全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Jun．２０１ ５,３５(３):４０８－４１ ３　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１３０６００８
赵菲佚,焦成瑾,陈荃,等．拟南芥 PKS５ 激酶点突变体外表达与磷酸化测试[J]．广西植物,２０１５,３５(３):４０８－４１３
Zhao FY,Jiao CJ,Chen Q,et al．In vitro expression and determination of phosphorylation activity of point mutants of the PKS５ kinase inArabidopsis[J]．
Guihaia,２０１ ５,３５(３):４０８－４１３
拟南芥 PKS５ 激酶点突变体外表达与磷酸化测试
赵菲佚 １,２,焦成瑾 １,陈　荃 １,马伟超 １,安建平 １,呼丽萍 １,２
(１．天水师范学院 生命科学与化学学院,甘肃 天水 ７４ １ ０００;２．甘肃大樱桃工程技术中心,甘肃 天水 ７４ １ ０００ )
摘　要:PKS５ (protein kinase SOS２-like ５)虽为拟南芥(Arabidop sis thaliana)中介导植物响应外界高 pH
的蛋白激酶,但其关键功能结构域尚未被确定.该研究用 PCR 对 PKS５ 不同位置点突变形式进行克隆,并在
原核系统中进行表达,得到 PKS５ 不同的点突变蛋白;使用激酶通用底物 MBP(myelin basic protein)及 PKS５
体内特异底物 AHA２(A．thaliana isoform of the PM H＋-ATPase,拟南芥质膜质子泵等位形式之一)对 PKS５
点突变蛋白磷酸化活性进行了测试.结果表明:点突变 PKS５-２ 失去了激酶活性,PKS５-４、PKS５-５、PKS５-９ 自
磷酸化与 MBP 磷酸化活性与 PKS５ 相比无差异;而与 PKS５ 相比,点突变 PKS５-６ 和 PKS５-７ 自磷酸化及对
AHA２ 的磷酸化活性升高,且 PKS５-７ 活性高于 PKS５-６.说明 PKS５ 特定位置点突变改变 PKS５ 的自磷酸化
及底物磷酸化活性水平,不同位置的点突变对其磷酸化活性的影响存在差异.研究结果可为确定 PKS５ 功能
结构域及体内作用机理提供依据.
关键词:PKS５;点突变;蛋白表达;磷酸化活性
中图分类号:Q９４８．１ １２　　文献标识码:A　　文章编号:１０００-３１４２(２０１ ５)０３-０４０８-０６
In vitro expression and determination of phosphorylation
activity of point mutants of the PKS５ kinase in Arabidopsis
ZHAO Fei-Yi１,２,JIAO Cheng-Jin１,CHEN Quan１,
MA Wei-Chao１,AN Jian-Ping１,HU Li-Ping１,２
(１．School of Life Sciences and Chemistry,Tianshui Normal Universiry,Tianshui ７４１０００,China;
２．Gansu Engineering and Research Center for Sweet Cherry,Tianshui ７４１０００,China )
Abstract:InArabidopsis,PKS５ (protein kinase SOS２-like ５),a serine-threonine kinase,involves in the response to
the external high pH stress based on the study of its loss-of-function mutant．Whereas,the fine functions of the do-
mains resided in PKS５ are not currently well determined．We report here the dissection of domains of PKS５ in the ac-
tivity of phosphorylation against MBP(myelin basic protein)and AHA２(one of the Arabidopsis thaliana isoform of
PM H＋-ATPases),which is the specific substrate of PKS５ in vivo,using the assay of phosphorlation in vitro via
expressing the distinct PKS５ mutant versions in bacteria using the PKS５ cloning from plants employing PCR ap-
proach．The results showed that the point mutated PKS５-２ lost its activity,PKS５-４,PKS５-５ and PKS５-９ displayed
no difference in autophosphorylation and the MBP phosphorylation．Moreover,autophosphorylation and the AHA２
phosphorylation of the point mutated PKS５-６ and PKS５-７ increased compared with PKS５ and the PKS５-７ activity
was higher than PKS５-６．Taken together,the specific point mutations in PKS５ altered its activity of autophosphory-
lation and the substrate phosphoylation of BMP and AHA２．The effects due to the alteration of mutations resided in
收稿日期:２０ １ ４-０８-３０　　修回日期:２０ １ ４-１２-２２
基金项目:国家自然科学基金(３１ １ ６００６０,３ １ ２ ６０５ ６ ８);天水师范学院中青年教师科研项目(TSB１０ １ ６).
