全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (10): 1719~1728　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0273 1719
收稿 2015-05-15　　修定 2015-08-25
资助 国家自然科学基金(31260568和31160060)。
* 通讯作者(E-mail: tspaulzhao@163.com; Tel: 0938-8362830)。
拟南芥PKS5激酶磷酸化ABI5参与植物ABA响应
赵菲佚*, 焦成瑾, 陈荃, 王太术, 田春芳, 高雅梅
天水师范学院生物工程与技术学院, 甘肃天水741001
摘要: 植物激素脱落酸(abscisic acid, ABA)在植物生长、发育及环境胁迫中起着重要的作用。本研究发现拟南芥PKSes
(SOS2-like protein kinases)蛋白激酶家族成员PKS5 (SOS2-like protein kinase 5)参与植物ABA响应。PKS5功能获得性点突
变体pks5-3与pks5-4表现出对ABA的敏感表型。在外源ABA处理下, pks5-3与pks5-4种子萌发率降低, 幼苗生长矮小、黄
化。体外磷酸化测试显示, PKS5特异磷酸化ABA响应元件ABI5 (ABA-insensitive 5) N末端多肽(1~211 aa)。qRT-PCR分析
表明pks5-3与pks5-4突变体中ABI5下游ABA响应基因RAB18 (RESPONSIVE TO ABA18)与EM6 (LATE EMBRYOGENESIS
ABUNDANT 6)表达均发生改变。这些研究结果表明, 拟南芥PKS5通过磷酸化ABI5的N末端参与植物ABA响应过程。
关键词: PKS5; ABI5; ABA响应; 磷酸化
PKS5 Kinase is Involved in ABA Response through Phosphorylating ABI5 in
Arabidopsis
ZHAO Fei-Yi*, JIAO Cheng-Jin, CHEN Quan, WANG Tai-Shu, TIAN Chun-Fang, GAO Ya-Mei
School of Bioengineering & Biotechnology, Tianshui Normal University, Tianshui, Gansu 741001, China
Abstract: The phytohormone abscisic acid (ABA) plays an essential role in plant growth and development as
well as abiotic stress responses. In this study, we found that PKS5 (SOS2-like protein kinase 5), a family mem-
ber of PKSes (SOS2-like protein kinases), involved in ABA response in Arabidopsis. PKS5 gain-of-function
point mutants pks5-3 and pks5-4 exhibited hypersensitive to ABA in the phenotypic test. Additionally, seed ger-
minations of pks5-3 and pks5-4 decreased and seedlings of them showed stunted growth and leaf chlorotic
symptoms under exogenous ABA treatment. In vitro phosphorylation assay indicated that PKS5 specifically
phosphorylates the ABA-responsive component ABI5 (ABA-insensitive 5) N terminus fragment range from 1
to 211 amino acids. Moreover, the relative expression levels of RAB18 and EM6, which are the downstream
ABA-responsive genes of ABI5, significantly altered in pks5-3 and pks5-4 mutants compared with the wild-
type plants by quantitative real-time PCR using gene-specific primers. Taken together, the results of this study
revealed that PKS5 involves in ABA response via phosphorylating the N-terminus of ABI5 in Arabidopsis.
