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EST-SSR 标记在木本植物中的开发和应用



全 文 :植物生理学通讯 第 45卷 第 12期,2009年 12月 1221
收稿 2009-10-23 修定  2009-11-23
资助 国家自然科学基金(3 0 7 7 1 7 5 9、3 0 9 7 2 3 8 8 )、广东省
自然科学基金团队项目(9351064201000002)和华南农
业大学校长基金(2 00 9 X0 14 )。
* 通讯作者(E-ma i l : xychen@scau .edu.cn; Tel : 02 0 -
8 5 2 8 0 0 0 1 )。
EST-SSR标记在木本植物中的开发和应用
林元震 1, 郭海 2, 刘纯鑫 1, 刘天颐 1, 黄少伟 1, 陈晓阳 1,*
1华南农业大学林学院, 广州 510642; 2水利部水土保持植物开发管理中心, 北京 100038
Development and Application of EST-SSR Markers in Woody Plants
LIN Yuan-Zhen1, GUO Hai2, LIU Chun-Xin1, LIU Tian-Yi1, HUANG Shao-Wei1, CHEN Xiao-Yang1,*
1College of Forestry, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2Plant Materials Center for Soil and Water
Conservation, Ministry of Water Resources, Beijing 100038, China
提要: 本文简述EST-SSR的开发策略, 重点就其在木本植物遗传研究中的遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、比较作图
以及种质资源鉴定的应用现状和存在问题作介绍, 并对其应用前景作了展望。
关键词: 木本植物; EST-SSR; 遗传多样性; 遗传图谱; 种质资源鉴定
简单序列重复(simple sequence repeat, SSR),
也称微卫星(microsatellite), 是指以1~6个核苷酸为
单位在基因组中多次串联重复的DNA序列(Akkaya
等 1992)。SSR标记与其它分子标记技术相比, 具
有易检测、共显性遗传、重复性好、数量丰富
和多态性高以及遍布整个基因组等优点, 因此在植
物遗传研究的众多方面受到重视( S c h l o t t e r e r
2004)。SSR可分为基因组 SSR和 EST-SSR。基
因组 SSR标记一般是经过基因组DNA文库构建、
重复序列克隆的识别和筛选以及测序等实验流程获
得, 开发过程繁琐、时间长、成本高, 而且效率
低(Roder等 1998)。此外, 基因组 SSR往往具有物
种特异性, 重复基序也限制在 2~3个核苷酸, 从而
极大地限制了基因组 SSR 的应用范围(Chen等
2006)。近些年来, 随着植物基因组与功能基因组
研究的发展, 大规模植物基因的测序产生了大量的
EST序列, 并上传到核酸公共数据库, 而且 EST的
数量仍在与日俱增, 已成为开发EST-SSR的一种资
源。EST序列开发的 EST-SSR标记比与传统的基
因组 SSR标记有很多优点, 如: EST-SSR标记在物
种间具有高通用性, 通常都代表着某种基因功能, 开
发过程简单、成本低, 还可反映出转录区的差异
(Pashley等 2006)。所以其在植物遗传图谱构建、
比较作图、种质遗传多样性评价和亲缘关系鉴定
的研究中有很高的使用价值。
目前, EST-SSR的开发已在农作物中广泛应
用, 在水稻、甘蔗、大麦、葡萄、苜蓿和小麦
中已有报道(李卫国等 2008), 而对于木本植物, 在
杏(Decroocq等 2003; Xu等 2004)、猕猴桃(Fraser
等 2004)、云杉(Rungis等 2004)、火炬松(Liewla-
ksaneeyanawin等 2004; 林元震等 2009)、柑橘
(Chen等 2006)、咖啡树(Poncet等 2006)、桉树
(Yasodha等 2008)、茶树(刘振等 2008)、杨树(杨
彦伶等 2008)、白桦(王艳敏等 2008)、鹅掌楸(胥
猛和李火根2008)和橡胶树(Feng等2009)等物种中
也有过报道。本文对 EST-SSR在木本植物中的遗
传图谱构建、种群多样性分析以及种质资源鉴定
的应用现状和存在问题作介绍, 并对其应用前景作
了展望。
1 EST-SSR标记的开发
(1) EST序列可来自实验室构建cDNA文库测
