全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (4): 447~452　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2013.0410 447
收稿 2013-11-11　　修定 2014-03-24
资助 云南省基础研究重点项目(2013FA054)、云南省自然科学基
金(2009CD073)、云南省中青年学术技术带头人后备人才培
养项目(2010CI016)、国家林业局“948”项目(2008-4-30)。
* 通讯作者(E-mail: schima@163.com; Tel: 0871-65822842)。
七彩红竹二氢黄酮醇4-还原酶基因IhDFR1的克隆及表达分析
缪福俊1, 陈剑1, 孙浩2, 王毅1, 王晨晨3, 原晓龙1, 杨宇明1, 王娟1,*
1云南省林业科学院, 国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室, 云南省森林植物培育与开发利用重点实
验室, 昆明650201; 2中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳110016; 3西南林业大学林学院, 昆明650224
摘要: 二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是植物花色素苷合成途径中的关键酶, 在植物花色的形成过程中起重要作用。依据七彩
红竹转录组数据设计特异引物, 采用RT-PCR技术从七彩红竹中克隆获得了一个新的DFR基因cDNA全长, 命名为IhDFR1
(登录号为KF728205)。序列分析结果表明, IhDFR1基因cDNA全长945 bp, 编码314个氨基酸。生物信息学预测显示, 该基
因编码的蛋白具有典型的DFR蛋白功能结构域, 存在2个特异结合位点, 属于非Asn/Asp型DFR酶, 与禾本科植物中的DFR
具有较高的相似性。对不同发育时期七彩红竹的IhDFR1基因进行时空表达的结果显示, 只有在竹秆颜色呈现红紫色时,
IhDFR1基因才有表达。以上结果初步显示IhDFR1蛋白可能作为一个重要的酶参与竹秆花色素苷的代谢调控, 同时为进一
步研究七彩红竹花色素苷产生的分子机理和综合开发利用奠定了基础。
关键词: 七彩红竹; 花色素苷; 二氢黄酮醇4-还原酶; 基因表达
Cloning and Expression Analysis of Dihydroflavonol 4-Reductase Gene
IhDFR1 from Indosasa hispida cv. ‘Rainbow’
MIAO Fu-Jun1, CHEN Jian1, SUN Hao2, WANG Yi1, WANG Chen-Chen3, YUAN Xiao-Long1, YANG Yu-Ming1, WANG Juan1,*
1Key Laboratory for Conservation of Rare, Endangered & Endemic Forest Plants, State Forestry Administration, Yunnan
Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants, Yunnan Academy of Forestry, Kunming 650201,
China; 2Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China; 3College of Forestry, Southwest
Forestry University, Kunming 650224, China
Abstract: Dihydroflavonol 4-reductase (DFR) is a key enzyme in the anthocyanins biosynthesis pathway, and
plays a critical role in flower pigmentation. The gene-specific primers were designed according to the
transcriptome sequencing data, and the full-length cDNA of a novel DFR gene was cloned from Indosasa
hispida cv. ‘Rainbow’ with the method of reverse transcription PCR. This novel gene was named as IhDFR1
(GenBank accession No. KF728205). Sequence analysis indicated that IhDFR1 was 945 bp in length and
encoded a protein with 314 amino acids. Bioinformatics analysis showed that IhDFR1 had the typical functional
domains of DFR protein, containing two specific binding sites and belonging to the non-Asn/Asp DFR. The
IhDFR1 was homologous with the DFRs from the gramineous plants. The temporal-spatial expression analysis
based on different growth stages indicated that the IhDFR1 was expressed only in the reddish violet culms. The
results above preliminarily suggested that the IhDFR1 might be an important enzyme governing anthocyanin
metabolism, and lay a theoretical basis for further exploration of molecular mechanism of anthocyanins and for
the comprehensive exploitation and utilization of I. hispida cv. ‘Rainbow’.