Key words: PKS5; ABI5; ABA response; phosphorylation
植物激素脱落酸(abscisic acid, ABA)在植物的
整个生活周期中起着关键性的作用。已有研究表
明, ABA参与植物种子贮藏蛋白和脂类合成、种
子脱水耐受和促进休眠、抑制胚胎萌发和从营养
生长到生殖生长的转变(Rock 2000)。此外, ABA
还介导了盐、低氧、冷、干旱等胁迫生理响应,
以及病理性的诱导抗性(Shinozaki和Yamaguchi-
Shinozaki 2000)。植物感应、转导ABA的分子作
用机理一直是植物分子生物学重要的研究内容。
ABI5为碱性亮氨酸拉链(bZIP)类型的转录因
子。早期发现其在种子萌发后以ABA依赖方式抑
制植物生长(Finkelstein 1994; Lopez-Molina和Chua
2000)。ABI5转录激活与ABI5的稳定性影响ABI5
蛋白的累积程度, 由此决定ABI5对种子萌发后生长
抑制的效率(Lopez-Molina和Chua 2000; Brocard等
2002)。近期发现蛋白磷酸酶PP6 (protein phosphatase
6)通过调节ABI5的磷酸化程度参与拟南芥ABA信
号过程(Dai等2013)。在种子早期发育中, ABI5介导
了ABA对SHB1 (short hypocotyls under blue 1)的负向
调控表达(Cheng等2014)。属于PP2A相关蛋白
TAP46 (PP2A-associated protein 46)在ABI5调节相关
基因的表达中起着正向调节子的角色(Hu等2014)。
植物生理学报1720
一个抗盐同源因子BBX21 (B-box 21)、HY5 (elon-
gated hypocotyls 5)和ABI5共同作用于ABI5启动子
上, 对光与ABA信号进行整合调控(Xu等2014)。
最近又鉴定了在ABA调节负向反馈环中起作用的
多个对ABI5表达、稳定性及活性起作用的调控因
子, 如E3连接酶KEG (KEEP ON GOING)通过泛素
化或苏素化ABI5参与ABA响应(Stone等2006; Liu
和Stone 2010)。
PKSes (SOS2-like protein kinases)蛋白激酶属
于拟南芥CDPK-SnRK超家族中SnRK3 (SNF1-related
kinase3)家族(Hrabak等2003; Weinl和Kudla 2009)。
该家族中, PKS12在ABA调节的冷胁迫中起作用
(Sheen等1999) 。PKS18参与植物在种子萌发和幼
苗期对A B A的响应 , P K S 1 8组成型表达形式
PKS18T/D转基因植物在种子萌发和幼苗期显示出
对ABA的超敏感性, 而该激酶的RNAi沉默形式则
表现出对ABA的不敏感(Gong等2002) 。近来发现,
PKS3与SCaBP5 (SOS3-like calcium binding protein
5)相互作用在种子萌发、幼苗生长和气孔关闭上
表现出对ABA的超敏感性(Cheong等2003)。而
PKS24不仅在远红光对拟南芥黄化苗转绿的抑制
效应中起作用(Qin等2010), 也参与植物对盐及
ABA的胁迫应答(Qin等2008)。
PKS5 (SOS2-like protein kinase 5)为PKS家族
26个成员之一。其通过磷酸化AHA2 (质膜ATPase
的等位形式之一)第931位丝氨酸而阻止其与14-
3-3蛋白相互作用, 进而负向调控AHA2的活性, 使
植物表现出对外源高pH的抗性(Fuglsang等2007)。
近期研究又鉴定了参与此信号途径的分子伴侣共
作用因子J3 (Arabidopsis DnaJ homologous protein3)。
体内J3通过对PKS5的活性抑制方式参与植物对外
源盐碱胁迫的响应 (Yang等2010)。最近发现 ,
PKS5在体内与SCaBP8 (SOS3-like calcium binding
protein 8)存在相互作用, 并通过对AHA2的磷酸化
过程参与对外界的盐碱调节过程(Xie等2009)。此
外, PKS5也可通过对植物抗病途径中一个主要共
激活子NPR1 (nonexpressor of pathogenesis-related
gene 1)的磷酸化过程介导了WRKY38 (WRKY DNA-
binding protein 38)与WRKY62 (WRKY DNA-binding
protein 62)的表达, 从而参与植物的抗病过程(Xie
等2010)。然而, PKS5是否也参与了植物ABA响应
目前未见报道。本研究使用PKS5功能缺失与获得
