裘珍飞等
2009)。采用SAS分析软件进行数据处理, 文中百
分率数据分析时经过正弦平方根转换。
实验结果
1 不同植物生长调节剂组合对愈伤组织形成的影
响
接种6~8 d后, 外植体切口两端产生愈伤组织,
外植体呈哑铃状, 以后逐渐从两端延伸形成膨大
的愈伤组织。愈伤组织色泽、结构各异, 主要有
淡黄色、黄绿色、红色、褐色4种不同类型(图
1)。其中, 黄绿色愈伤组织活力较好, 最先直接分
化出绿色芽点, 诱导出不定芽。部分淡黄色愈伤
组织也能慢慢转绿, 分化活力增强, 而部分淡黄色
愈伤组织则变白, 玻璃化。红色愈伤组织较为松
散, 结构不如黄绿色愈伤组织致密, 在后续继代过
程中, 部分红色愈伤组织表面逐渐诱导出颗粒状
的胚性细胞团, 形成胚性愈伤组织, 且比例占到整
个愈伤组织总数的10%左右。在随后的培养中, 胚
性愈伤组织渐渐分化出嫩绿色小芽点, 表面湿润,
个别外植体分化出的小芽数可达20个左右。褐色
愈伤组织活力最差, 不能进一步分化, 而渐渐干枯
死亡。
2,4-D与KT组合、PBU与IAA组合都能诱导
愈伤组织形成, 同一组合的不同浓度处理间愈伤
组织诱导率差异达到显著水平(表1)。PBU与IAA
组合处理下的愈伤组织诱导率比2,4-D与KT组合
处理的高, 且活力更好。当PBU浓度为2 mg·L-1、
图1 尾巨桉茎段诱导形成的不同类型愈伤组织
Fig.1 The different types of callus induced from stem segments of E. urophylla×E. grandis
表1 不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effects of different combinations of plant growth regulators on callus induction
生长调节剂浓度/mg·L-1
诱导率/% 生长情况
生长调节剂浓度/mg·L-1
诱导率/% 生长情况
2,4-D KT IAA PBU
1.0 0.1 57.7±2.6E 8 d形成淡黄色愈伤组织 0.03 1.0 85.3±1.3DE 7 d形成黄绿色愈伤组织
1.0 0.2 67.5±2.0D 7 d形成淡黄色愈伤组织 0.03 2.0 94.6±2.4AB 7 d形成黄绿色愈伤组织
1.0 0.5 76.0±1.1C 6 d形成淡黄色愈伤组织 0.03 3.0 93.7±1.4B 6 d形成红色愈伤组织
2.0 0.1 82.2±1.0B 7 d形成黄绿色愈伤组织 0.05 1.0 88.4±1.9DE 6 d形成红色愈伤组织
2.0 0.2 87.3±1.6A 7 d形成黄绿色愈伤组织 0.05 2.0 96.4±1.7A 5 d形成红色愈伤组织
2.0 0.5 89.7±1.1A 6 d形成黄绿色愈伤组织 0.05 3.0 81.2±0.8E 5 d形成红色愈伤组织
3.0 0.1 72.6±1.1CD 8 d形成黄绿色愈伤组织 0.10 1.0 91.8±1.3BC 7 d形成红色愈伤组织
3.0 0.2 77.5±0.7BC 7 d形成黄绿色愈伤组织 0.10 2.0 89.1±1.4CD 7 d形成红色愈伤组织
3.0 0.5 77.9±1.6BC 7 d形成黄绿色愈伤组织 0.10 3.0 50.6±2.2F 6 d形成红色愈伤组织
　　表中数据为平均值±标准误, 同列中不同字母表示差异极显著(P=0.01)。
植物生理学报788
IAA浓度为0.05 mg·L-1时, 愈伤组织诱导率最高, 达
到96.4%。
2 不同因素对不定芽分化的影响
由表2可知, 同一植物生长调节剂组合的不同
浓度处理间不定芽诱导率差异达到极显著水平。
在KT和NAA的组合中, 诱芽率较低, 最高诱导率
仅为34.7%, 且不定芽生长情况一般。6-BA和
NAA的组合中, 当6-BA浓度为1.0 mg·L-1、NAA为
0.05 mg·L-1时, 诱芽率达到最大, 为90.8%, 生长状
况好, 且部分愈伤组织表面分化出红色颗粒状的
胚性细胞团(图2-A), 形成胚性愈伤组织, 30 d后每
块愈伤组织中红色颗粒状胚性细胞团的数量平均
达9.3个。具有红色颗粒的愈伤组织在再生培养时
产生再生芽数量最多(图2-B)。
愈伤组织暗培养时间对不定芽分化的影响如
图3所示, 愈伤组织暗培养时间为8 d时, 诱芽率非
常低, 仅有22.3%; 当暗培养时间为14 d时, 诱芽率
最高达88.9%, 随后诱芽率又逐渐下降。
图2 尾巨桉再生过程
Fig.2 Regeneration of E. urophylla×E. grandis
A: 愈伤组织诱导; B: 芽分化; C: 芽伸长; D和E: 生根; F: 移栽。
