全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 3期, 2010年 3月284
收稿 2009-12-02 修定 　2010-02-10
资助 教育部高等学校博士学科点专项科研基金。
* 通讯作者(E-mail: zhaoshujuan@126.com; Tel: 021-
5 1 3 2 2 5 7 6 )。
长春花次生代谢转录调控的分子机制
周晨, 赵淑娟 *, 胡之璧
上海中医药大学中药研究所国家中医药管理局中药资源与质量标准重点研究室, 上海 201203
Molecular Mechanism of the Transcriptional Regulation to the Secondary Me-
tabolites in Catharanthus roseus
ZHOU Chen, ZHAO Shu-Juan*, HU Zhi-Bi
The SATCM Key Laboratory for New Resources and Quality Evaluation of Chinese Medicines, Institute of Traditional Chinese
Material Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
提要: 本文就长春花体内生物碱生物合成途径中受转录因子调控、外界因素对其诱导和调控以及作用机制的研究进展作
介绍。
关键词: 长春花; 转录因子; 次生代谢; 生物碱
转录因子(transcription factor)是一类序列特异
的DNA结合蛋白, 它能与目的基因启动子区域的序
列相互作用, 调节mRNA的起始合成。它控制着
真核生物正常发育和生理功能所必需的某些基因的
协同表达。植物从外界环境的变化适应当中可获
得合成某些化合物的原料和能量, 这些化合物称为
次生代谢产物, 植物利用这些次生代谢物保护自己
以抵御外界环境的伤害。很多植物的次生代谢产
物具有药理活性, 可用于治疗各种疾病。由于这些
化合物很难用化学方法合成。因此, 植物体是次生
代谢产物的重要来源之一。
生物碱是一类含氮杂环小分子, 它能够帮助植
物抵御草食动物和病原体的侵害。生物碱的生物
合成途径十分复杂, 迄今为止, 其生物合成途径研
究最深入的是长春花[Catharanthus roseus (L.) G. Don]
中的萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids,
TIAs)。长春花是夹竹桃科长春花属的一种药用植
物, 人们已从其根、茎、叶和种子中分离出 100余
种生物碱(van der Heijden等 2004)。其中的单体
( monomer i c )如蛇根碱( s e r pen t i n e )和阿玛碱
(ajmalicine)分别用作安定药物和降低高血压。二聚
体(dimeric)的生物碱如长春碱(vinblastine)和长春新
碱(vincristine)则广泛用来治疗癌症。这些二聚体
的生物碱在植物体内的含量很低( S t - P i e r r e 等
1999)。它们的前体, 长春质碱(catharanthine)和文
多灵(vindoline)就被分离出来用于体外合成长春碱。
为提高生物碱产量, 人们曾经过多方面的尝试,
但没有成功。这可能是因为TIAs合成途径受植物
体本身高度调控(Verpoorte等1999; Hughes等2004;
Whitmer等 2002)。TIAs生物合成途径的研究已发
展到分子水平。人们将注意力集中到调控TIAs生
物合成的启动子序列以及控制这些途径的转录因子
上。如对异胡豆苷合成酶(strictosidine synthase,
STR)和色氨酸脱羧酶(tryptophan decarboxylase,
TDC)基因的研究表明, 这2个基因启动子序列中都
包含与紫外线照射和真菌激发子这样的胁迫信号相
关的调控元件(Ouwerkerk等 1999a, b; Ouwerkerk
和Memelink 1999; Pasquali等 1999)。
1 JERE元件与ORCA2
茉莉酸(jasmonic acid, JA)以及挥发性的茉莉
酸甲酯(methyl jasmonate ester, MeJA)统称为茉莉