Key words: Indosasa hispida cv. ‘Rainbow’; anthocyanins; dihydroflavonol 4-reductase; gene expression
七彩红竹为禾本科大节竹属植物, 是浦竹仔
的产花色素苷变种, 主要分布于云南南部景洪、
勐腊、普洱、江城等地, 海拔在1 700 m以下(王娟
等2012; 徐永椿1991)。我们于2009年在云南普洱
发现当地自然分布的蒲竹仔群落中偶见竹秆中下
部出现不同程度的红色至红紫色, 经鉴定, 在分类
上应属大节竹属的浦竹仔变种, 具有重要的观赏
价值和潜在的商业开发价值。而出现红色秆性状
的居群, 并非是种属差异导致, 而是因样本收集地
环境因子诱发基因突变所致, 其诱发因子目前未
知(王娟等2012)。花色素苷是植物次生代谢过程
植物生理学报448
中产生的一类水溶性天然食用色素 , 是构成花
瓣、果实和茎杆颜色的主要色素之一, 还具一定
的营养和药理作用(Singh等2009; 卢钰等2004)。
然而, 在花色素苷合成过程中, 二氢黄酮醇4-还原
酶(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)对花色素苷的
最终形成起决定性作用, 是一个重要的调控点(符
红艳等2012; Dick等2011; 陈大志等2010)。DFR是
依赖二氢堪非醇(dihydrokaempferol, DHK)、二氢
栎皮黄酮(dihydroquercetin, DHQ)和二氢杨梅黄酮
(dihydromyricetin, DHM) 3种底物, 分别生成无色
花葵素、无色花青素和无色翠雀素, 在花色素苷
合成酶的作用下又分别合成花葵素(橙色-砖红
色)、花青素(红色-粉色)和翠雀素(蓝色-紫色) (张
龙等2008)。研究表明, 不同物种的DFR对底物选
择性不同, 合成了不同的花色素苷, 呈现出各异的
花色, 如矮牵牛(Petunia hybrida)的DFR缺乏还原
底物DHK活性, 所以其花瓣缺少橙色, 而大丁草
(Gerbera anandria) DFR能还原DHK, 其花瓣就能
产生橙色(潘丽晶等2010; Polashock等2002)。依据
DFR结合区中的134位与145位的氨基酸可直接影
响酶的底物特异性, 依据第134位氨基酸残基的不
同将DFR分为3类(李春雷等2009; Johnson等2001)。
第一类为Asn型DFR, 在绝大多种植物DFR中第
134位氨基酸残基为N; 第二类为Asp型DFR, 其在
134位上存在一个D, 此类DFR不能有效地将DHK
还原成无色花葵素, 导致缺少橙色, 如矮牵牛的花
瓣; 第三类是DFR的第134位氨基酸残基既不是D,
也不是N, 称为非Asn/Asp型。研究表明, 非Asn/
Asp型DFR酶的作用底物仅限于底物DHQ, 合成红
色的花色素苷, 如蔓越橘(Vaccinium macrocarpon)
的第134位氨基酸残基为V, 属非Asn/Asp型DFR,
致使其花和果实为红色(刘娟等2005)。
目前, 除本课题组发表了一篇在高山箭竹——
棉花竹(Fargesia fungosa)中发现花色素苷的论文
(彭桂莎等2011)外, 尚无其他有关竹子产花色素苷
的报道。七彩红竹的发现为竹类植物中研究花色
素苷代谢流提供了极好的试验材料。本研究以七
彩红竹为材料, 采用RT-PCR方法, 克隆了七彩红竹
DFR基因的cDNA全长, 并对其编码蛋白的结构特
征及其在不同生长时期竹秆中的表达特性进行了
分析, 旨在为进一步研究IhDFR1基因功能和探讨七
彩红竹红紫色秆形成的分子机制提供理论依据。
材料与方法
1 材料
七彩红竹(Indosasa hispida cv. ‘Rainbow’)采
自云南省林业科学院温室棚, 根据其竹秆颜色变
化情况, 分为7个不同的生长时期: 第1和第2时期
为幼嫩顶端时期, 基本组织和表皮都不显颜色; 第
