全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月 583
星星草脱氢抗坏血酸还原酶(PtDHAR) cDNA的克隆及表达分析
聂玉哲, 张晓磊, 许志茹, 张旸, 李玉花 *
东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨 150040
提要: 脱氢抗坏血酸还原酶是抗坏血酸代谢循环中的关键酶, 在多种植物中与抗胁迫相关。为了获得抗盐碱植物星星草中
该基因序列, 利用RACE技术, 从星星草中克隆出脱氢抗坏血酸还原酶基因(PtDHAR)的 cDNA全长序列, 其GenBank登录
号为HM125046。PtDHAR cDNA核苷酸序列长度为 987 bp, 开放阅读框为 639 bp, 编码 213个氨基酸。该基因编码的氨基
酸序列与水稻、小麦等禾本科作物具有很高的同源性。Northern 杂交分析表明, 该基因在盐碱胁迫下表达量显著升高。
关键词: 星星草; 脱氢抗坏血酸还原酶; 基因克隆; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of Dehydroascorbate Reductase Gene
(PtDHAR) in Puccinellia tenuiflora (Griseb.) Scribn. et Merr.
NIE Yu-Zhe, ZHANG Xiao-Lei, XU Zhi-Ru, ZHANG Yang, LI Yu-Hua*
College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: Dehydroascorbate reductase (DHAR) is the key enzyme in ascorbate metabolic cycle which was
reported related with stress resistant in many plants. RACE technology was employed to obtain full-length
cDNA from Puccinellia tenuiflora named PtDHAR (GenBank accession number HM125046), which was 987
bp length. The open reading frame encoding 213 amino acids which had a high identity with DHAR from Oryza
sativa and Triticum aestivum. Northern blotting analysis showed that the expression level of PtDHAR under
saline-alkali stress was significantly up-regulated than that with no stress.
Key words: Puccinellia tenuiflora; dehydroascorbate reductase; gene clone; expression analysis
收稿 2010-04-19 修定 　2010-05-12
资助 国家科技部 “863” 项目(2006AA10Z129, 2008AA10Z156)
和黑龙江省科技计划(攻关)项目(GB06B1 12-5)。
* 通讯作者(E-ma i l : lyhsh en@1 2 6 .c om; T el : 0 4 5 1 -
8 2 1 9 1 7 3 3 )。
脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,
DHAR)能够催化脱氢抗坏血酸还原为抗坏血酸。抗
坏血酸(L-ascorbic acid, AsA)又名维生素C, 是植物
细胞中一种重要的抗氧化剂(Amin 2010)。抗坏血
酸-谷胱甘肽活性氧清除系统在抗氧化胁迫反应中
起着关键的作用(Krishnan等 2009)。在这个系统
中, AsA自身被氧化为单脱氢抗坏血酸(monodehy-
droascorbate, MDA)。一部分MDA在单脱氢抗坏血
酸还原酶(monodehydroascorbate reductase, MDHAR)
的催化下还原为AsA, 另一部分MDA被氧化为脱
氢抗坏血酸(dehydroascorbate, DHA)。DHAR以谷
胱甘肽(glutathion, GSH)为底物, 催化DHA还原为
AsA (图 1)。DHAR可使AsA循环利用, 促进植物
体内AsA的增加(Chen等 2003), 是AsA在植物体
内循环的一个重要途径(Ishikawa等 2006)。盐碱
环境胁迫使植物体内活性氧(reactive oxygen species,
ROS)代谢系统的平衡被破坏, 活性氧水平增高, 过
量的活性氧对具有细胞毒害作用(Ashraf和Harris
2004)。因此, DHAR在保护细胞组分抵御氧化损
图 1 AsA-GSH活性氧清除系统作用模式
Fig.1 The model of AsA-GSH ROS scavenging system
APX: 抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase); MDA: 单
脱氢抗坏血酸; MDHAR: 单脱氢抗坏血酸还原酶; AsA: 抗坏血
酸; DHA: 脱氢抗坏血酸; DHAR: 脱氢抗坏血酸还原酶; GSSG:
氧化型谷胱甘肽(oxidizided glutathione); GSH: 谷胱甘肽; GR: 谷
胱甘肽还原酶(glu ta thione reductase)。
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伤中发挥重要作用(Yabuta等 2002; Kwon 等 2003;
余春梅等 2009), 特别是参与了植物抵御盐胁迫的