酮酸酯(jasmonate)。它作为一种植物胁迫信号, 是
诱导STR和TDC表达中的最重要的第二信使(Menke
等 1999b)。在长春花 STR启动子中, 对激发子和
茉莉酮有应答作用的元件含有GCC盒的核心序列,
是一种称做JERE (jasmonate and the elicitor-respon-
sive element, 茉莉酮酸酯和激发子应答元件)的短序
列(Menke等 1999a)。其他一些高等植物启动子也
已鉴定出不同的 J A 应答元件( J A- r e s pon s i ve
信息与资料 Imformation and Data
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elements, JREs)。如拟南芥的 VSP1启动子(Guer-
ineau等 2003)、马铃薯的 LAP启动子(Boter等
2004)。在马铃薯的蛋白酶抑制剂基因(proteinase
inhibitor PI-II, PIN2)的启动子(Kim等 1992)和大豆
的植物贮存蛋白 B (vegetative storage protein B,
VSPB)的启动子(Mason等 1993)中, JA应答区域中
包含一种类似 G-box的基序; 在拟南芥中, 一种
GCC box介导了 PLANT DEFENSIN1.2 (PDF1.2)
基因启动子对JA的应答(Brown等2003), 它不包含
同G-box类似的序列。烟草的腐胺 -N-甲基转移
酶(putrescine-N-methyltransferase)启动子需要同时
有 G-box和 GCC基序来共同应答茉莉酮(Xu等
2004)。在长春花 STR启动子中, 有人用 JERE作
为酵母单杂交的诱饵, 分离出一个编码 ORCA2
(octadecanoid-responsive Catharanthus AP2-domain
protein 2)的 cDNA。ORCA2是属于植物特异的
AP2/ERF (APETALA2/ethylene-responsive factor,
APETALA2/乙烯应答因子)家族的转录因子, 它结
合到AP2/ERF DNA结合结构域中(Riechmann和
Ratcliffe 2000)。茉莉酮可快速诱导ORCA2的转
录, 通过与 JERE的交互作用而激活 STR的表达。
这些结果表明, ORCA2能控制茉莉酮应答的STR的
表达, 也可能控制其他TIAs生物合成基因的表达。
2 核心转录因子ORCA3
通过T-DNA激活标签技术从长春花细胞中分
离出另一个与 TIAs调控紧密有关的基因ORCA3
(van der Fits和Memelink 2000; van der Fits等 2001)。
ORCA3同样可结合到 JERE元件上激活 STR的表
达。ORCA3的表达也受茉莉酮的诱导(van der Fits
和Memelink 2001), 这表明ORCA2和ORCA3有可
能协同调控着茉莉酮应答的生物碱合成。
在长春花细胞中, ORCA3的过量表达可提高
TDC、STR、CPR [编码细胞色素 P450-氧化还原
酶, 同香叶醇 -10-羟化酶(geraniol-10-hydroxylase,
G10H)共同作用]和脱乙酰氧基文多灵 -4-羟化酶
(desacetoxyvindoline 4-hydroxylase, D4H)这些生物
碱合成基因的表达(图 1)。ORCA3还调控 2个编
码初级代谢的酶邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate
syntha se, ASα)和脱氧核酮糖磷酸合酶(D -1 -
deoxyxylulose 5-phosphate synthase, DXS), 这些酶
与 TIAs前体的形成有关。这些结果说明, ORCA3
图 1 长春花生物碱代谢途径及受ORCA3调控作用示意
前期由来自莽草酸途径的色胺和由甲羟戊酸途径的裂环马
钱子苷, 在异胡豆苷合成酶(STR)催化作用下偶合成异胡豆苷。
后期经多步反应生成的文多灵与长春质碱偶合生成长春碱。实
线: 一步反应; 虚线: 多步反应; 下划线: 在悬浮细胞中受ORCA3
调控的酶。AS: 邻氨基苯甲酸合酶; TDC: 色氨酸脱羧酶; DXS:
脱氧核酮糖磷酸合酶; G10H: 香叶醇 -10-羟化酶; CPR: 细胞色