3时期为中间秆段, 基本组织为红紫色, 表皮不显
色; 第4时期为中间秆段, 基本组织和表皮都显红
紫色; 第5时期为中间秆段, 基本组织略带红紫色,
表皮显红紫色; 第6时期为成熟老秆, 基本组织不
显色, 表皮显红紫色; 第7时期为成熟老秆, 基本组
织和表皮都不显红紫色(图1)。分别采集7个时期
的竹秆组织, 经液氮速冻后于-80 ℃保存备用。
2 方法
2.1 cDNA克隆和基因表达
采用TRNzol Reagent试剂盒(TIANGEN公司)
提取各样品中的总RNA。用PrimeScriptTM II 1st
Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa公司)试剂盒扩
增cDNA。
RT-PCR采用第4时期竹秆的RNA为模板扩增
cDNA, 上游引物F为: 5-ATGTGTCCGGCGCC-
GGCGGCATCGGGTAAG-3, 下游引物R为:5-
CTAATCCAACTCTCCATATATTCCACTGGC-3。
图1 七彩红竹不同生长时期的竹秆横切面图
Fig.1 The cross profile of I. hispida cv. ‘Rainbow’ in different growth stages
数字1~7分别代表7个不同的生长时期。
缪福俊等: 七彩红竹二氢黄酮醇4-还原酶基因IhDFR1的克隆及表达分析 449
反应体系为: 1 μL cDNA、1 μL上游引物F、1 μL
下游引物R、9.5 μL ddH2O、12.5 μL PrimeSTAR
Max DNA Premix (2×)。反应条件为: 98 ℃ 10 s, 55 ℃
5 s, 72 ℃ 10 s; 30个循环。PCR产物经1.2%琼脂糖
凝胶电泳检测后, 将预期片段经DNA回收试剂盒
(上海生工公司)切胶回收后 , 连接载体pEASY-
Blunt转入Trans1-T1感受态细胞中, 挑取阳性克隆,
用菌液PCR法(M13F、M13R引物)鉴定重组子, 确
认包含重组子的克隆, 送上海生工公司用M13F、
M13R引物测序。
半定量RT-PCR分别采用7个时期的RNA为模
板扩增cDNA, 上游引物F为: 5-GGGAGAGG-
AGGTGAA-3, 下游引物R为: 5-CGGGGTCTTT-
GGATT-3。Actin上游引物F为: 5-ATGGCTGAA-
G A G G ATAT C C A G C - 3 ; 下游引物R为 : 5 -
TYCCATGCCAATAAAAGATGGCTG-3。反应体
系为: 1 μL cDNA、1 μL上游引物F、1 μL下游引
物R、9.5 μL ddH2O、12.5 μL PrimeSTAR Max
DNA Premix (2×)。反应条件为: 98 ℃ 10 s, 57 ℃ 5
s, 72 ℃ 5 s; 30个循环。PCR产物经1.2%琼脂糖凝
胶电泳检测。
2.2 生物信息学分析
测序结果用DNAman去除载体后拼接得到
InDFR1基因全长。使用NCBI (http://www.ncbi.
nih.gov)中Conserved Domain Database数据库搜索
IhDFR1蛋白的结构功能域; 理化性质的预测借助
ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.
html)在线工具完成; 利用MEGA3软件进行聚类分
析; 信号肽预测由SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/
services/signalp/)完成; 亚细胞定位由WoLF PSORT
(http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/)完成; 利用SWISS-
MODEL (http://swissmodel.expasy.org//swiss-model.