序, 或者公共序列数据库, 后者的EST不仅量大, 而
且可免费下载使用, 已成为开发EST-SSR的主要数
据来源。(2) EST序列的预处理一般采用 cross-
match或Vecscreen软件, 去除载体序列、低质量
EST序列后, 以 Phrap和 CAP3等软件进行聚类和
拼接, 从而得到无冗余的EST数据和尽可能长的重
叠序列。(3) EST-SSR搜索常用软件有 SSRIT、
MISA、SSR Finder和 Repeat Masker等, 用这些软
件可得到的信息有: ESTs的名称、重复碱基、重
复次数、重复碱基在 EST中开始和结束的位置。
(4) EST-SSR的检测。根据 SSR侧翼序列的保守
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性, 采用Primer 5或Oligo设计引物, 对研究材料进
行 PCR扩增, 然后通过电泳或者测序等方法检测,
并进行相关数据处理和分析。
2 EST-SSR标记在木本植物遗传育种研究中的应用
2.1 遗传连锁图谱的构建 遗传图谱的构建是遗传
学研究的重要领域之一, 也是研究种质资源、遗传
育种及基因定位、克隆的基础。基因组 SSR标记
由于标记数量少、物种特异性强, 很难获得高密度
的遗传连锁图, 而近年来 EST-SSR技术的不断发
展, EST-SSR位点已整合到原有的遗传图谱中, 为
构建高密度的多标记复合图谱提供了有力的新技术
手段。目前, EST-SSR 标记主要应用于构建大
麦、小麦、水稻、黑麦、黑麦草等农作物的遗
传图谱(Varshney等 2005)。Han等(2004)以种间回
交BC1 [(陆地棉TM-1×海岛棉Hai7124)×陆地棉
TM-1]为作图群体, 在554对亚洲棉的EST-SSRs引
物中, 有 99对引物检测到多态性, 共扩增到 118个
位点, 其中112个位点整合到原有棉花遗传图谱的
22个连锁群上, 这些位点不是随机地分布在棉花基
因组上, 有 72个位点位于A基因组, 另 37个位点
位于D基因组。Han等(2006)进一步开发了 489对
EST-SSR引物, 有114对引物在两个亲本之间检测
到多态性, 并用于作图群体的遗传图谱构建, 该图
谱整合所有新位点后, 就使原有棉花遗传图谱增加
至 907个位点, 获得了图距为 5 060 cM的遗传图
谱, 标记间的平均间距为 5.6 cM。Silfverberg-
Dilworth等(2006)采用148个新的苹果SSR标记(包
含 31个 EST-SSR)和 8个已知的苹果、梨和欧洲
花楸SSR标记在苹果(Malus×domestica Borkh.)参
考图谱基础上构建了复合遗传图谱, 这些SSR标记
给原参考图谱新增了 168个位点。同时为建立全
基因组作图有效方法, 他们进一步发现了86个可靠
性强和多态性高的SSR标记, 这些SSR标记均匀分
布在苹果基因组中, 覆盖约为 85%苹果基因组, 标
记间的平均间距为 15 cM。
功能基因图谱对于探讨基因组结构、功能与
进化, 以及进行基因克隆和分子标记辅助选择育种
等研究都很重要。由于 EST-SSR来源于基因组编
码区, 其与基因的功能可能密切相关, 因此可以用
于构建功能基因图谱。Guo等(2007)以种间回交
BC1 [(陆地棉 TM-1×海岛棉Hai7124)×陆地棉
TM-1]为作图群体, 采用在两个亲本之间存在多态
性的雷蒙德氏棉EST-SSR, 构建了高密度的遗传图
谱, 其包含 1 790个位点, 分属于26个连锁群, 连锁
标记覆盖的基因组总长为 3 425.8 cM, 标记间平均
间距为 1.91 cM。其所含的 71.96%标记位点具有
相关基因功能, 对1 122个EST-SSR位点相应的975
条EST进行功能预测的结果表明, 475条EST与生
物代谢过程、细胞组分和分子功能等有关, 并找到
一些与棉花纤维发育相关的重要功能基因, 这对进
一步开展棉花的基因组功能和改良其农艺性状等研
究都有意义。
2.2 物种间的通用性和作图比较 近年来的研究表
明, EST-SSR比基因组SSR在物种间具有更高的通
用性(Varshney等 2005)。基因组 SSR大多处于非
编码序列区域, 其侧翼序列往往具有明显的物种特
异性, 因此在不同物种间通用性较差( C hen 等
2006)。而 EST-SSR侧翼序列往往在物种之间高
度保守, 因此从一种植物中开发的EST-SSR可通用
于其它近缘物种, 这不但可丰富标记数量, 而且显
著提高标记的利用价值, 从而为植物功能基因组学
和比较基因组学研究提供新的思路和方法(Pashley
等 2006)。Decroocq等(2003)分别检测了杏(Prunus
armeniaca)和葡萄(Vitis vinifera)的EST-SSR引物各