素 P450-氧化还原酶; STR: 异胡豆苷合成酶; SGD: 异胡豆苷 β-
D糖苷酶; D4H: 脱乙酰氧基文多灵 -4-羟化酶; DAT: 脱乙酰文
多灵乙酰转移酶。
是长春花中 TIAs合成的核心调控子, 它能够调控
TIAs代谢途径中的多步反应, 并且能激活 TIAs前
体的合成。然而, ORCA3不能调控编码G10H和
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脱乙酰文多灵乙酰转移酶(deacetylvindoline acetyltr-
ansferase, DAT)的基因。过量表达ORCA3的转基
因细胞明显积累更多的色氨酸和色胺。当过量表
达ORCA3的细胞加入萜类化合物的前体马钱子苷
(loganin)后, TIAs的产量提高; 而不加马钱子苷的则
检测不到 TIAs。这些结果说明萜类化合物的支路
是受限制的。
在长春花毛状根中, 尽管ORCA3的过量表达
可以受诱导, 但 ORCA3的过量表达并不能提高
TIAs的含量(Peebles等 2009)。当ORCA3过量表
达时, 长春花毛状根中 ASα、DXS、STR、SLS
(secologanin synthase, 开联番木鳖苷合成酶)和ZCT
(zinc finger Catharanthus transcription factor, 锌指
长春花转录因子)的 mR NA 转录本也随之提高;
TDC、G10H、CPR、GBFs (G-box binding factor,
G-box结合因子)和ORCA2保持恒定; SGD降低。
这种变化与长春花悬浮细胞中的实验结果不尽相
同: ASα、DXS和 STR和 G10H的变化一致。而
SGD、TDC和 CPR不一样。在细胞中, 这 3个基
因的转录本在ORCA3过量表达时都提高。在长春
花毛状根和悬浮培养细胞中ORCA3对这些基因的
不同的调控情况说明, 在不同的培养物中TIAs的合
成有不同的调控机制。S L S、Z C T s、G B F s、
ORCA2与ORCA3相互关系的研究未见报道。此
外, 研究还发现, 长春花毛状根中ORCA3不过量表
达, 单独增加 JA含量可以提高 TIAs的合成。
ORCA3基因的表达也受茉莉酸甲酯(MeJA)的
快速诱导, 这意味着ORCA3不仅能够自动调节自
我的表达水平, 还受其上游的启动子的调控(Vom
Endt等 2007)。ORCA3基因上游是一种双节的
(bipartite) JRE启动子, 它是由一种决定ORCA3表
达高低水平的定量序列(quantitative sequence)以及
一种决定 JA应答开 /关的定性序列(qualita tive
sequence)构成的。采用酵母单杂交方法寻找对应
的转录因子, 分离到 4类DNA结合蛋白。其中一
类具有一种单独的AT钩(AT-hook) DNA结合基序
可以与定量序列相结合, 它作为一种激活子可以提
高ORCA3对JA的应答反应。而JRE中的定性序列,
似乎也可以在非诱导期与抑制子相结合。ORCA3
的激活可以同时通过AT钩结合定量序列和定性序
列的去阻遏而实现, 这里的定性序列只能是一种关
闭开关。而在其他的一些实验中, 定性序列在诱导
状态下还能结合bHLH型激活子, 这时抑制子和诱
导子可能是不同的蛋白或者是相同的蛋白(bHLH)
在两种激活状态下的转换。
在ORCA3过量表达的长春花毛状根株系中,
ORCA3的转录本含量大幅度提高。这可能激活一
种反馈抑制的负调控, 可抵消ORCA3转录的提高。
如负调控子 ZCT, 可以通过结合到 STR和 TDC的
启动子而抑制这 2个基因的表达。ORCA3转录本
的增加可同时提高 ZCT1、ZCT2和 ZCT3的转录。
TIAs在转录水平上对 JA的瞬时应答说明, 长
春花是紧密控制 TIAs代谢的, 并且在添加外源 JA
后能很快将整个代谢系统降低到原始水平。最近
有人报道一种在拟南芥中可与 JA调控有关的 JAZ
蛋白家族(Chini等 2007; Thines等 2007), 此蛋白通
常与转录因子结合后可抑制它的活性。JA-异亮
氨酸复合物与COI1的相互作用可促使COI1与JAZ
蛋白结合。结合后 JAZ降解, 进而促使防御基因
和 JAZ蛋白重新转录。这种重新合成的 JAZ又转
而抑制转录因子(Farmer 2007)。这一机制可能在