性突变体对其ABA表型进行了考察, 确定了PKS5
在ABA信号途径中的作用, 并对其参与ABA响应
的作用机理进行了探讨。研究结果将为ABA信号
途径鉴定新的参与元件, 并提供PKS5调控ABA信
号转导作用机理依据。
材料与方法
1 实验材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)野生型(Col-0)、
T-DNA突变体pks5-1 (SALK_108074)订购自
SALK。pks5-3与pks5-4为TILLING突变体(http://
tilling.fhcrc.org:9366), 订购自ABRC (Arabidopsis
Biological Resource Center)。大肠杆菌DH5α、
BL21 (DE3)、农杆菌GV3101与植物转化载体为
本实验室保存。克隆用T载体购自上海生物工程
公司。
2 引物设计
引物设计使用Primer Premier 5.0软件进行, 本
研究中所有引物均由上海生物工程公司进行合
成。引物序列见表1。
3 植物突变纯合体鉴定
pks5-1突变纯合体鉴定基因正向引物为P51T-F,
反向引物为P51T-R。T-DNA上鉴定引物使用左边
界Lba1与LBb1。引物P51T-F与Lba1扩增产物大小
大约550 bp; 引物P51T-F与LBb1扩增产物大小大
约350 bp。pks5-3与pks5-4点突变纯合体鉴定使用
衍生型酶切扩增多态性序列(derived Cleaved am-
plified polymorphic sequence, dCAPS)分子标记技
术。pks5-3使用P53D-F与P53D-R引物对, PCR扩增
263 bp片段, AvaI内切酶切野生型扩增产物; pks5-4
使用P54D-F与P54D-R引物, PCR扩增236 bp片段,
MluI内切酶切野生型扩增片段。
4 植物培养条件及ABA表型观察
试验种子用消毒液(20%次氯酸钠+0.1% Tri-
ton X-100)在EP管中灭菌10 min, 灭菌ddH2O洗5次
后点种于MS或含0.3 μmol·L-1 ABA处理MS固体平
板上。处理MS平板在4 ℃下春化2 d后置于16 h
(L) (22 ℃)/8 h (D) (20 ℃)光周期条件下进行培
养。培养一定时间后, 对平板上种子萌发率进行
统计, 并观察幼苗ABA表型。
赵菲佚等: 拟南芥PKS5激酶磷酸化ABI5参与植物ABA响应 1721
5 RNA分离、反转录及RT-PCR
生长10 d拟南芥野生型(Col-0)、pks5-1、
pks5-3与pks5-4总RNA提取使用TRI试剂(Ambion)
进行。提取总RNA使用Promega公司M-MLV反转
录酶(Promega, M1705)在42 ℃下进行反转录, 获得
cDNA第一链。总RNA提取与cDNA第一链合成均
按试剂盒操作方法进行。以Col-0及pks5-1反转录
表1 引物序列
Table 1 Primer sequences used in this study
引物名称 引物序列(5→3) 限制性酶
P51T-F ATGCCAGAGATCGAGATTGCC
P51T-R AATAGCCGCGTTTGTTGACGAC
Lba1 TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
LBb1 GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT
P53D-F GCGTTTGATTTGATTTCTTACTCCT
P53D-R CACCACAAGCAAATCATTCAA
P54D-F GTTTCGGATTTCGGTCTAAACG
P54D-R CTCTCCTTTATAAATCTTC
P5-F CGGGATCCATGCCAGAGATCGAGATTGCC BamHI
P5-R GGAATTCTTAAATAGCCGCGTTTGTTG EcoRI
A3N-F CGGGATCCATGAAAAGCTTGCATGTGGCG BamHI
A3N-R ACGCGTCGACTCATTGTTGTGGTGGTGGAGGAAC SalI
A3C-F CGGGATCCCAAGCTTTTGTCTCGGACCCG BamHI
A3C-R ACGCGTCGACTCATTTAACAGTTTGAGAAGT SalI
A4N-F CCCAAGCTTATGGACCCTTTAGCTTCCCAA HindIII
A4N-R CCGCTCGAGTTAGATACCCTACGGACCAAAGTT XhoI
A4C-F CCCAAGCTTCCTTTTAACAACAACATCTTC HindIII