自在蔷薇科和葡萄科内的转移性, 分析结果发现亲
缘关系越近, 扩增条带质量就越好, 多态性也越高。
此外, 葡萄EST-SSR引物在葡萄科内不同种属间的
转移效率都较高, 而杏EST-SSR引物的转移性仅适
合于李亚属内近缘种。Vendramin等(2007)从桃
(P. persica)的中果皮 cDNA文库序列中开发了 21
对EST-SSR引物, 其中 18对引物在 22个桃基因型
中均能有效扩增出条带, 同时还发现这18对引物在
李属(Prunus)的6个其它植物中均能扩增出预期条
带, 说明EST-SSR在李属近缘种植物之间具有高效
的通用性。胥猛和李火根(2008)用 66对表现多态
的北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera) EST-SSR引
物, 85%在中国鹅掌楸(Liriodendron chinense)中有
扩增, 54%在玉兰(Magnolia denudata)中有扩增, 表
明北美鹅掌楸 EST-SSR引物在中国鹅掌楸以及玉
兰物种之间具有较高的通用性。EST-SSR标记在
种内或种间的高通用性在棉花(Saha等 2003)、松
树(Liewlaksaneeyanawin等 2004)、云杉(Rungis等
2004)、咖啡树(Poncet等 2006)、桉树(Yasodha等
2008)、柑橘(Luro等 2008)和橡胶树(Feng等 2009)
植物生理学通讯 第 45卷 第 12期,2009年 12月 1223
等物种中也得到了证实。
EST-SSR在物种间的转移成功率与物种之间
的亲缘远近有关, 除了在近缘植物种间有较高的转
移率以外, 也有学者报道EST-SSR可在植物不同属
间转移。杨彦伶等(2008)用杨树(Populus)的 48对
基因组SSR引物及48对EST-SSR引物对 6个苏柳
(Salix)品种进行了通用性分析的结果表明, 杨树
EST-SSR引物在柳树中的通用性达 54.2%, 而基因
组 SSR的通用性仅有 10.4%。可见, 杨树EST-SSR
标记完全可以用于柳树群体或品种间的群传多样性
分析, 而且杨树EST-SSR对柳树的通用性明显高于
基因组 S SR。Feng等(2 009 )从橡胶树(Hev ea
brasiliensis)EST序列开发的EST-SSR引物中, 随机
挑选 30对引物进行木薯(Manihot utilissima)、篦
麻(Ricinus communis)和余甘子(Phyllanthus emblica)
等 3种植物的属间转移扩增的成功率为 73.3%, 说
明橡胶树 EST-SSR完全可通用于木薯等 3种属间
植物。Gasic等(2009)研究苹果(Malus×domestica)
的68对EST-SSR引物在蔷薇科中3个属14种植物
中可转移性的结果表明, 在所检测的 14种植物中,
扩增成功率在 25%~59%之间, 在属的水平上, 对
草莓的扩增转移率最高, 可达 49%。以上研究表
明, EST-SSR在近缘或远缘物种之间均有较好的通
用性, 因此可以认为EST-SSR将在植物基因组比较
作图、种质亲缘关系鉴定以及分子系统发育与进
化中有巨大的应用潜力。
EST-SSR在物种间有高通用性, 因此, 在比较
作图中表现出显著的优势。基因组比较作图是对
相关物种通过共同的遗传标记进行物理或遗传作
图, 并分析这些标记在不同物种基因组中的分布特
征, 揭示不同物种基因组间的同源性和差异性, 从
而更好地了解不同物种的基因组结构和基因组进化
历程(覃瑞等 2004)。Chen等(2008)用甜橙(Citrus
sinensis)和枳橙(Poncirus trifoliata)的杂交F1代, 分
离出141个具有多态性的甜橙EST-SSR标记, 分别
构建了甜橙 775.8 cM和枳橙 425.7 cM的遗传图
谱。分析和比较这两张遗传图谱的结果显示, 两个
物种图谱中相应的连锁群之间有明显的共线性, 为
进一步研究甜橙近缘物种的比较作图奠定了基础。
2.3 种群遗传多样性的评价和种质资源的鉴定 遗
传多样性是种群遗传结构特性的重要组成部分, 是
生态系统多样性和物种多样性的基础, 也是物种对
环境适应性的体现, 进行遗传多样性评价对有效保
护、开发和利用种质资源都有极其重要的意义(朱
振东和贾继增2003)。然而对于自然生态环境分布
的野生植物, 尤其是高大木本植物, 其遗传背景往
往是高度杂合, 以往一般多采用 RAPD、AFLP和
ISSR等显性标记, 但不能有效区分杂合体, 从而直
接影响了种群遗传多样性的准确评价(Ellis和Burke
2007)。基因组 SSR虽然是共显性标记, 但因其开
发成本高而导致其应用受到很大限制。由于EST-