JA调控 TIAs的过程中发生作用, 但在长春花中还
没有发现 JAZ蛋白家族。
3 其他几种转录因子
尽管ORCA3在调控TIAs代谢过程中起作用,
但它还不足以调控整条代谢途径。还有其他一些
转录因子也与代谢过程相关。用 STR启动子的一
个增强子结构域作为酵母单杂交的诱饵, 分离到与
荷兰芹(parsley)类MYB转录因子BPF1同系的长春
表 1 悬浮细胞和毛状根中ORCA3对关键酶基因作用的比较
基因 悬浮细胞 毛状根
ASα + +
TDC + 无变化
DXS + +
CPR + 无变化
G10H 无变化 无变化
SLS 未见报道 +
STR + +
SGD + -
ZCTs 未见报道 +
GBFs 未见报道 无变化
ORCA2 未见报道 无变化
　　"+ "表示有效果, " -"表示无效果。
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花转录因子 CrBPF1 (Catharanthus roseus box P-
binding factor-1, 长春花 P-box结合因子 1) (van der
Fits等 2000)。CrBPF1受激发子的诱导, 但这个激
发子不是 JA。这说明激发子诱导 STR的表达是经
由茉莉酸依赖和非依赖途径的。STR启动子中还
包含一个植物中保守的启动子元件G-box (5’-CAC
GTC-3’在动物基因中称为 E-box)与 JERE元件毗
连(Sibéril等 2001)。用G-box作为酵母单杂交的
诱饵分离出一个结合于G-box的转录因子 CrGBF
(Catharanthus roseus G-box binding factors, 长春花
G-box结合因子)。CrGBF1和 CrGBF2在 JA和
ORCA3的作用下没有提高, 在长春花中激活CrGBF
的调控信号之一是酵母提取物(yeast extract, YE)。
这表明CrGBF对 STR的作用在特定器官、组织和
细胞中还依赖其他的转录因子。GBF在ORCA3出
现的情况下则可能成为激发子。在长春花中 ,
CrGBF1和CrGBF2会抑制 STR的表达。在其他植
物中, G-box是一种对植物激素、紫外线照射和厌
氧环境这些信号产生有应答的元件, 大多数情况是
作为一个激活子存在的(Menkens等 1995), 只有少
数是抑制子。如大豆的GH3基因的启动子中含有
一种对生长素产生应答的G-box元件, 它可与转录
因子 SGBF-2相结合作用(Liu等 1997)。有人认为,
在长春花中生长素也可能是诱导 CrGBF的激发
子。CrGBF在体外还可以结合TDC启动子上的类
G-box元件, 这说明CrGBF能够协同调控几个TIAs
代谢途径中的基因。钝化CrGBF转录因子可去除
TIAs的阻遏, 尤其是萜类代谢途径。这种效应与
ORCA3过表达相组合, 能够提高TIAs的合成。另
一种 STR启动子的转录因子含有亮氨酸拉链结构
(leucine zipper)和MYC类bHLH的转录因子CrMYC
(Catharanthus roseus MYC-type bHLH transcription
factors) (Pré等 2000)。重组的CrMYC在体外可结
合 STR启动子的G-box。CrMYC的表达则可受 JA
和真菌诱导子诱导。
后来人们又发现可结合STR和TDC启动子的
锌指结合蛋白 ZCT1、ZCT2、ZCT3 (zinc finger
Catharanthus transcription factor, 锌指长春花转录
因子, IIIA型zinc finger转录因子家族的成员) (Pauw
等 2004)。它们能够抑制 STR和 TDC启动子的激
活, 是这 2个启动子的抑制子。真菌诱导子可以诱
导ZCT的表达, YE也能够快速诱导ZCT的表达, 同
时还能增加 JA的水平。JA可提高ORCAs的表达,
ORCAs进而可以激活STR和TDC的转录。因此认
为 Z C T 和 S T R 启动子的结合可抵消 O R CA2、
ORCA3对 STR和 TDC的激活作用。
根据上述研究结果, Peebles等(2009)将一些转
录因子和调控方式概括如图 2所示模式。
4 G10H 和 DAT 的启动子
长春花代谢途径中其他一些关键酶基因启动
子的研究也陆续有报道。G10H是甲羟戊酸途径中