作者简介:赵菲佚(１９７２-),男,甘肃天水人,博士,副教授,研究方向为植物抗逆分子生物学,(E-mail)tspaulzhao＠１ ６３．com.
PKS５ on the activity of phosphorylation were comparable within the various PKS５ mutated protein versions．The re-
sults of this study would provide the basis for pinpointing the functional domains of PKS５ and the mechanism of func-
tions of PKS５ in planta．
Key words:PKS５;point mutant;protein expression;phosphorylation activity
　　PKS５ (protein kinase SOS２-like ５)为拟南芥
(Arabidop sis thaliana )蛋白激酶之一,属 PKS
(protein kinase)家族成员.拟南芥基因组中共含有
２４ 个 PKS 家 族 成 员,被 命 名 为 PKS２-PKS２５
(protein kinase SOS２-like)(Yan et al．,２００１ ).
SOS２(salt overly sensitive ２)蛋白激酶是首先被克
隆的该家族成员.SOS２ 与 Ca２＋ 结合蛋白 SOS３
(salt overly sensitive ３)及质膜上的反转运体 SOS１
(salt overly sensitive １)构成了拟南芥专一性响应
外源盐胁迫的信号转导途径(Albrecht et al ．,２００１;
Hardie et al ．,１９９８).在结构上,PKS 与来源于酵
母(Saccharomyces cerevisiae )中 SNF１ (sucrose-
non-fermenting protein kinase)和动物中 AMPK
(AMP-activated protein kinase)激酶具有相似性
(Hardie et al ．,１９９８;Hrabak et al．,２００３).在功能
上,PKS１８ 参与了植物在萌发和幼苗期对 ABA 的
响应(Deming et al,２００２).PKS２４ 不仅参与了拟
南芥对盐及 ABA 的胁迫应答(秦玉芝等,２００８),也
介导了拟南芥幼苗中植物色素 A 对其绿化的抑制
作用(秦玉芝等,２０１０).前期研究发现,SCaBP５
(SOS３-like calcium binding protein ５)和 PKS３ 相
互作用在种子萌发、幼苗生长和气孔关闭上发挥作
用.此外,SCaBP ５ 的过表达可增强干旱诱导而降
低胁 迫 基 因 的 冷 诱 导 (Cheong et al．,２００３ ).
PKS１２ 在介导 ABA 信号中起作用(Jen et al．,
１９９ ９).PKS１ １ 在植物对糖的响应中可能介导了
Ca２＋ 信 号,且 此 功 能 不 依 赖 于 己 糖 激 酶 途 径
(Deming et al．,２００２).
对 PKS５ 前期研究发现,PKS５ 的功能缺失突
变体在外源 pH 为 ８．４ 胁迫下表现出抗性表型,进
一步的研究发现 PKS５ 对质膜上 ATPase 等位形式
之一 AHA２(Arabidop sis thaliana isoform of the
PM H＋-ATPase)存在负调控作用.其作用机理为
PKS５ 通过对 AHA２ 的 C 末端第 ９ ３ １ 位丝氨酸的
磷酸化作用解除 AHA２ 与 １ ４-３-３ 蛋白的结合,进而
调控 AHA２ 的活性而保持胞内的质子内平衡.在
酵母中的互补试验表明:PKS５ 与 SCaBP１ (SOS３-
like calcium binding protein １ )共 同 作 用 下 调
AHA２ 的活性(Anja et al．,２００７).近期又鉴定出
了参与此途径又一新的作用元件 J３(Arabidop sis
DnaJ homologous protein ３),J３ 为一分子伴侣的共
作用因子.体内 J３ 通过对 PKS５ 的活性抑制而参
与植物对外源盐碱胁迫响应(Yong et al．,２０１０).