反应(Ushimaru等 2006)。
星星草为禾本科碱茅属多年生草本植物, 其耐
盐、耐碱性均较强, 在土壤 pH值达到 10、表土
含盐量达到5 %时仍能生长良好, 是进行植物耐盐
碱机理研究的良好材料。本研究以星星草为试材,
用RACE方法克隆了星星草PtDHAR基因, 并对其
在盐碱胁迫下的表达情况进行了分析, 为在分子水
平上研究星星草耐盐碱机制、深入了解DHAR基
因的功能奠定了试验基础。
材料与方法
星星草[Puccinellia tenuiflora (Griseb.) Scribn. et
Merr.]种于温室中, 土壤条件为草炭土: 珍珠岩: 蛭石
(3: 2: 1), 温度约为25 ℃, 光照强度约为400 μmol·m-2·s-1,
相对湿度 65%~75%, 8周龄时用于试验处理。
感受态大肠杆菌 Top10购自 TaKaRa公司,
pBS-T载体购自TIANGEN公司, DNA纯化回收试
剂盒购自 TOYOBO公司, Trizol Reagent购自
Invitrogen公司, SMARTTM RACE cDNA Amplifica-
tion Kit购自 BD Biosciences公司, LA Taq DNA聚
合酶购自TaKaRa公司, 引物合成及DNA测序均由
上海生物工程有限公司完成。
按照说明书用Trizol试剂提取星星草地上部总
RNA, 用RACE试剂盒构建 cDNA库。根据我们获
得的DHAR EST序列(GenBank登录号为HM125046)
设计 5及 3序列基因特异性引物GSP1和GSP2。
50 μL PCR反应体系中含有1×LA Taq缓冲液、200
μmol·L-1 dNTPs、50 ng引物、0.5 μL LA Taq DNA
聚合酶、100 ng cDNA模板。5序列扩增条件
为: 94 ℃预变性2 min; 94 ℃ 30 s, 68 ℃ 30 s, 72 ℃
3 min, 35个循环; 72 ℃延伸 8 min。3序列扩增条
件为: 94 ℃预变性30 s; 94 ℃ 5 s, 68 ℃ 4 min, 35个
循环; 72 ℃延伸 8 min。PCR产物经连接到 pBS-T
载体、转化 Top10感受态细胞后挑选白斑阳性克
隆, 经 PCR验证后测序。
将测序得到的5和3序列用CAP3软件进行拼
接后设计全长引物 P1和 P2。PCR反应体系同上,
反应条件为94 ℃预变性2 min; 94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s,
72 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃延伸 10 min。扩增产
物的克隆和测序同上。所得序列与GenBank数据
库中序列进行比对, 并用Clustal软件对同源蛋白质
序列进行比较和分析; 使用 NCBI提供的 ORF-
finder与保守区数据库(conserved domain database,
CDD)分别进行基因开放阅读框分析与蛋白保守结
构域分析; 用 ExPASY软件计算蛋白的理论分子
量、等电点、不稳定系数及疏水性; 用LOCSVMPSI
软件对其蛋白质亚细胞定位进行预测; 用MEGA4
软件构建系统发生树。
为了检测星星草 PtDHAR基因与盐碱逆境的
应答关系, 利用 Na2CO3模拟盐碱胁迫, 对星星草
PtDHAR基因的表达特性进行Northern杂交检测。
将 8周龄星星草用0、50、100、150和 200 mmol·L-1
Na2CO3分别处理 24 h后取其地上部, 另用 200
mmol·L-1 Na2CO3处理星星草 0、2、6、12和 24
h后取其地上部。按照说明书用Trizol试剂提取经
Na2CO3处理的星星草总RNA, 取10 μg于1.0 %的
甲醛琼脂糖变性凝胶上电泳, 并转移到Hybond-N+
尼龙膜上, 65 ℃预杂交1 h, 用地高辛标记的PtDHAR
基因探针 65 ℃杂交 1 h, 显影, 通过Northern杂交
检测 PtDHAR基因的表达变化。
结果与讨论
1 星星草 PtDHAR基因全长 cDNA序列的克隆和
分析
本研究从构建的星星草RACE cDNA文库中克
隆得到脱氢抗坏血酸还原酶基因, 将此基因命名为
PtDHAR (GenBank登录号HM125046)。其 cDNA
序列全长 987 bp, 5非翻译区 75 bp, 3非翻译区
273 bp, 开放阅读框(ORF)区域为 639 bp, 编码 213
个氨基酸(图 2)。该基因编码蛋白的预测分子量为
23.4 kDa, 且 LOCSVMPSI软件分析该蛋白存在于
细胞质中, 与水稻DHAR1一致(Urano等2000)。理
表 1 本研究中所用的引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称 序列(5→ 3)
GSP1 ATGGACGCTGGTCAGGGTTTCGG
GSP2 CCTTCGTCAAGACCAAGCCCACC
P 1 GCGGATCACCACTACAAC
P 2 ATGCAAGAAGAGGCTCAC
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论等电点(pI)为 6.60; 负电荷残基总数(Asp+Glu)为
26, 正电荷残基总数(Arg+Lys)为25; 不稳定系数为
22.08, 属于稳定蛋白; 亲水性(grand average of
hydropathicity, GRAVY)值为−0.156, 说明此蛋白属
于亲水蛋白。
2 PtDHAR同源性分析
通过NCBI BlastX对PtDHAR基因进行同源氨
基酸序列搜索, 星星草PtDHAR基因编码的氨基酸
序列与其它物种的DHAR具有很高的相似性(图3),
在 62%~91%, 其中与禾本科植物小麦、水稻的相
似性最高, 分别为 91%和 83% (表 2)。系统发生
树结果显示, 星星草PtDHAR基因编码蛋白与单子
叶植物的DHAR为同一起源, 并与小麦的同源性最
高, 在进化上属同一种分支(图 4)。