的关键酶。G10H启动子的研究证实, 该启动子可
以为JA和真菌诱导子所诱导, 并且具有组织特异性
(Suttipanta等 2007)。同时还鉴定出 3个可能具有
增强子效果的的顺式元件, 这些区域与STR和TDC
启动子中的元件不同。G10H对ORCAs也没有应
答反应。这说明在 JA诱导G10H转录的调控中可
能存在另一种信号级联传导通路, 因此在TIAs的代
谢途径中很可能还有其他的调控方式和转录因子。
这说明 TIAs合成的调控网络比已知的更为复杂。
文多灵合成的最后一步反应是由DAT催化的,
该基因的转录受到光的诱导。DAT基因上游克隆
到 1 773 bp的启动子序列(Wang等 2010), 其中含
有很多在其他植物中已经鉴定出的光诱导应答元
件。与G10H一样, DAT的表达也不受ORCA转录
因子的调控, 但MeJA仍能诱导DAT的表达。这
说明还有其他转录因子参与了MeJA诱导DAT表达
的过程。在 DAT 启动子中还发现了 3 个连续的
TGACG基序。TGACG基序是从大麦的脂氧合酶
1 (lipoxygenase 1)中鉴定出的与MeJA信号转导有
关的转录因子结合位点(Rouster等 1997)。长春花
生物碱代谢途径中其他关键酶基因如 STR、TDC
和G10H的启动子中尚未发现有TGACG基序。在
大麦脂氧合酶1基因启动子中此序列的定点突变可
促使MeJA的诱导失效, 但长春花DAT启动子中的
此种基序的突变却不能完全消除MeJA的诱导。
5 结语
STR、TDC等基因启动子的分离、克隆的方
法是先构建全基因组文库, 然后用结构基因的片断
做探针, 筛选出与之相连的片断并测序。近年来,
基因组步行(genome walking)实验逐渐成为一种成
熟的克隆上游启动子的手段, G10H、DAT的克隆
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均采用了此方法。目前, 在长春花生物合成关键酶
基因中除 STR、TDC、G10H以及 DAT以外, 其
他的启动子克隆还未见报道。我们实验室用基因
组步行的方法, 也已经克隆到D4H上游部分启动子
序列, 其相关研究还在进行中。
启动子的功能研究主要集中在两个方面: 一是
用酵母单杂交的方法分离、筛选出与启动子元件
相结合的转录因子, 并研究这些转录因子在激活子
的调控下对结构基因的作用; 二是将启动子的不同
片断连接到植物表达载体上, 转化入植物体, 如长
春花和拟南芥, 研究其组织特异性表达。近年来,
瞬时表达测定(transient expression assay)的迅速发
展已成为一种不需要转基因植株、不受环境因素
制约和快速稳定的新方法。启动子片断可通过农
杆菌介导转入长春花细胞中, 可用于研究该片断在
外源激活子作用下的活性。
已有的研究表明, 在长春花的转录因子中, 有
的对多个基因有激活功能, 如ORCAs; 有的只针对
一个基因有激活作用, 如 CrBPF; 有的具有抑制作
用, 如 ZCT; 有的转录因子本身的转录还受其他转
录因子的调控, 如AT钩蛋白调控ORCA3等。这
些转录因子的作用, 不仅受外界环境因素的作用(如
JA), 还受植物体内多种生理功能严密控制。加入
JA后, ORCA3的过量表达虽然有提高, 但并不能增
加TIAs的转录, 这暗示可能还有其他更多的正向转
录因子存在, 需要深入研究。为了提高 TIAs的合
成, 不仅要过量表达正调控因子, 还要抑制负调控
因子, 在这两者中间取得平衡。只有对整个复杂的
调控网络取得更加深刻的了解以后, 人们才可能采
用这些工具, 为未来这一领域的基因工程建立基础。
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图 2 长春花 STR和 TDC基因启动子的调控(Peebles等 2009)
激发子打开钙离子通道, 钙离子浓度提高后产生更多的茉莉酸。茉莉酸激活 ORCA转录因子后, STR和 TDC 的表达提高。茉
莉酸同时还增加 ZCT的转录, ZCT 可抑制 STR和 TDC 的表达。钙离子通道还可提高 CrBPF1 的含量。CrGBF可抑制 STR的表达。
植物生理学通讯 第 46卷 第 3期, 2010年 3月 289
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