使用 PKS５ 功能缺失突变体,对 PKS５ 在此信号途
径中的作用已有研究.然而,对该蛋白关键功能结
构域的确定以及各结构域在此信号途径中的精细作
用尚未见报道.本研究通过体外表达 PKS５ 点突变
蛋白,并对其磷酸化活性进行测试以确定其功能结
构域,研究结果将为 PKS５ 功能结构域解析及其体
内作用机理提供依据.
１　材料与方法
１．１ 植物材料、培养条件及 DNA 提取
拟南芥野生型(Columbia),pks ５ 点突变体
(TILLING 突变体,http://tilling．fhcrc．org:９３ ６ ６),
订购自 ABRC(Arabidop sis Biological Resources
Center),分 别 命 名 为 pks ５-２、pks ５-４、pks ５-５、
pks ５-６、pks ５-７,pks ５-８ 和 pks ５-９.植物种子用含
０．１％ TritonX-１００ 的 ２０％次氯酸钠消毒液在 EP
管中消毒 １ ０~１２ min,灭菌 ddH ２ O 洗 ５ 次后,点种
或平铺于 MS(Murashige and Skoog)固体培养基
上.种子在 ４ ℃下春化 ２~３ d 后移至 ２２ ℃连续或
长日照(１６ h/８ h)及短日照(８ h/１ ６ h)条件下培养.
植物基因组 DNA 提取使用 DNA 快速提取方法
(Detlef et al ．,２００２).
１．２ PKS５ 点突变及 AHA２ 序列克隆
PKS５ 序列克隆以野生型及 PKS ５ 各点突变体
基因组 DNA 为模板,通过 PCR 扩增得到野生型及
点突变 PKS５ 基因编码序列.所用正向引物为
PKS５GEXFBamHI５′-CGGGATCCATGCCAGAG-
ATCGAGATTGCC-３′反 向 引 物 为 PKS５GEXR-
EcoRI-５′GGAATTCTTAAATAGCCGCGTTTG-
TTG-３′(上海生工合成).下划线部分为 Bam HI
和 Eco RI 位点.经 PCR 扩增并进行纯化后使用标
准克隆程序克隆至 pGEX-６p-１ 载体.阳性候选克
９０４３ 期　　　　　　　　　赵菲佚等:拟南芥 PKS５ 激酶点突变体外表达与磷酸化测试
隆送上海生物工程公司测序验证.为得到 AHA２C
末端 １ ００ 个氨基酸表达片段,设计以下引物:
AHA２C１００AAFBamHI-５′CGGGATCCGCGTGG-
CTCAACTTGTTTGAG-３ 和 AHA２REcoRI-５′
GGAATTCCTACACAGTGTAGTGACTG-３′,以
pMP１ ６ ６ ３(丹麦 Anj a Thoe Fuglsang 博士提供)质
粒为模板,PCR 扩增产物克隆至 pET２８a 载体上测
序验证.所有在原核中表达的载体经测序验证后从
DH５α提取质粒再经电转化方法转入 BL２ １(DE３)
表达菌株,再次经 PCR 筛选得到阳性克隆后保存
备用.