3 PtDHAR基因编码蛋白序列的保守性分析
利用 NCBI 的蛋白保守区数据库(CDD)对
PtDHAR编码的氨基酸序列进行蛋白保守区预测。
结果显示, PtDHAR基因编码的蛋白具有 2个保守
区, 分别是GST的N末端(GST-N-family)和GST的
C末端亚家族(GST-C-DHAR)。水稻 DHAR1
(Urano等2000)及青花菜BoDHAR(张国裕等2006)
表 2 PtDHAR基因编码蛋白与其它植物DHAR蛋白的同
源性分析
Table 2 Homology analysis of the deduced amino acid
sequences coded by PtDHAR with other plants’ DHAR
sequences
物种 GenBank登录号 氨基酸残基 /个 相似性 /%
小麦 AAL71854 212 9 1
水稻 BAA90672 213 8 3
马铃薯 ABA46750 210 7 2
烟草 AAL71857 212 7 1
拟南芥 AAM65005 213 7 0
荠菜 AAN04049 217 6 2
蒺藜苜蓿 AAY85185 264 6 2
图 2 PtDHAR cDNA的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig.2 The cDNA and deduced amino acid sequences of PtDHAR
5及 3 引物序列、GST-N-family及 GST-C-DHAR 保守区分别用浪线、单线和双线标记。左右两侧的数字分别标注核苷酸及
氨基酸的位置。
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图 3 不同植物来源的DHAR氨基酸序列比对
Fig.3 Comparison of the amino acid sequences of DHAR in different plants
比对序列为星星草(Puccinellia tenuiflora, GenBank登录号HM125046)、小麦(Triticum aestivum, GenBank登录号 AAL71854)、
水稻(Oryza sativa , GenBank 登录号 BAA90672)、马铃薯(Solanum tuberosum , GenBank 登录号 ABA46750)、烟草(Nicotiana
tabacum , GenBank 登录号 AAL71857)、拟南芥(Arabidopsis thaliana , GenBank 登录号 AAM65005)、荠菜(Brassica juncea ,
GenBank登录号 AAN04049)和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula, GenBank登录号 AAY85185)。
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都属于GSH依赖型DHAR, 且含有GST-C-DHAR保
守区, 由于PtDHAR编码的蛋白C末端与N末端都
存在与谷胱甘肽连接的保守区(图5), 表明PtDHAR
编码的蛋白具有高度的保守性, 且可能与GSH偶联
参与到AsA-GSH抗氧化系统中。
4 盐碱胁迫下PtDHAR基因的表达分析
用不同浓度的 Na 2CO 3对星星草进行处理,
Northern杂交结果表明50~200 mmol·L-1 Na2CO3处
理 24 h后植株地上部 PtDHAR的表达量均比未处
理对照植株有明显的增加, 且在 100~200 mmol·L-1
Na2CO3高浓度盐碱胁迫下表达量要高于50 mmol·L-1
Na2CO3水平, 说明该基因表达量与盐碱胁迫的程度
具有一定的相关性(图 6)。
选择200 mmol·L-1 Na2CO3对星星草进行处理,
并进行时间梯度的表达分析。Northern 杂交结果
表明, PtDHAR基因在无盐碱处理的样品(0 h)中有
少量表达; 盐碱处理 2 h和 6 h后表达量增加; 12 h
后表达量有所回落, 24 h后表达量又上升, 且在24 h
的表达量明显高于 2 h 和 6 h 的表达量, 说明该基
因的表达与胁迫时间具有一定的相关性, 由于盐碱
胁迫 12 h 的取样在夜间, 植物在昼夜代谢中存在
活性氧代谢差异(Apel和 Hirt 2004), 因此该时间
点下PtDHAR基因的表达量回落可能与光照相关
(图 7 )。
本研究利用RACE技术, 从星星草中克隆出脱
氢抗坏血酸还原酶基因(PtDHAR)的 cDNA全长序
列, 该基因在盐碱胁迫下表达量显著升高, 其编码
的氨基酸序列与水稻、小麦等禾本科作物具有很
高的同源性。作为潜在的植物抗盐碱基因资源,
PtDHAR经过更深入的功能研究后可能具有重要的
应用价值。
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图 4 各物种DHAR进化树分析
Fig.4 Phylogenic analysis of DHAR in various plant species
图 5 PtDHAR基因编码蛋白的氨基酸保守区
Fig.5 The conserved domain of PtDHAR
图 6 不同浓度Na2CO3处理后 PtDHAR基因的表达
Fig.6 PtDHAR expression after different Na2CO3 concentra-
tion stress
0、5 0、1 0 0、1 5 0 和 2 0 0 分别表示 0、5 0、1 0 0、1 5 0
和 200 mmol·L-1 Na2CO3处理。
图 7 200 mmol·L-1 Na2CO3处理不同时间后 PtDHAR基因
的表达
Fig.7 PtDHAR expression after time gradient stress with 200
mmol·L-1 Na2CO3
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