A4C-R CCGCTCGAGTTAATAGAATTCCCCCAAGAT XhoI
A5N-F CGGGATCCATGGTAACTAGAGAAACGAAG BamHI
A5N-R ACGCGTCGACTTACACCAAGAAATCCTCAAGTGA SalI
A5C-F CGGGATCCAAGGCTGGTGTGGTTAGAGAA BamHI
A5C-R ACGCGTCGACTTAGAGTGGACAACTCGGGTT SalI
A5NI-R ACGCGTCGACTTACTTGCCGTTCTCACATAAAGC SalI
A5NII-F CGGGATCCAACTTTGGGTCCATGAACATG BamHI
A5NII-R ACGCGTCGACTTAAAGACTAGACTCGTTCGCTAT SalI
A5NIII-F CGGGATCCCCTCGACAAGGCTCTTTGACA BamHI
P5P-F CATGTCTAGATCTTTTATAATATATATACTCAC XbaI
P5P-R CATGCCATGGGATTGATGAATCCAGAGATTGA NcoI
P5G-F CCGCTCGAGATGCCAGAGATCGAGATTGCC XhoI
P5G-R CCGCTCGAGAATAGCCGCGTTTGTTGAC XhoI
P5Q-F TCGTCGGGATTGGATTTGTC
P5Q-R TCCATCTCAAACCCATACTC
R8Q-F GAGCACCACGAGAAGAAGG
R8Q-R GCACAATACAACGACCGAATG
E6Q-F TGTCTCGTTTGTTTTCCAG
E6Q-R CACTATGTTGAGAATCCAC
A2Q-F GTCGTACAACCGGTATTGTG
A2Q-R GAGCTGGTCTTTGAGGTTTC
　　序列中下划线为限制性酶作用位点碱基。
cDNA第一链为模板, 使用引物P5-F与P5-R对PKS5
全长进行RT-PCR扩增。同时, 以A2Q-F与A2Q-R
为引物对ACTIN2扩增作为RT-PCR对照。PCR反
应为30个循环。
6 PKS5点突变与ABI5序列克隆与蛋白原核表达
PKS5序列克隆以野生型(Col-0)及pks5-3、
pks5-4各点突变体基因组DNA为模板, 使用引物
植物生理学报1722
P5-F与P5-R, PCR扩增得到野生型及各点突变
PKS5基因编码序列。以野生型(Col-0) cDNA为模
板, 使用引物A3N-F与A3N-R; A3C-F与A3C-R分别
扩增ABI3的N端(ABI3N, 1~360 aa)与C端(ABI3C,
361~720 aa)。使用引物A4N-F与A4N-R; A4C-F与
A4C-R扩增ABI4的N端(ABI4N, 1~164 aa)与C端
(ABI4C, 165~328 aa)。用引物A5N-F与A5N-R;
A5C-F与A5C-R引物扩增ABI5的N端(ABI5N, 1~211
aa)与C端(ABI5C, 212~442 aa)。使用引物A5N-F与
A5NI-R; A5NII-F与A5NII-R; A5NIII-F与A5N-R分
别扩增ABI5的N端第一段(ABI5NI, 1~60 aa)、第二
段(ABI5NII, 61~140 aa)和第三段(ABI5NIII,
141~211 aa)。PCR扩增各片段纯化后使用标准克
隆程序克隆至pET28a载体。阳性候选克隆送上海
生物工程公司测序验证。从DH5α提取的拟表达载
体经电转化方法转入BL21(DE3)表达菌株, 再次经
PCR筛选得到阳性克隆后保存备用。
含目标表达载体的BL21(DE3)菌株按1:1 000
的比例接入含30 μg·L-1氯霉素和50 μg·L-1的卡那霉
素的60 mL LB液体培养基中, 37 ℃过夜小量培
养。次日将10 mL过夜培养物转入1 L含50 μg·mL-1
Kan的LB培养基中继续培养, 当菌液OD达0.7时收
菌 , 2 664×g离心后沉淀加入30 mL裂解液(50
mmol·L-1 NaH2PO4、300 mmol·L
-1 NaCl、10 mmol·L-1
咪唑, pH 8.0)重悬, 在超声破碎仪(VCX130, SON-
ICS)上破碎(250 W, 超声3 s, 间隔3 s, 1 min循环, 共
5 min)后23 000×g离心, 上清液中加入100 μL Ni-
NTA树脂进行蛋白结合, 最后使用洗脱缓冲液(50
mmol·L -1 NaH2PO4、300 mmol·L
-1 NaCl、250
mmol·L-1咪唑, pH 8.0)进行洗脱得到目标蛋白。后
续融合蛋白纯化方法按Qiagen公司的树脂提取方
法进行。结合于树脂上的重组目标蛋白保存于4
℃冰箱中备用。