１．３ PKS５ 点突变蛋白及 AHA２C 末端蛋白原核表达
将转入正确表达载体的 BL２ １(DE３)菌株按照
１∶１ ０００ 的比例接入含 ３０ μg·L-１ 氯霉素和 １ ００
μg·L-１的氨苄青霉素或 ５０ μg·L-１的卡那霉素的
６０ mL 的 LB 液体培养基在 ３ ７ ℃过夜小量培养,次
日将 １ ０ mL 过夜培养物转入 １ L 含 １ ００ μg·mL-１
Amp 的 LB 培养基中继续培养,当菌液 O．D．达 ０．７
时收菌,离心后沉淀加入 ３０ mL 裂解液(GST 融合
蛋白 １ ４０ mmol·L-１ NaCl,２．７ mmol·L-１ KCl,１０
mmol· L-１ Na２ HPO ４,１．８ mmol· L-１ KH ２ PO ４,
pH７．３,HIS 融合蛋白 ５０ mmol·L-１ NaH ２ PO ４,３００
mmol·L-１ NaCl,１０ mmol·L-１ imidazole,pH ８．０)
重悬,在超声破碎仪(VCX１３０,SONICS)上破碎
(２５０ W,超声 ３ s,间隔 ３ s,１ min 循环,共 ５ min)后
离心,上清液中加入 １ ００ μL GST 树脂进行蛋白结
合,最后使用洗脱缓冲液(GST 融合蛋白使用其裂
解液,HIS 融合蛋白 ５０ mmol·L-１ NaH ２ PO ４,３００
mmol· L-１ NaCl,２５０ mmol · L-１ imidazole,pH
８．０)进行洗脱得到目标蛋白.后续融合蛋白纯化方
法按 Amersham 公司的 Gluathione Sepharose ４B
树脂及 Qiagen 公司的 Ni-NTA 树脂提取方法进
行.结合于树脂上的重组目标蛋白保存于 ４ ℃冰箱
中备用.
１．４ PKS５ 点突变蛋白体外磷酸化测试
激酶体外磷酸化试验按照以下方法进行.在冰
浴 EP 管中混合激酶及测试底物蛋白 MBP 或
AHA２C１００AA,磷酸化反应使用 ２０ μL 体系进行,
计算激酶反应缓冲液(２０ mmol · L-１ Tris-HCl,
pH７．２,５ mmol·L-１ MgCl２,０．５ mmol·L-１ CaCl２,
１０ μmol·L-１ ATP,２ mmol·L-１ DTT)的用量,每
个反应使用 ２ μCi(γ-３２ P)ATP.将反应所需体积的
重组蛋白加入激酶反应缓冲液中,３０ ℃水浴中反应
３０ min 后加入 ６×SDS 蛋白载样缓冲液,并在干浴
器(SBH１３０D/３,Stuart)上 ９ ５ ℃加热 ５ min.离心
后于 １ ２％的 SDS 蛋白胶上进行变性电泳,考马斯亮
蓝染色后在脱色液中脱色,凝胶成像仪上(GelDoc-
It２ ３ １ ０,UVP)照相后使用保鲜膜包好蛋白凝胶,压
于磷屏上,次日于磷屏成像仪(STORM ８６０,Amer-
sham Biosciences)上进行成像.
２　结果与分析
２．１ PKS５ 蛋白结构与点突变位置
PKS ５ 定 位 于 拟 南 芥 第 ２ 条 染 色 体 上
(At２g３０３ ６０),其 CDS 共有 １ ３０８ 个碱基,不含内含
子.编码蛋白共有 ４３ ５ 个氨基酸,为一丝氨酸/苏氨
酸蛋白激酶.蛋白结构如图 １ 所示,整个蛋白可分
为两个大的结构,位于 N 端的激酶结构域和 C 端的
激酶调控域.激酶结构域内含有一个推测的激活环
(KDAL),调控结构域内含有两个子结构域,FISL
基序和 PPI 结构域.FISL 结构域是 PKS 家族中保
守的 结 构 域,是 与 SCaBP (SOS３-like calcium
binding protein)相互作用所必须的结构域,删除
FISL 结构域导致 PKS５ 组成型的激活.PPI 结构
域是与 ２C 型的磷酸酶相互作用所必需的,与
SCaBP 一起介导了拟南芥对 ABA 信号的响应.在
激酶结构域和 FISL 基序之间由连接结构域(JK)进
行连接.