表2 不同植物生长调节剂组合对不定芽分化的影响
Table 2 Effects of different combinations of plant growth regulators on adventitious buds induction
生长调节剂浓度/mg·L-1
诱芽率/% 生长情况
生长调节剂浓度/mg·L-1
诱芽率/% 生长情况
KT NAA NAA 6-BA
0.1 0.02 2.1±1.8D - 0.02 0.25 44.6±2.2C -
0.1 0.05 5.7±1.5CD - 0.02 0.5 65.6±4.3B ++
0.1 0.10 13.1±2.1B + 0.02 1.0 75.4±2.9B +++
0.2 0.02 19.7±1.8B + 0.05 0.25 52.3±2.1C ++
0.2 0.05 34.7±3.9A + 0.05 0.5 73.8±3.5B ++
0.2 0.10 22.3±3.2B + 0.05 1.0 90.8±3.8A +++
0.5 0.02 18.1±4.2B - 0.10 0.25 53.8±3.3C +
0.5 0.05 13.1±4.4BC - 0.10 0.5 76.3±2.9B ++
0.5 0.10 7.7±2.2D - 0.10 1.0 84.6±2.9A +++
　　-表示差; +表示一般; ++表示较好; +++表示好。表中数据为平均值±标准误, 同列中不同字母表示差异极显著(P=0.01)。
欧阳乐军等: 新型分裂素PBU对尾巨桉胚性愈伤组织诱导及植株再生的影响 789
4 不同浓度的IBA对生根的影响
将2.5 cm左右高的丛生芽切成单株后转入生
根培养基, 7 d后在茎基部开始膨大, 并有白色根点
突起, 9~12 d后陆续长根, 根由茎直接发出, 无愈伤
组织形成(图2-E)。
由表4可见, 不同浓度的IBA诱导生根率差异
达到极显著水平。当IBA浓度为0.5 mg·L-1时, 生根
率最高, 生根时间短, 根粗壮且根系发达; 然而当
IBA浓度超过0.5 mg·L-1后, 生根率随IBA浓度升高
而降低。
将生根良好的生根苗从光照培养箱移至室外
炼苗数天, 再移栽到黄心土和腐殖质土2:1混合的
花盆中后置于人工气候箱, 20 d后可得到完整的再
生植株(图2-F)。
讨　　论
利用体细胞胚胎发生进行优良无性系的快速
繁殖具有巨大的市场潜力和广阔的应用前景, 在
胚性细胞遗传转化体系的建立、人工种子制作、
离体种子资源保存以及体细胞杂交等方面都有重
要意义(Prommee等2009)。PBU作为新型植物活性
剂, 是一种类似天然植物细胞分裂素的化合物, 李
再峰等(2005)的研究结果表明, PBU对大花蕙兰、
文心兰、香蕉等植物不定芽增殖的影响比6-BA更
好, 有利于芽的分化。本实验结果表明, PBU比
6-BA更利于尾巨桉愈伤组织诱导, 可能因为PBU
是在N-取代苯基-N-(6-苯并噻唑基)脲类化合物的
基础上, 以2-硝基氯苯取代苯胺为原料, 合成的脲
类化合物, 具有促进细胞分裂的作用, 再加上IAA
的协同作用, 诱导率明显升高, 使愈伤组织诱导率
表3 不同浓度的NAA和PBU组合对不定芽伸长的影响
Table 3 Effect of different concentrations of PBU
and NAA on shoot elongation
NAA浓度 PBU浓度
生长情况
/mg·L-1 /mg·L-1
0.02 0.5 不定芽增殖较少, 仅有少数苗稍有伸长, 约1 cm
0.02 0.8 不定芽增殖较多, 少数苗稍有伸长, 约1 cm
0.02 1.0 不定芽增殖较多, 少数苗有伸长, 1~2 cm
0.05 0.5 不定芽增殖较少, 多数苗伸长较明显, 2~3 cm
0.05 0.8 不定芽增殖较少, 多数苗伸长较明显, 3~4 cm
0.05 1.0 不定芽增殖较少, 多数苗伸长较明显, 2~3 cm
0.08 0.5 不定芽增殖少, 少数苗明显伸长, 1~3 cm
0.08 0.8 不定芽增殖较少, 少数苗稍有伸长, 1~2 cm
0.08 1.0 不定芽增殖较少, 少数苗稍有伸长, 约1 cm
为了进一步探究用PBU诱导的愈伤组织对后
续诱芽率的影响, 分别用2 mg·L-1 PBU和0.05 mg·L-1
IAA组合、2.0 mg·L-1 2,4-D与0.5 mg·L-1 KT组合(作
对照)诱导的两种愈伤组织作诱芽率的比较, 结果
表明, 在相同的不定芽诱导条件下, 经PBU诱导的
愈伤组织平均诱芽率达到90.8%, 而对照处理的诱
芽率则只有50.3%, 经t检验, 差异达到极显著水
平。
