全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 3期, 2010年 3月 263
利用 Imaging-PAM研究莱茵衣藻对环境变化的响应
段晓琼 1, 唐秋菊 1, 褚胜利 2, 杜林方 1,*
1四川大学生命科学学院, 生物资源与生物环境教育部重点实验室, 成都 610065; 2上海泽泉科技有限公司, 上海 200333
提要: 本文介绍了 Imaging-PAM-M-Series调制叶绿素荧光成像技术在莱茵衣藻活体叶绿素荧光检测中的应用。该方法利
用CCD对藻体直接成像, 可同时检测多个样品。后期分析可获得图像中任意区域的初始荧光产量(Fo)、充分暗适应后PSII
的最大光化学效率(Fv/Fm)、PSII光化学能量转化的有效量子产量[Y(II)]、光化学淬灭系数(qP)、非光化学淬灭系数(NPQ)等
指标。文章以敌草隆[3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea, DCMU]和没食子酸丙酯(propyl gallate, PG)对莱茵衣藻野生
型及其抗DCMU突变体的影响为例, 说明该技术在莱茵衣藻研究中是可靠的, 具有简单、快速、灵敏等特点。
关键词: Imaging-PAM; 莱茵衣藻; 叶绿素荧光
Research of Physiological Responses of Chlamydomonas reinhardtii to Envi-
ronmental Changes Utilizing Imaging-PAM
DUAN Xiao-Qiong1, TANG Qiu-Ju1, CHU Sheng-Li2, DU Lin-Fang1,*
1Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment, Ministry of Education, School of Life Sciences, Sichuan University,
Chengdu 610065, China; 2Zeal Quest Scientific Technology Co., Ltd., Shanghai 200333, China
Abstract: The application of Imaging-PAM in the study of physiological responses of Chlamydomonas reinhardtii
to environmental stresses was introduced. This technique can image several samples immediately and
simultaneously. With this technique the minimum fluorescence yield (Fo), the maximal efficiency of PSII in a
dark-adapted state (Fv/Fm), the effective quantum yield of PSII [Y(II)], the photochemical quenching parameter
(qP) and the nonphotochemical quenching parameter (NPQ) can be monitored. A case with the effect of DCMU
[3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea] and PG (propyl gallate) on Chlamydomonas reinhardii wide-type strain
and its DCMU-resistant mutant was carried. It demonstrated that this technique was reliable, simple, rapid and
sensitive.
Key words: Imaging-PAM; Chlamydomonas reinhardtii; chlorophyll fluorescence
收稿 2010-01-15 修定 　2010-02-01
资助 教育部新世纪人才资助计划(NCET-04-0861)和四川大
学 “ 9 8 5 ” 计划项目。
* 通讯作者(E-mail: dulinfang@yahoo.com; Tel: 028-
8 5 4 1 5 0 0 8 )。
藻类在水生食物链中发挥着关键作用。莱茵
衣藻的光合系统与高等植物相似, 是一种研究光合
作用的模式生物(Minagawa和Takahashi 2004)。此
外, 莱茵衣藻还具有结构简单、生长迅速、生长
条件可控、遗传背景清楚、对环境变化敏感、基
因测序已完成(Merchant等 2007)等优点。因此, 该
单细胞真核模式生物常被用来研究环境变化对光合
作用的影响(Hanikenne 2003)。
将绿色植物含有叶绿素的组织或单细胞藻悬
液于黑暗环境中适应数分钟后, 经适当的激发光激
发, 用荧光计检测可发现一种微弱的, 强度随时间
变化的叶绿素荧光信号(Govindjee 1995)。藻细胞
内的叶绿素荧光信号包含了十分丰富的光合作用信
息(Papageorgiou 2004), 其特征又极易随外界环境
条件的变化而变化。因此, 活体叶绿素荧光技术可
作为一种简便、快速、灵敏、无损伤的理想方
法来研究多种逆境因子对微藻光合作用的影响
(Lippemeier等 1999; Beardall等 2001; Young和
Beardall 2003)。叶绿素荧光分析可作为监测重金
属胁迫下藻类光合作用变化的一个有效的生理工
具, 而室温叶绿素荧光的变化与光系统 II (PSII)的
活力密切相关(Lu等 2000)。但是, 以往的荧光仪
只能测定一个样品, 对一批相同或不同处理样品需
要分别测定, 操作不当时影响测定的准确性和严谨
性。调制荧光成像系统 Imaging-PAM采用LED光
源和CCD检测器, 能对所测各参数进行成像, 可以
检测每个像素点的光合作用, 同时测定多个样品。
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第 46卷 第 3期, 2010年 3月264
后期分析时, 各样品任意区域的相应参数值均可导
出, 通过相关软件进一步分析。本文利用 Imaging-
PAM, 考察了除草剂DCMU以及抗氧化剂没食子酸
丙酯(PG)对莱茵衣藻活体荧光的影响, 建立了一种
简单有效快速的检测除草剂等化学品的方法, 探讨
了 Imaging-PAM在莱茵衣藻对环境响应研究中的
应用。
材料与方法
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii P. A.