为考察 PKS５ 结构域功能,将 PKS５ 基因序列
输入 TILLING(http://tilling．fhcrc．org:９３ ６ ６)网站
进行比对,发现在 TILLING 中心已有该基因上的 ７
个点突变体.其中 pks ５-２ 发生了 g-a 突变,造成了
氨基酸在 ２ １ ９ 位上甘氨酸变为丝氨酸(G２１ ９S);
pks ５-４ 发生了 g-a 突变,导致在 ３４１ 位的氨基酸由
谷氨酸变为赖氨酸(E３４１K);pks ５-５ 也发生了 g-a
突变,在蛋白的 １ ５ ５ 位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸
(E１５ ５K);pks ５-６ 发生了 c-t 的突变,在 ３ １ ７ 位氨基
酸由丝氨酸变为亮氨酸(S３１ ７L);pks ５-７ 发生了 c-t
的转换,在蛋白的第 １ ６ ８ 位氨基酸由丙氨酸变为缬
氨酸(A１６８V);pks ５-８ 发生了 g-a 的突变,在 ２ ７ ６
位上引入了一个终止密码子(W２７６∗);pks ５-９ 发
生了 c-t 的转变,在蛋白的第 １ ４８ 位氨基酸由脯氨
酸变为酪氨酸(P１４８Y).在各点突变中,pks ５-７ 突
变位于已知的激酶激活环内,pks ５-６ 的突变位于
FISL 基序内,而 pks ５-４ 突变位于 PPI 结构域内,
０１４ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５ 卷
图 １　PKS５ 蛋白结构示意图　KDAL．激酶催化结构域激活环;JK．连接区;FISL．FISL 基序;PPI．PP２C 蛋白磷酸酶作用结构域.
Fig．１　Structure of PKS５ protein　KDAL．Activation loop resides in the kinase catalytic domain;JK．Conjunction domain;FISL．FISL motif;
PPI．Domain interacted with the PP２C phosphorase．
图 ２　PKS５ 点突变蛋白纯化及 PKS５-２ 蛋白表达 Western 验证　A．PKS５ 纯化点突变蛋白 SDS-PAGE 电泳　M．NEB 蛋白标
准;１．PKS５ 纯化蛋白;２．PKS５-２ 点突变纯化蛋白;３．PKS５-６ 点突变纯化蛋白;４．PKS５-７ 点突变纯化蛋白;５．AHA２ C 末端 １ ００ 个氨基
酸纯化蛋白(A２C１００).B．PKS５-２ 蛋白表达杂交结果　１．PKS５ 纯化蛋白;２．PKS５-２ 点突变纯化蛋白.图中上部为使用 GST 抗体蛋白杂
交结果,下部为考马斯亮蓝染色.
Fig．２　Purification of the diverse PKS５ point mutant proteins and Western verification of the PKS５-２ expression　A．SDS-
PAGE gel electrophoresis of the purified PKS５ point mutant proteins　M．NEB protein standard;１．Purified PKS５ protein;２．Purified point mutant
PKS５-２ protein;３．Purified point mutant PKS５-６ protein;４．Purified point mutant PKS５-７ protein;５．Purified C-terminal １００ amino acids of AHA２
(A２C１００)．B．Analysis of Western blot for PKS５-２　１．Purified PKS５ protein;２．Purified point mutant PKS５-２ protein．The upper panel illustrates
the hybrid for PKS５-２ using the antibody against GST and the lower panel is the Coomassie stain．
pks ５-２ 的位置靠近激活环.