7 PKS5点突变重组蛋白体外激酶活性测试
激酶体外磷酸化试验按照以下方法进行。在
冰浴EP管中混合激酶与底物蛋白MBP (myelin ba-
sic protein), 反应在20 μL体系中进行, 计算激酶反
应缓冲液(20 mmol·L-1 Tris-HCl, pH 7.2, 5 mmol·L-1
MgCl2, 0.5 mmol·L
-1 CaCl2, 10 μmol·L
-1 ATP, 2
mmol·L-1 DTT)的用量, 每个反应使用2 μCi (γ-32P)
ATP。将反应所需体积的重组蛋白加入激酶反应
缓冲液中, 30 ℃水浴中反应30 min后加入6×SDS蛋
白载样缓冲液, 并在干浴器(SBH130D/3, Stuart)上
95 ℃加热5 min。离心后于12%的SDS蛋白胶上进行
变性电泳, 考马斯亮蓝染色后在脱色液中脱色, 凝胶
成像仪上(GelDoc-It2 310, UVP)照相后使用保鲜膜包
好蛋白凝胶 , 压于磷屏上 , 次日于磷屏成像仪
(STORM 860, Amersham Biosciences)上进行成像。
8 PKS5 promoter-GUS在转基因植物中表达及
PKS5荧光融合蛋白亚细胞定位
使用引物P5P-F与P5P-R, 以拟南芥野生型
(Col-0)基因组DNA为模板, PCR扩增PKS5转译起
点上游2 kb片段, 并克隆至植物表达载体pCAM-
BIA1301上, 构建PKS5 promoter-GUS融合载体并
转化拟南芥野生型(Col-0)。植物转化与GUS检测
按Haritatos等(2000)方法进行。
以野生型(Col-0)基因组DNA为模板, P5G-F与
P5G-R为引物对进行PCR扩增。扩增产物克隆至
pTA7002植物表达载体上, 构建植物PKS5-GFP绿色
荧光融合蛋白表达载体。测序验证的植物荧光表
达载体经质粒纯化试剂盒Maxprep Kit (Vigorous
Biotechnololgy)纯化后, 转化拟南芥野生型(Col-0)。
生长5 d的T2代转基因植物用于PKS5亚细胞定位。
pTA7002-PKS5-GFP转化生长5 d的T2代转基因植物
使用10 mmol·L-1 DEX (dexamethasone)处理24 h后在
confocal显微镜(Zeiss 510 META)下进行荧光观察。
9 qRT-PCR检测
以野生型(Col-0)、pks5-1、pks5-3、pks5-4的
cDNA为模板, 使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒
(Takara), 在ABI 7500 Fast Real-time PCR仪上, 对
不同组织中PKS5及RAB18和EM6在不同突变体中
的表达进行测定。对PKS5表达, 使用引物P5Q-F与
P5Q-R。对RAB18和EM6表达 , 分别使用引物
R8Q-F和R8Q-R、E6Q-F和E6Q-R。反应以AC-
TIN2扩增为内参 , 对各基因表达水平进行标准
化。ACTIN2扩增使用引物A2Q-F和A2Q-R。qRT-
PCR按照Takara公司试剂盒方法进行。
实验结果
1 PKS5蛋白结构及突变位置
PKS5定位于拟南芥第2条染色体上(At2g-
30360), 其CDS共有1 308个碱基, 不含内含子。编
码蛋白共有435个氨基酸, 为一丝氨酸/苏氨酸蛋白
激酶。整个蛋白可分为两个大的结构域, 位于N端
赵菲佚等: 拟南芥PKS5激酶磷酸化ABI5参与植物ABA响应 1723
的激酶结构域和C端的激酶调控域(Guo等2001)。
激酶结构域内含有一个推测的激活环(KDAL)
(Gong等2002)。调控结构域内含有两个子结构域,
FISL基序和PPI结构域。FISL基序是PKS家族中保
守的结构域, 是与SCaBP (SOS3-like calcium binding
protein )相互作用所必须的结构域(Gong等2004)。
在激酶结构域和FISL基序之间由连接结构域(JK)
进行连接(Gong等2002)。从SALK与ABRC获得
PKS5不同类型突变体。pks5-1为T-DNA插入突变
体。pks5-3发生了c→t的转换, 蛋白的第168位氨基
酸由丙氨酸变为缬氨酸(A168V); pks5-3突变位于
已知的激酶激活环内; pks5-4发生了c→t的突变, 在
317位氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸(S317L), pks5-4
的突变位于FISL基序内(图1)。
2 PKS5不同结构域点突变体外激酶活性测试
为检测PKS5不同结构域发生点突变后其激
酶活性的变化, 对PKS5不同的点突变CDS序列进