Dangeard)野生型 CC-124与抗DCMU突变株 CC-
2473购自美国杜克大学衣藻研究中心。将莱茵衣
藻室温(22±1) ℃培养于灭菌的TAP培养液中(Harris
1989), 在 50 μmol·m-2·s-1白色光源下每天照射 14 h
(袁瀚等 2008)。
培养至对数生长期的藻细胞调节至一定浓度
[5 μg (Chl)·mL-1], 室温下暗置1 h, 分成若干份, 分别
进行药物或温度处理。药物处理时加入除草剂
DCMU或没食子酸丙酯(PG), 使其终浓度分别为 6
μmol·L-1和 0.1 mmol·L-1。温度处理组分别置于 4、
15和 40 ℃处理 30 min。
采用德国Walz公司的Imaging-PAM-M-Series
叶绿素荧光仪进行叶绿素荧光诱导动力学曲线和快
速光响应曲线的测定。测定叶绿素荧光诱导动力
学曲线时, 先用弱光照射测定初始荧光(Fo), 随后进
行饱和脉冲光(2 800 μmol·m-2·s-1)处理, 一个脉冲后
关闭, 得到黑暗中的最大荧光(Fm), 打开可以引起
藻光合作用的作用光(75 μmol·m-2·s-1), 当荧光基本
稳定时测定稳态荧光(Fs), 之后再进行饱和脉冲光
处理, 一个脉冲关闭后, 得到光化光下的最大荧光
(Fm’)。充分暗适应 PSII的最大光化学效率(Fv/Fm)、
表观电子传递速率(ETR)、PSII光化学能量转化
的有效量子产量[Y(II)]、光化学淬灭系数(qP)、非
光化学淬灭系数(NPQ)等各参数数值均是在选定模
式下系统自动计算生成。利用 Imaging-PAM测定
样品的快速光响应曲线, 将经过光适应 5 min的样
品, 暴露在连续光强梯度(PAR 1、5、9、15、
23、33、45、59、75、93、135、159和 195
μmol·m-2·s-1)下, 每步 20 s, 测定相对电子传递速率
ETR及其他荧光参数。
成像图直接导出观察, 各参数值导出后, 通过
Origin软件进一步分析。
结果与讨论
1 DCMU 和 PG 对莱茵衣藻叶绿素荧光诱导动力
学曲线的影响
利用 Imaging-PAM对未处理与不同药物处理
藻细胞多次测定时, 重复性好, 图 1显示的是其中
一次的成像图。图 1中分析所得数据显示, 未处理
莱茵衣藻均具有较低的初始荧光产量 Fo和较高的
PSII潜在最大量子产量 Fv/Fm, 而野生型莱茵衣藻
的 Fo为 0.125, Fv/Fm为 0.693, 分别高于DCMU耐
受性突变株(Fo为 0.107, Fv/Fm为 0.599)。DCMU
处理显著影响野生型莱茵衣藻的叶绿素荧光, 6
μmol·L-1 DCMU处理 30 min时, Fo增加了 78%,
Fv/Fm减小了 42%。Fo是 PSII反应中心处于完全
开放时的荧光产量, 其值的增加往往与类囊体膜受
损程度成正比, 而 Fv/Fm反映了植物潜在光合能
力。DCMU耐受性突变株 CC-2473经相同浓度
DCMU处理相同时间时, Fo仅增加21%, Fv/Fm仅下
降了 10%。这与突变株CC-2473对DCMU具有一
定的耐受力相关。
图 2中分析所得数据显示, 生长于温度 22 ℃
下藻细胞放置在 15 ℃下 30 min后, Fv/Fm为 0.524,
与未处理(0.693)相比, 减小了 24%; 4 ℃放置时,
Fv/Fm为 0.457, 减小了 34%; 而 40 ℃放置时, Fv/Fm
为 0.497, 仅减小 28%。温度高于或低于生长温度,
均使莱茵衣藻 Fv/Fm减小, 且低温处理对莱茵衣藻
Fv/Fm的影响大于高温处理, 说明莱茵衣藻 PSII对
低温处理更敏感。通常绿藻的 Fv/Fm在 0.7左右
(Häder等 1999)。我们的结果表明, 莱茵衣藻对温
度变化感受极为灵敏。
未处理莱茵衣藻具有较高的电子传递速率
(ETR)与PSII的实际量子产量Y(II), 而野生型莱茵
衣藻 ETR为 4.35 μmol·m-2·s-1, Y(II)为 0.13, 分别高
于DCMU耐受性突变株的ETR与Y(II), 约20% (图
3)。DCMU处理显著影响野生型莱茵衣藻的 ETR
及Y(II), 均为 0。此结果说明加入的DCMU阻断
了 PSII电子传递, 使 PSII反应中心失活。DCMU
耐受性突变株CC-2473因psbA基因的突变, 编码的