２．２ PKS５ 点突变与 AHA２C 末端蛋白的原核表达
将纯化的 PKS５ 点突变融合蛋白进行 １ ２％的
SDS-PAGE 电泳(图 ２:A).PKS５ 和所有点突变蛋
白及 AHA２C 末端 １ ００ 氨基酸均可进行表达,纯化
的蛋白除 PKS５-２ 外,其余分子量大小均与预测相
符.而 PKS５-２ 蛋白主条带不明显,为确认 PKS５-２
是否已表达及其位置,使用 GST 抗体以 Western 进
行验证,确认 PKS５-２ 得到表达,但其位置发生了变
化(图 ２:B),此可能是由于 PKS５-２ 点突变导致其
在胶上的迁移率发生变化所致.
２．３ PKS５ 及其突变蛋白的体外磷酸化活性
通过体外磷酸化测试,PKS５ 点突变蛋白的自
磷酸化活性水平与通用底物 BMP 磷酸化水平比较
(图 ３).体外自磷酸化分析表明 PKS５-２ 失去了激
酶活性.此外 PKS５-２ 以原核方式表达后其蛋白的
大小也发生了变化(图 ３:A),与 PKS５ 相比较其大
小相差约 １ ０ kD,推测 PKS５-２ 突变可能改变了蛋白
的空间结构,进而使得其迁移发生了相应的改变,从
而造成其激酶活性也丧失.由于 PKS５-２ 已不具有
激酶活性,因而在此后的研究中对激酶活性的分析
不再对 PKS５-２ 进行测试.
PKS５、PKS５-６ 和 PKS５-７ 的自磷酸化活性比
较(图 ３:B).从图 ３:B 可以看出,与 PKS５ 相比较,
PKS５-６ 和 PKS５-７ 的自磷酸化活性增强,PKS５-７
增强最多,而 PKS５-６ 次之.PKS５-６ 和 PKS５-７ 对
蛋白激酶通用底物 MBP 底物磷酸化活性能力测试
结果如图 ３:C 所示,与 PKS５ 相比较,PKS５-６ 和
PKS５-７ 的底物水平磷酸化能力也增强,PKS５-７ 增
强最多,而 PKS５-６ 则次之,与 PKS５,PKS５-６ 和
PKS５-７ 的自磷酸化活性的变化相一致.对 PKS５
其它点突变蛋白的自磷酸化与 MBP 底物磷酸化活
性测试表明:与 PKS５ 相比,PKS５-４、PKS５-５ 和
PKS５-９ 的两种磷酸化活性没有发生变化(图 ３:D),
１１４３ 期　　　　　　　　　赵菲佚等:拟南芥 PKS５ 激酶点突变体外表达与磷酸化测试
图 ３　PKS５ 点突变蛋白体外磷酸化活性分析　A．PKS５-２ 突变导致激酶活性丧失　１．PKS５ 纯化蛋白;２．PKS５-２ 点突变纯化蛋
白.B．PKS５-６、PKS５-７ 与 PKS５ 的自磷酸化活性比较　 １．PKS５ 纯化蛋白;２．PKS５-６ 点突变纯化蛋白;３．PKS５-７ 点突变纯化蛋白.
C．PKS５-６、PKS５-７ 和 PKS５ 对 MBP 底物磷酸化活性的比较　１．PKS３ 与 MBP 纯化蛋白样品;２．PKS５ 与 MBP 纯化蛋白样品;３．PKS５-６
点突变纯化蛋白与 MBP 纯化蛋白样品;４．PKS５-７ 点突变纯化蛋白与MBP 纯化蛋白样品.D．PKS５、PKS５-４、PKS５-５ 和 PKS５-９ 自磷酸化
与 BMP 底物磷酸化活性比较　１．PKS５ 与 MBP 纯化蛋白样品;２．PKS５-４ 与 MBP 纯化蛋白样品;３．PKS５-５ 点突变纯化蛋白与 MBP 纯
化蛋白样品;４．PKS５-９ 点突变纯化蛋白与 MBP 纯化蛋白样品.A,B,C,D 中上部为放射自显影结果,下部为考马斯亮蓝染色.