h tml )在线工具分析蛋白质的三维结构 , 并用
PROCHECK (http://nihserver.mbi.ucla.edu/saves/)在
线工具构建拉氏图。
实验结果
1 七彩红竹InDFR1基因全长cDNA的克隆
七彩红竹InDFR1基因扩增结果如图2-A所示,
阳性克隆检测结果如图2-B所示, 经测序InDFR1基
因cDNA全长为945 bp, 编码一个长314个氨基酸的
蛋白质, 后续的生物信息学预测分析表明, 克隆的
cDNA序列编码DFR蛋白, 因此将该基因命名为
InDFR1, GenBank登录号为KF728205。
2 IhDFR1蛋白生物信息学分析
2.1 IhDFR1基因序列和蛋白结构域预测分析
IhDFR1基因cDNA全长及推测的氨基酸序列
见图3。蛋白结构功能域的预测分析表明, IhDFR1
蛋白有1个典型的NADB-Rossmann超家族(super-
family)保守结构域, 存在2个结合位点(图3): 一个
是NADP特异性结合位点 (VMDASGPLGHA-
LVDRLLRRGY), 而该位点是NADP依赖型DFR关
键酶的特征性结构域, 在已知的DFR氨基酸序列中
均有发现; 另一个是底物特异性结合位点(TMER-
VVFTSSVTAVVWKENHKLVDAF), 属于短链的
脱氢酶及还原酶(SDR)家族(图4)。DFR对不同底
物的结合由其分子中底物结合区的氨基酸序列所
决定, 这个序列在不同物种中也是高度保守的。
IhDFR1基因编码的蛋白中第134位氨基酸残基为
R, 属于非Asn/Asp型DFR酶。
2.2 IhDFR1蛋白质的理化性质预测
利用ProtParam在线软件预测IhDFR1蛋白的
理化性质, 结果表明其分子式为C1505H2349N413O462S21,
相对分子量34 293.9 Da, 等电点5.35 (酸性蛋白),
脂肪系数78.66, 半衰期30 h, 不稳定参数31.25。
根据不稳定参数值在40以下才是稳定蛋白的标准
(薛庆中2010), IhDFR1蛋白是一种较稳定的蛋白
图2 InDFR1基因PCR扩增产物的电泳分析
Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of InDFR1 PCR
amplification products
A: RT-PCR扩增产物; B: 阳性克隆扩增产物。
植物生理学报450
质。SignalP软件分析结果表明, 该蛋白不存在信
号肽 , 为非分泌蛋白 , 可能在细胞质中合成 , 不
进行蛋白转运。进而采用WoLF PSORT软件进行
亚细胞定位, 结果显示IhDFR1蛋白在细胞质中
合成。
2.3 IhDFR1蛋白质三维结构预测
利用SWISS-MODEL在线软件预测IhDFR1蛋
白质的三级结构, 并用PyMOL软件对建模结果进
行处理, 结果显示, 三级结构的构象呈现致密球状
结构(图5-A)。另外, 利用PROCHECK在线软件分
析同源建模结果, 可见该蛋白质残基的二面角位
于黄色核心区域(图5-B), 表明其空间结构稳定, 建
模结果可靠。
图4 IhDFR1蛋白保守结构域的预测分析
Fig.4 The analysis of conserved domain prediction of IhDFR1 protein
2.4 IhDFR1基因编码氨基酸的同源比对分析
将IhDFR1基因编码的氨基酸在NCBI数据库
中Blastp后, 选取二穗短柄草(Brachypodium dista-
chyon)、玉米(Zea mays)、葡萄(Vitis vinifera)、粗
山羊草(Aegilops tauschii)、大豆(Glycine max)、乌
拉尔图小麦(Triticum urartu)、蒺藜苜蓿(Medicago
truncatula) 7个物种构建聚类树(图6)可见, 在相似
性为54%水平上分为两大类, 其中IhDFR1基因编码
的氨基酸序列与玉米、粗山羊草、二穗短柄草、
乌拉尔图小麦等单子叶禾本科植物DFR的氨基酸
序列亲缘关系最近, 属Asn型DFR, 与二穗短柄草
DFR相似性高达82%, 与大豆、蒺藜苜蓿、葡萄等
亲缘关系较远, 相似性为68%。
图3 IhDFR1基因cDNA全长及推测的氨基酸序列