D1蛋白QB结合位点上的第264位丝氨酸突变为丙
氨酸(Fttp://www.chlamy.org/strains/2401_2500/
植物生理学通讯 第 46卷 第 3期, 2010年 3月 265
图 2 温度对莱茵衣藻 Fv/Fm的影响
Fig.2 Effect of temperature on Fv/Fm of C. reinhardtii
1: 40 ℃; 2: 4 ℃; 3: 15 ℃。每个子图上的数字为测定值, 单
位为任意单位。
图 1 DCMU和 PG处理对莱茵衣藻 Fo和 Fv/Fm的影响
Fig.1 Effects of DCMU and PG on Fo and Fv/Fm of C. reinhardtii
1、4: 对照; 2、5: 6 μmol·L-1 DCMU处理; 3、6: 0.1 mmol·L-1 PG 处理。1~3为 CC-124; 4~6为 CC-2473。每个子图上的数
字为测定值, 单位为任意单位。
2473.html), 影响了与DCMU的结合。此时耐受性
突变株电子传递速率仅为未处理时的 24%。有文
献报道, DC M U 可能存在 Q B以外的结合位点
(Kaminskaya等2007), 我们观察到的DCMU耐受性
突变株叶绿素荧光参数也受DCMU的轻微影响证
图 3 DCMU和 PG处理对莱茵衣藻 ETR和Y(II)的影响
Fig.3 Effects of DCMU and PG on ETR and Y(II) of C. reinhardtii
1: 对照; 2: 6 μmol·L-1 DCMU处理; 3: 0.1 mmol·L-1 PG处理。
实了这一点。此外, 如果DCMU浓度增大(10 μmol·L-1),
两种藻的 Fv/Fm和 ETR值均会为 0。100 μmol·L-1
PG短时间处理, 对两种莱茵衣藻的叶绿素荧光参数
中 Fo、Fv/Fm、ETR及 Y(II)的影响不大, 无显著
差异。
2 DCMU 和 PG 对莱茵衣藻快速光响应曲线的影
响
分别分析电子传递速率(ETR)、PSII的有效
量子产量[Y(II)]、光化学猝灭系数(qP)以及非光化
学猝灭系数(NPQ)随光照强度变化, 图 4是莱茵衣
藻的快速光响应曲线。结果显示, 未处理的莱茵衣
藻的 ETR值与NPQ值随光照强度的增加而增加,
Y(II)值与 q P值随光照强度的增加而迅速减小。
CC-124中加入DCMU后, ETR、Y(II)与 qP均迅速
降为 0, 而NPQ也减小, 并随光照强度的增加而增
加。说明加入DCMU后, 莱茵衣藻电子传递完全
植物生理学通讯 第 46卷 第 3期, 2010年 3月266
被阻断, 对藻体造成极为严重的伤害。qP为光化学
猝灭系数, 其值主要反应 PSII反应中心的开放程
度。NPQ为非光化学猝灭系数, 反映 PSII天线色
素吸收的光能以热的形式耗散的那部分能量, 当受
到轻微胁迫时, 热耗散增多, 以缓解过剩的激发能
对 PSII反应中心的破坏作用。CC-2473中加入
DCMU, 在光强低于 100 μmol·m-2·s-1时, ETR仍保
留了36%, 光强高于100 μmol·m-2·s-1时下降为0, 进
一步证明CC-2473具有一定的DCMU耐受力。PG
的加入对 ETR、Y(II)及 qP影响不大, 但是NPQ则
有明显的增大, 说明加入 PG后, PSII潜在的热耗
散增强, 对藻体具有一定的保护作用。
3 Imaging-PAM应用于莱茵衣藻研究时的重要影
响因素
Imaging-PAM应用于莱茵衣藻时温度与光照
强度是影响实验的重要因素。图 2中显示莱茵衣
藻对温度变化感受极为灵敏。此外, 莱茵衣藻对光
照也敏感, 测定荧光诱导曲线时作用光光强的设置
应适宜, 如果设置过大, 高于生长光强, 影响荧光参
数的准确性。我们选择作用光强为 186 μmol·m-2·s-1
时, 莱茵衣藻的 ETR等荧光参数均降为 0。
综上, Imaging-PAM调制荧光成像系统不仅能
直接成像, 而且能同时测定多个有用的参数, 分析
结果更加全面、方便、可靠。随着人们对藻类
生活环境变化的广泛关注, 该技术可能在藻类研究
中得到广泛的应用。
参考文献
袁瀚, 韩璐, 杜立波, 田秋, 刘科, 杜林方, 刘扬(2008). 单细胞光合
生物莱茵衣藻光系统 II产生超氧阴离子自由基的 ESR研究.