Fig．３　Analysis of in vitro phosphorylation activity of the PKS５ point mutant proteins　A．Mutation in PKS５-２ abolishes the activi-
ty of phosphorylation of PKS５　１．Purified PKS５ protein;２．Purified point mutant PKS５-２ protein．B．Comparison of the atuophosphorylation activity
of PKS５ with PKS５-６ and PKS５-７ 　 １．Purified PKS５ protein;２．Purified point mutant PKS５-６ protein;３．Purified point mutant PKS５-７
protein．C．Comparison of the substrate phosphorylation activity of PKS５ with PKS５-６ and PKS５-７ to MBP　１．Sample containing the purified PKS３
and MBP proteins;２．Sample containing the purified PKS５ and MBP proteins;３．Sample containing the purified point mutant PKS５-６ and MBP pro-
teins;４．Sample containing the purified point mutant PKS５-７ and MBP proteins;D．Comparison of the atuophosphorylation activity and substrate
phosphorylation activity of PKS５ with PKS５-４,PKS５-５ and PKS５-９ to MBP　１．Sample containing the purified PKS５ and MBP proteins;２．Sample
containing the purified point mutant PKS５-４ and MBP proteins;３．Sample containing the purified point mutant PKS５-５ and MBP proteins;４．Sample
containing the purified point mutant PKS５-９ and MBP proteins．The upper panels present the result of autoradiograph and the lower panels show the
Coomassie stain of pictures in A,B,C and D．
说明 PKS５ 在此位置的突变对其磷酸化活性未产生
影响.
２．４ PKS５ 及其突变蛋白对 AHA２ 的磷酸化作用
植物细胞内 pH 内平衡主要由质膜上 H＋-AT-
Pase 来保持.拟南芥 ATPase 主要等位形式 AHA２
主要分布于根中,与 PKS５ 的组织定位相一致,在根
中起着调节植物 pH 内平衡的功能.本研究前期工
作中已发现 PKS５ 可直接磷酸化 AHA２.为了进一
步解析 PKS５ 各结构域功能,我们在体外测试了当
PKS５ 在不同的结构域突变后其对 AHA２ 磷酸化
能力的变化(图 ４).从图 ４ 可以看出,当 PKS５ 在
不同结构域发生突变后,PKS５-６ 和 PKS５-７ 为功能
获得性突变,与 PKS５ 相比较 PKS５-６ 和 PKS５-７ 对
AHA２ 的磷酸化能力增强,这与 PKS５-６ 与 PKS５-７
自磷酸化能力的增强结果相一致.其中 PKS５-７ 对
AHA２ 的磷酸化能力最强,而 PKS５-６ 次之.
PKS５ 及其点突变形式 PKS５-６ 和 PKS５-７ 对
AHA２ 磷酸化的特异性在本试验中也得到了证实.
PKS３ 与 PKS５ 同属于 PKS 家族,为测试 PKS５ 是
否特异的磷酸化 AHA２,本测试中加入 PKS３ 作为
对照.结果显示:PKS３ 不能磷酸化 AHA２,因而可
证实 PKS５ 可特异的磷酸化 AHA２.此外,测试中
加入 BSA(bovine serum albumin)作为阴性对照,
结果显示 PKS５ 及其突变蛋白不能磷酸化 BSA.
３　讨论与结论
PKS５ 蛋白激酶作为拟南芥中参与外界高 pH
与盐胁迫响应信号途径中的元件,其在体内的功能
已被进行了研究(Anja et al．,２００７).由于蛋白激
２１４ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５ 卷
图 ４　PKS５ 点突变蛋白 PKS５-６、PKS５-７、PKS５ 和
PKS３ 对 AHA２ 磷酸化活性比较　 １．PKS３ 与 A２C１００
纯化蛋白样品;２．PKS５ 与 A２C１００ 纯化蛋白样品;３．PKS５-６
点突变纯化蛋白与 A２C１００ 纯化蛋白样品;４．PKS５-７ 点突变纯
化蛋白与 A２C１００ 纯化蛋白样品.图中上部为放射自显影结
果,下部为考马斯亮蓝染色,PKS３ 和 BSA 为对照.