Fig.3 Complete cDNA and deduced amino acid sequences of InDFR1
下划线表示NADP结合位点; 双下划线表示底物结合特异性位点。
缪福俊等: 七彩红竹二氢黄酮醇4-还原酶基因IhDFR1的克隆及表达分析 451
3 IhDFR1基因的表达特性分析
以Actin作为内参, 通过半定量RT-PCR检测七
彩红竹7个不同生长时期竹秆组织中IhDFR1基因
的表达, 结果表明, IhDFR1基因在竹秆不显红紫色
的幼嫩时期(即第1、2、7时期)不表达, 在第3~6时
期都有表达, 其中在第3和4时期表达最强(图7)。
可见, IhDFR1基因的表达与七彩红竹7个时期的竹
秆颜色变化相对应, 竹秆颜色呈现红紫色时基因
表达, 反之, 基因不表达, 表明IhDFR1基因与竹秆
呈红紫色的变化紧密相关。
讨　　论
本研究采用RT-PCR和生物信息学方法对七
彩红竹的花色素苷途径中的关键酶DFR的基因进
行克隆和序列分析, IhDFR1蛋白属于酸性稳定的
非分泌蛋白, 不存在信号肽。研究结果与樊云芳
等(2011)对宁夏枸杞(Lycium barbarum) LbDFR1和
周琳等(2011)对牡丹(Paeonia suffruticosa) PsDFR1
基因的研究结果一致, 说明植物的DFR蛋白不具有
信号肽, 是非分泌蛋白。从而推断DFR蛋白可能在
细胞质中合成, 不进行蛋白转运, 牡丹的PsDFR1蛋
白定位于质膜。IhDFR1蛋白具有典型的DFR蛋白
功能结构域, 存在2个结合位点, 不同植物的DFR氨
基酸序列在2个特异区域有较高的同源性, DFR氨
基酸序列中的NADP结合位点是高度保守的, 由26
个氨基酸序列组成的底物特异性结合区也高度保
守(覃建兵等2012; Petit等2007)。IhDFR1蛋白第
134位氨基酸残基为R, 属于非Asn/Asp型DFR酶,
前人的研究表明非Asn/Asp型DFR酶的作用底物仅
限于底物DHQ, 合成红色的花色素苷, 由此可以从
底物选择特异性结合位点的角度解释七彩红竹红
色秆个体产生的原因, 可能是由于编码第134位氨
基酸的碱基发生突变而导致浦竹仔产生红色秆。
这说明七彩红竹出现花色素苷性状并非种属差异
导致, 而是由于样本收集地环境因子诱发基因突
变所致(王娟等2012), 相比来自其他种源地的植株,
图5 IhDFR1蛋白的三维结构模型(A)及拉氏构象图(B)
Fig.5 The putative 3D structure (A) and Ramachandram plot (B) of IhDFR1 protein
图6 IhDFR1蛋白与其他物种DFR蛋白的聚类分析
Fig.6 Phylogenetic tree analysis of the IhDFR1 and DFR
proteins from other species
图7 IhDFR1基因在七彩红竹茎部的时空表达分析
Fig.7 Temporal-spatial expression of IhDFR1 gene in the
culms of I. hispida cv. ‘Rainbow’
数字1~7分别代表7个不同的生长时期。
植物生理学报452
七彩红竹IhDFR1基因是否发生变异(包括启动子
和编码区域), 还有待后续进一步的研究。
IhDFR1蛋白三级结构的构象呈现致密球状结
构, 空间结构稳定。陈大志等(2010)研究唇形亚纲
植物DFR基因的结果表明, DFR基因的空间结构分
为松散C-末端和致密球状结构两个部分。DFR与
NADPH辅助因子的底物结合区域都在致密球状结
构中。IhDFR1蛋白与单子叶禾本科植物(玉米、
粗山羊草、二穗短柄草、乌拉尔图小麦)的DFR亲
缘关系最近, 说明该基因在进化上比较保守, 而单
子叶植物的DFR均为Asn型DFR, 进一步证实非
Asn/Asp型DFR极有可能是由于地理隔离等原因由
Asn型进化而来的说法(张龙等2008)。另外, 七彩
红竹IhDFR1基因的在竹秆不同时期的表达情况不
同, 且与竹秆颜色的变化有关联, 但其分子机制还
有待研究。以上研究结果为后期七彩红竹花色素
苷的开发利用和培育具有较高观赏价值的竹种提
供了理论依据。
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