行克隆, 并在原核中表达突变蛋白。不同PKS5点
突变重组蛋白的激酶活性比较如图2所示。激酶
活性测试结果显示, 不同的PKS5点突变激酶活性
发生改变, 与PKS5对照相比较, PKS5-3与PKS5-4
活性增高, 而PKS5-3较PKS5-4又具有更高的活
性。PKS5点突变激酶底物磷酸化(MBP)活性与自
磷酸化活性变化一致(图2-B)。此结果说明PKS5不
同结构域发生突变对PKS5激酶活性的影响不同。
PKS5-3突变发生于激酶激活环(KDAL)内, PKS5-4
则发生于FISL基序内。KDAL突变对激酶活性影
响要大于FISL内突变。从PKS5点突变激酶活性也
可得知, 与野生型(Col-0)相比较, pks5-3与pks5-4突
变体为功能获得性突变体。
图1 PKS5蛋白结构与突变位点示意图
Fig.1 Schematic diagram of PKS5 structure and sites of point mutations
KDAL: 激酶催化结构域激活环; JK: 连接区; FISL: FISL基序; PPI: 与PP2C蛋白磷酸酶作用结构域。深灰色部分为激活环结构域, 黑
色横线部分为连接区, 黑色部分为FISL结构域, 白色部分为PPI结构域。箭头指示点突变位置, 三角形指示PKS5 T-DNA插入位置。
图2 PKS5点突变PKS5-3与PKS5-4磷酸化活性比较
Fig.2 Comparison of phosphorylation of the PKS5 point mutated PKS5-3 and PKS5-4
A: PKS5-3与PKS5-4体外磷酸化活性测试, CBB: 考马斯亮蓝染色; AUD: 放射自显影; B: PKS5-3与PKS5-4相对磷酸化活性, auto: 自磷
酸化活性; sub: MBP底物磷酸化活性。
植物生理学报1724
3 PKS5表达模式与亚细胞定位
为考察PKS5的表达模式, 将PKS5转译起始点
上游2 kb序列克隆至pCAMBIA1301载体上与GUS
(β-glucuronidase)进行转录融合, 并将此载体转化拟
南芥野生型(Col-0)。GUS染色结果显示PKS5表达
于幼苗根及叶片中(图3-A~D)。此与已有报道的
PKS5表达模式一致(Fuglsang等2007)。将PKS5克隆
于pTA7002-GFP载体上与GFP进行N端转译融合,
转入拟南芥野生型(Col-0)中。使用Confocal对T2代
转基因植物进行荧光观察, 以确定PKS5的亚细胞定
位。结果显示PKS5定位于细胞膜、细胞质及细胞
核中(图3-E~G)。为考察PKS5组织特异性表达状况,
提取生长40 d野生型植物根、茎、莲座叶、叶片、
茎生叶、花、角果及种子总RNA, 使用qRT-PCR对其
表达进行分析。图3-H显示PKS5在所有的组织中都
有组成性的表达, 在生殖器官与根中有着较高的表
图4 PKS5突变纯合体鉴定及ABA表型
Fig.4 Identification and ABA phenotype of homozygous PKS5 mutants
A: pks5-1突变纯合体PCR鉴定, M: Transgen 1 kb plus DNA分子量标准; P5F: P51T-F引物; P5R: P51T-R引物; La1: LBa1引物; Lb1:
LBb1引物; B: pks5-1中PKS5表达RT-PCR分析, ACTIN2为对照。C: pks5-3突变纯合体dCAPS鉴定, AvaI切野生型; D: pks5-4突变纯合体
dCAPS鉴定, MluI切野生型。E: pks5-3与pks5-4种子萌发后9 d的ABA表型; F: pks5-1幼苗生长9 d的ABA表型; G: pks5-3幼苗生长6 d的ABA
表型; H: pks5-4幼苗生长17 d的ABA表型。图中PKS5突变体ABA表型测试均在含0.3 μmol·L-1 ABA的MS平板进行。
图3 PKS5表达模式与亚细胞定位
Fig.3 Expression pattern and subcellular localization of PKS5
A~D: PKS5 promoter-GUS在转化野生型(Col-0)生长3 d的幼苗(A), 生长10 d的幼苗(B), 莲座叶(C)和花(D)中的表达; E~G: PKS5-GFP
在根上部亚细胞定位, E为Confocal图像, F为明视野图像, G为Confocal与明视野重叠图像; H: PKS5在不同组织中的相对转录水平, R: 根,
St: 茎, Ro: 莲座叶, C: 茎生叶, F: 花, Si: 果夹, Se: 种子。
赵菲佚等: 拟南芥PKS5激酶磷酸化ABI5参与植物ABA响应 1725