SSR在物种间具有高通用性, 通常又代表着某种基
因功能, 还可反映出转录区的差异, 因此用EST-SSR
分析种群遗传多样性时, 有可能将某些外在形态性
状、生理生化特征甚至某个特定的环境适应型与
EST-SSR标记直接联系(Pashley等 2006)。
Xu等(2004)在用21个EST-SSR和8个基因组
SSR分析中国杏树和地中海杏树的系统发育中, 共
检测到112个多态位点, 其中28个位点是中国杏树
特有的, 经聚类分析后, 36份杏树划分为 2个亚类,
其中中国杏树和 1个未知起源的品种聚为一个群,
而其余起源于地中海的杏树则聚为另一个群。这
说明中国杏树的进化历程有别于地中海杏树。Xie
等(2006)采用基因组 SSR和 EST-SSR各 8对分析
了中国扁桃栽培品种(23个)、国际扁桃栽培品种
(15个)、桃和杏的杂交种(2个)以及桃品种(3个)的
遗传多样性的结果表明, EST-SSR平均每对引物扩
增出 7.8个等位基因, 每个位点的观测杂合度(Ho)
为 0.678, 略高于基因组 SSR的扩增。聚类分析表
明, 中国品种和国际品种分别聚成单独的两个群, 而
桃和杏的杂交种与桃品种共同聚成第三个群, 表明
EST-SSR标记是分析植物亲缘关系的有效方法。
刘振等(2008)采用31对EST-SSR引物分析60份西
南茶区茶树遗传多样性和亲缘关系的结果显示, 31
对引物共检测到等位位点137个, 遗传多态性信息
含量(PIC)在 0.09~0.85之间, 观测杂合度(Ho)在
0.07~0.94之间, 说明西南茶区茶树资源的遗传多样
性非常丰富, 从而为茶树育种材料的选择、遗传起
源鉴定和核心种质的分子验证等提供了新的功能标
记和更科学的分析手段。
随着EST-SSR标记的不断开发、发展和应用,
植物种质资源和品种鉴定的方法不断更新。金基
强等(2007)采用 EST-SSR分子标记技术对 42个茶
树进行品种资源分析, 结果显示13对引物可扩增出
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预期条带, 其中 10对引物具有多态性, 平均 PIC值
为0.730, 共检测到84种等位基因型和74个等位变
异, 并将 42个茶树品种划分为3个亚类, 表明EST-
SSR标记是分析茶树资源和品种鉴定的有效方法。
Bassil和Postman (2009)采用梨属的10个EST-SSR
对 81个西洋梨(Pyrus communis)、13个沙梨(P.
pyrifolia)和20个山梨(P. ussuriensis)进行品种鉴定,
UPGMA聚类分析表明, 这114份梨属材料分为2个
大类群, 其中81个西洋梨聚为欧洲梨大类群, 13个
沙梨聚成小组再和 20个山梨聚为亚洲梨大类群。
聚类的结果与梨树来源共同的祖先、地理起源或
成熟时间的事实相一致。说明高通用性的 EST-
SSR非常适合于分析梨树种质资源、鉴定品种以
及寻找梨树嫁接失败的缘由。
3 结语
迄今, 木本植物 EST-SSR的开发尚处于起始
阶段, 其应用范围仍有限, 而且还存在一些不足: (1)
EST-SSR标记与基因组 SSR标记相比, 多态性较
低, 对于基因型高度相似的辨别不如后者(Varshney
等 2005); (2) EST-SSR标记的开发只能限于那些
已知具有大量高质量EST序列的物种(Varshney等
2005); (3) EST-SSR预测软件以及引物设计软件存
在一定的局限性, 因而也影响了EST-SSR标记的准
确性(王艳敏等 2008; Riju等 2009)。
截止2009年10月2日, 美国国立生物技术信息
中心(NCBI)的dbEST公共数据库中共有63 044 586
条 EST, 其中木本植物, 主要集中在松树(Pinus)、
杨树(Populus)、橡胶(Hevea)、柑橘(Citrus)、桉
树(Eucalyptus)、苹果(Malus)、杉树(Picea)、李
树(Prunus)和梨树(Pyrus)等植物上。如此量大而
丰富的 EST序列, 不仅可以发现、分离新基因, 也
可制备DNA芯片用于基因表达和比较基因组的研
究, 而且还可开发分子标记(尤其是 EST-SSR)用于
遗传连锁图谱构建、基因定位等研究。木本植物
EST-SSR研究起步较晚, 但进展相当迅速。有理
由相信, 随着植物基因组学与功能基因组学的不断
发展和研究的深入, 以及生物信息学的逐渐完善, 高
通用性的 EST-SSR必将在构建植物功能基因图
谱、开展基因定位与克隆、研究比较基因组学、
分析种质资源与鉴定品种、揭示植物基因型的环
境适应性等问题中发挥更大和更多的作用。
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