生物化学与生物物理进展, 35: 1065~1069
Beardall J, Berman T, Heraud P, Kadiri M, Light B, Patterson G,
Roberts S, Sahan E, Schulzberger B, Urlinger U et al (2001).
A comparison of methods for detection of nutrient limita-
tion in microalgae. Aquat Sci, 63: 107~121
Govindjee (1995). Sixty-three years since Kautsky: chlorophyll a
fluorescence. Aust J Plant Physiol, 22: 131~160
Häder DP, Lebert M, Jiménez C, Salles S, Aguilera J, Flores MA,
Mercado J, Vinegla B, Figueroa FL (1999). Pulse amplitude
图 4 莱茵衣藻叶绿素荧光的快速光响应曲线
Fig.4 The rapid-light-curve of chlorophyll fluorescence of C. reinhardtii
□: 对照; ○: DCMU处理; ☆: PG处理。实心代表 CC-124, 空心代表 CC-2473。
植物生理学通讯 第 46卷 第 3期, 2010年 3月 267
modulated fluorescence in the green macrophytes, Codium
adherens, Enteromorpha muscoides, Ulva gigantea and Ullva
rigida , from the Atlantic coast of Southern Spain. Environ
Exp Bot, 41: 247~255
Hanikenne M (2003). Chlamydomonas reinhardtii as a eukary-
otic photosynthetic model for studies of heavy metal ho-
meostasis and tolerance. New Phytol, 159: 331~340
Harris EH (1989). The Chlamydomonas Sourcebook. New York:
Academic Press
Kaminskaya O, Shuvalov VA, Renger G (2007). Evidence for a
novel quinone-binding site in the photosystem II (PSII) com-
plex that regulates the redox potential of cytochrome b559.
Biochemistry, 46: 1091~1105
Lippemeier S, Hartig P, Colijn F (1999). Direct impact of silicate
on th e pho tos yn the t i c pe r form a nc e of the d ia t om
Thalassiosira weissflogii assessed by on- and off-line PAM
fluorescence measurements. J Plankton Res, 21: 269~283
Lu CM, Chau CW, Zhang JH (2000). Acute toxicity of excess
mercury on the photosynthetic performance of cyanobacterium,
S. platensis— assessment by chlorophyll fluorescence analysis.
Chemosphere, 41: 191~196
Merchant SS, Prochnik SE, Vallon O, Harris EH, Karpowicz SJ,
Witman GB, Terry A, Salamov A, Fritz-laylin LK, Maréchal
DL et al (2007). The Chlamydomonas genome reveals the
evolution of key animal and plant functions. Science, 318:
245~251
Minagawa J, Takahashi Y (2004). Structure, function and assem-
bly of photosystem II and its l ight-harvesting proteins.
Photosynth Res, 82: 241~263
Papageorgiou GC (2004). Fluorescence of photosynthetic pig-
ments in vitro and in vivo. In: Papageorgiou GC, Govindjee
(eds). Advances in Photosynthesis and Respiration. Chloro-
phyll a Fluorescence: A Signature of Photosynthesis. Vol 19.
Dordrecht: Springer, 43~63
Young EB, Beardall J (2003). Photosynthetic function in
Dunaliella tertiolecta (Chlorophyta) during a nitrogen star-
vation and recovery cycle. J Phyco1, 39: 897~905