达, 其中花中表达量最高, 而在种子中表达最低。
PKS5表达模式、PKS5定位与组织特异表达与ABI5
的相一致(Finkelstein和Lynch 2000; Lopez-Molina和
Chua 2000), 预示体内PKS5与ABI5存在相互作用。
4 PKS5突变纯合体鉴定及ABA表型分析
为考察PKS5突变体是否具有ABA表型, 对
PKS5点突变体pks5-3、pks5-4和T-DNA插入突变
体pks5-1的突变纯合性进行鉴定并对其ABA表型
进行考察。图4-A表明, pks5-1为T-DNA插入突变
纯合体。PKS5在pks5-1突变体中无转录本存在(图
4-B)。dCAPS分析表明pks5-3和pks5-4均为纯合点
突变体(图4-C和D)。在含0.3 μmol·L-1 ABA的MS
平板上, pks5-3和pks5-4表现出对ABA的敏感表型,
萌发率与野生型相比较降低(图4-E), 幼苗生长矮
小 , 黄化 (图4-F~H)。pks5-3与pks5-4相比较 ,
pks5-3对ABA更敏感。体外磷酸化活性测试表明,
点突变PKS5-3比PKS5-4具有更高的激酶活性(图
2), 表明PKS5突变体对ABA的响应与体内PKS5的
磷酸化活性相关。图4-F显示pks5 T-DNA突变体
在此条件下与野生型相比较未表现出ABA敏感表
型, 此表明PKS5不同的突变形式对ABA的响应存
在差异。
5 PKS5对ABI转录因子磷酸化测试
已发现2个Ca2+依赖的蛋白激酶CPK4 (calcium-
dependent protein kinase 4)与CPK11可通过磷酸化
ABA信号途径中ABF1 (ABA-responsive transcrip-
tion factor 1)及ABF4参与ABA响应(Zhu等2007)。
与PKS5属于同一家族的CIPK26 (calcineurin B-like
interacting protein kinase 26)可与ABI5相互作用, 并
在体外磷酸化ABI5 (Lyzenga等2013)。推测PKS5
体外也可磷酸化参与ABA响应的转录因子。为验
证此推测, 以原核表达的ABI3、ABI4及ABI5的N
端或C端作为激酶作用底物, 使用PKS5对其磷酸
化作用进行测试。结果显示, PKS5蛋白激酶不能
磷酸化ABI3与ABI4, 只可磷酸化ABI5的N端多肽
(图5-A), 说明PKS5对ABI5的磷酸化作用具有特异
性。PKS5及其突变蛋白对ABI5的N端多肽磷酸化
能力与其对MBP的磷酸化情形相似, PKS5-3与
PKS5-4较PKS5的激酶活性升高, 两者对ABI5的
N端多肽也具有较高的磷酸化能力。PKS5-3与
PKS5-4相比较, PKS5-3有更高的磷酸化ABI5的能
力(图5-B)。为进一步缩小PKS5对ABI5的磷酸化
位点范围, 将ABI5的N端多肽分为ABI5NI (1~60
aa)、ABI5NII (61~140 aa)和ABI5NIII (141~211 aa)
三个部分, 体外表达各段多肽后进行同样的磷酸
化测试。图5-C显示, PKS5对ABI5的磷酸化位点
存在于其N端的第1~140个氨基酸区域内, 且第
1~60个氨基酸区域为PKS5磷酸化ABI5的主要位
点位置, 第61~140氨基酸部分次之。PKS5对ABI5
的磷酸化测试表明: 体外PKS5的确存在对ABI5的
特异性磷酸化作用, ABI5受PKS5磷酸化的位点主
要存在于ABI5NI 与ABI5NII区域内。
图5 PKS5体外磷酸化ABI5的N末端
Fig.5 PKS5 phosphorylated the N-terminus of ABI5 in vitro
A: PKS5特异磷酸化ABI5的N末端, ABI3N: ABI3的N末端, ABI3C: ABI3的C末端, ABI4N: ABI4的N末端, ABI4C: ABI4的C末端,
ABI5N: ABI5的N末段, ABI5C: ABI5的C末段; B: PKS5点突变体外磷酸化ABI5的N末端; C: PKS5体外磷酸化ABI5的N末端ABI5NI与
ABI5NII部分。ABI5NI: ABI5的N末段第一部分(1~60 aa); ABI5NII: ABI5的N末段第二部分(61~140 aa); ABI5NIII: ABI5的N末段第三部分
(141~211 aa); CBB: 考马斯亮蓝染色; AUD: 放射自显影。
植物生理学报1726
6 PKS5突变对ABI5响应基因表达的影响
ABA响应基因RAB18与EM6受ABI5的调控,
PKS5可磷酸化ABI5参与ABA响应过程。为考察
当PKS5突变后, 植物体内受ABI5调节的基因表达