3 不同浓度NAA和PBU组合对不定芽伸长的影响
本实验设计的所有植物生长调节剂组合基本
上都能使短小芽丛伸长, 但芽伸长高度的差异很
大, 从0.5~4 cm不等。在低浓度的NAA诱导下, 不
定芽增殖较多, 明显影响到芽伸长的效率; 当NAA
浓度为0.05 mg·L-1、PBU浓度为0.8 mg·L-1时, 芽高
达到3~4 cm, 叶片绿色, 芽苗生长情况较好(表3)。
图3 暗培养时间对不定芽分化的影响
Fig.3 Effect of dark culture time on adventitious
buds induction
表4 不同浓度的IBA对生根的影响
Table 4 Effect of different concentrations of IBA on rooting
IBA浓度/mg·L-1 生根率/% 生根情况
0.25 78.0±2.7C 9 d生根, 根粗壮, 须根多
0.50 92.4±3.3A 9 d生根, 根粗壮, 须根多
0.75 90.8±2.3AB 9 d生根, 根粗壮, 须根较多
1.00 89.6±3.6AB 10 d生根, 根粗壮, 须根较多
1.25 84.4±3.8BC 12 d生根, 根粗壮, 须根少
1.50 79.4±2.4C 12 d生根, 根粗壮, 须根很少
　　表中数据为平均值±标准误, 同列中不同字母表示差异极显著
(P=0.01)。
植物生理学报790
达到96%以上。特别是愈伤组织活力较好, 分化潜
力强, 在后续的不定芽诱导中, 不定芽诱导率高达
90%以上, 比对照的诱芽率高出40.5%, 差异达到极
显著水平, 说明PBU对不定芽诱导的影响作用明
显。本实验中不定芽诱导率最高达90.8%, 远高于
国内已报道的最高水平(韦大器等2008)。
胚性愈伤组织的诱导是实现植株高频再生的
关键。本研究通过PBU的合理使用, 获得了胚性愈
伤组织并实现胚性愈伤组织的再生, 获得最高达
每个外植体有20个芽的胚性愈伤组织团, 同时诱
导形成了色泽各异的愈伤组织。黄真池等(2010)
在尾叶桉的组织培养中发现 , 外植体分化成褐
色、白色以及浅绿色3种颜色的愈伤组织, 其中只
有浅绿色愈伤组织能分化出不定芽; 邱璐等(2006)
在史密斯桉的组织培养中发现, 浅绿色颗粒状的
愈伤组织分化成芽的能力最高; 韩美丽等(1997)在
赤桉的组织培养中发现, 刚诱导出来的愈伤组织
为淡黄色, 再逐渐变为紫红色, 有光泽, 表面出现
大量的颗粒状结构, 其胚状体发生率最高; 石大兴
等(2002)在巨桉的组织培养中发现, 下胚轴发生的
愈伤组织多为浅绿色、黄白色、浅红色等紧密型
愈伤组织, 大多数黄白色愈伤组织经继代培养后
逐渐变褐死亡, 唯有少数红色愈伤组织逐渐变成
鲜红色, 并呈现发亮的颗粒状, 并可进一步诱导不
定芽发生; 裘珍飞等(2009)在巨尾桉胚性愈伤组织
诱导中发现, 呈鲜红色、有颗粒状结构的愈伤组
织最易诱导出胚状体。本研究中不定芽分化能力
最强的愈伤组织为颗粒状, 表面湿润, 结构致密,
暗培养时颜色为淡红色, 光照后逐渐转为绿色; 这
与前人的结论基本相似。欧阳权等(1981)通过切
片获得胚性愈伤组织的特征为细胞小、质浓、核
明显, 外观特征为表面光滑、湿润、呈深红色或
淡红色、颗粒状、凹凸不平, 这与本试验诱导的
胚性愈伤组织高度一致; 但本试验诱导的胚性愈
伤组织比例只占整个愈伤组织总数的10%左右, 且
只有部分胚性细胞团分化再生, 其他都是由愈伤
组织直接诱导出芽原基, 形成不定芽。这可能与
外植体来源的组织培养苗生长不一致、诱导的胚
性愈伤组织发育不完全、胚性细胞的活力不强等
原因有关。提高胚性愈伤组织的诱导率及分化率
是值得进一步研究的问题。
在尾巨桉再生过程中, 我们发现, 发生褐化的
愈伤组织即失去再分化的能力。因此, 褐化问题
是限制不定芽诱导的一个重要制约因素。多数研
究表明, 褐化是由于切割破坏了组织细胞中的隔
离体系, 使酚类等底物释放出来, 经过多酚氧化酶
的催化而生成醌类物质, 从而导致外植体褐化。
影响褐变的原因有材料基因型、材料生理状态、
培养基成分及培养条件等(赵苏海等2007)。尾巨
桉含多酚类物质较多, 组织培养再生过程中防止
外植体褐化极为重要。在本实验中, 通过选取幼
嫩的材料作外植体, 切割茎段时尽量切口平滑; 增
加暗培养的时间, 培养时严格控制培养箱和培养
室的温度; 向培养基中加入100 mg·L-1的Vc以及
500 μmol·L-1 Put、100 μmol·L-1 Spd等多胺类物质;
适时更换新鲜培养基等措施能有效减少褐化现象
发生, 实现尾巨桉高频再生。
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