水平是否会发生改变, 使用qRT-PCR, 以RAB18与
EM6为标记基因, 在无ABA及ABA处理下, 对PKS5
不同突变体内RAB18与EM6的表达水平进行分
析。qRT-PCR测定及数据多重比较结果显示, 无
ABA处理时, 所选ABA响应标记基因表达无差别
(图6); 当使用100 μmol·L-1 ABA处理时, RAB18表
达受ABA的诱导, 在PKS5不同突变体内, RAB18的
ABA诱导表达存在差异。与野生型(Col-0)相比较,
pks5-1中RAB18表达与对照无差异, pks5-3与pks5-4
中RAB18表达量升高, 且pks5-3中RAB18表达水平
最高(P<0.05) (图6-A)。EM6表达也同样受ABA诱
导, 但EM6在PKS5不同突变体中的表达与RAB18
呈现相反的模式。与野生型(Col-0)相比较, pks5-1
中EM6表达与对照无差异, pks5-3与pks5-4中EM6
表达降低, 且pks5-3中EM6表达量最低(P<0.05) (图
6-B)。此结果说明PKS5通过ABI5影响其下游基因
的表达水平 , 进而参与ABA响应过程。不同的
PKS5突变形式对ABI5下游基因表达的影响有着不
同的模式与效应。
讨　　论
ABA在植物发育及各种外界胁迫反应中起着
重要的作用。对ABA的合成与响应过程已有大量
研究成果(Finkelstein 2013)。ABA响应途径中元件
的鉴定与作用机理是解析ABA信号转导的基础。
本研究中 , PKS5功能获得性点突变体pks5-3与
pks5-4在拟南芥种子萌发与幼苗早期生长表现出
外源ABA处理敏感表型, 突变体种子萌发率降低,
幼苗生长矮小, 黄化(图4-E~H)。表明PKS5蛋白激
酶参与植物ABA响应过程, PKS5为ABA信号途径
中的作用元件。体外以ABI5为PKS5激酶作用底
物的磷酸化测试发现, PKS5可磷酸化ABI5的N末
端(图5)。此外, pks5-3与pks5-4中ABI5下游调控标
记基因的表达发生了变化, 表明体内PKS5通过
ABI5而影响下游基因的表达(图6)。上述结果表
明: 体内PKS5为ABA信号途径中的成员, PKS5对
ABA的响应是通过磷酸化ABI5的N端作用方式而
实现。
pks5-1为PKS5功能缺失型突变体 , 在外源
ABA处理下, pks5-3与pks5-4均对ABA敏感, 而
pks5-1与野生型(Col-0)对ABA的反应相似, 未观察
到ABA处理的敏感表型(图4-F)。pks5-1中ABI5下
游调控基因的表达水平也与野生型(Col-0)中无差
图6 PKS5突变体中ABI5响应基因表达
Fig.6 Expression of ABI5-responsive genes in PKS5 mutants
A: PKS5突变体中RAB18相对表达水平; B: PKS5突变体中EM6相对表达水平。图中数值为3次重复测定结果, 不同小写字母表示差异
达到显著水平(P<0.05)。
赵菲佚等: 拟南芥PKS5激酶磷酸化ABI5参与植物ABA响应 1727
异(图6-A和B)。pks5-1为T-DNA插入突变体(图
4-A), 无PKS5转录本存在(图4-B)。推测在植物体
内除了PKS5对ABI5通过磷酸化调控之外, 还存在
PKS家族中的其他成员或其他非PKS家族元件与
PKS5具有功能上的冗余性。当PKS5缺失时, 其他
PKS成员或元件对ABI5的调控作用互补了PKS5的
功能, 因而在表型测试与ABI5下游基因表达中无
法观察到该类突变体的ABA表型与基因表达变
化。而pks5-3与pks5-4为PKS5的功能获得性突变
体, 由于PKS5的存在且PKS5活性的变化, 使其可
表现出对外源ABA处理的反应。
PKS5属于PKS家族成员, 人们发现PKS家族
与SCaBP家族构成了复杂的相互作用网络, 参与植
物对盐、干旱及ABA响应过程。如PKS3与SCaBP5
(SOS3-like calcium binding protein 5)间存在相互作
用, 在种子萌发、幼苗生长和气孔关闭过程中表
现出对ABA的超敏感性(Cheong等2003)。PKS5蛋
白激酶一方面可通过磷酸化下游元件起作用, 本
身也可能受到其他作用元件的调控, 推测在PKS-
SCaBP网络中也存在与PKS5相互作用的SCaBPP
家族成员参与ABA响应过程。如J3可与PKS5相互
作用, 通过对PSK5抑制作用方式调节质膜质子泵
活性(Yang等2010), 表明PKS5可能与其他不同类
型的元件存在相互作用, 共同参与植物生理过程。
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