Fig．４　Comparison of phosphorylation activity of PKS５
and PKS３ with point mutant proteins PKS５-６ and PKS５-
７ to AHA２　１．Sample containing the purified PKS３ and A２C１００
proteins;２．Sample containing the purified PKS５ and A２C１００ pro-
teins;３．Sample containing the purified point mutant PKS５-６ and
A２C１００ proteins;４．Sample containing the purified point mutant
PKS５-７ and A２C１００ proteins．The upper panel presents the result of
autoradiograph and the lower panel showes the Coomassie stain．
PKS３ and BSA serve as controls in this assay．
酶的结构特点,当激酶不同结构域上发生突变可能
会使激酶活性发生改变.本研究结果证实:当
PKS５ 在不同结构域发生突变后的确会改变其激酶
活性.一种激酶在体内功能的体现主要在于其自身
磷酸化或对其底物的磷酸化作用上.一般而言,一
种激酶磷酸化其特异底物的前提是其自身的磷酸化
能力.对 PKS５-２ 而言,在此位置发生突变后使激
酶的自磷酸化与底物水平的磷酸化活性丧失,而
PKS５-６ 和 PKS５-７ 激酶的两种磷酸化活性与野生
型相比较则增强(图 ３:A-C).PKS５-４,PKS５-５ 与
PKS５-９ 突变蛋白两种磷酸化活性与 PKS５ 相比无
变化,说明此位点的突变对蛋白的结构或其功能未
产生影响(图 ３:D).
在本研究中,与 PKS５ 的激酶活性相比较,
PKS５-２ 的自磷酸化与对 AHA２ 的磷酸化活性丧
失,而 PKS５-６ 和 PKS５-７ 的两种磷酸化活性增强,
两者呈现相反的结果,说明 PKS５ 不同的结构域突
变对激酶的磷酸化活性会产生不同的影响,进而可
能使其在体内的功能也发生变化.试验中使用激酶
阴性通用底物 BSA 作为对照,PKS３ 和 PKS５ 及
PKS５-６、PKS５-７ 均不能磷酸化 BSA,表明 PKS５ 对
AHA２ 的磷酸化作用具有特异性,推测 PKS５ 体内
功能也同样具有特异性.
植物体内的激酶通过对其底物磷酸化作用从而
对各种生理功能进行调节.其调节可能也存在体内
磷酸酶对相同底物的去磷酸化作用.体内激酶一方
面可磷酸化下游底物,另一方面也可能受到其上游
调控元件的调控,此过程如果是受另一种上游蛋白
激酶调控,由此便构成了磷酸化级联过程(Uner et
al．,２００４).PKS５ 在体内对 AHA２ 的调节是通过
磷酸化其第 ９ ３ １ 位的丝氨酸而实现,而此变化阻碍
了 AHA２ 与 １ ４-３-３ 蛋 白 的 相 互 作 用.已 知
AHA２C 末端第 ９４７ 位苏氨酸的磷酸化是其与 １ ４-
３-３ 蛋白相互作用的前提,推测此位点磷酸化由体
内未知激酶作用而产生.近期发现 PKS５ 在体内与
SCaBP８ 存在相互作用,并通过磷酸化过程参与对
外界的盐碱调节过程(Changgen et al．,２００９),也发
现 PKS５ 通过对植物抗病途径中一个主要共激活子
NPR１(Nonexpressor of Pathogenesis-Related gene
１)的磷酸化过程而介导了 WRKY３８(WRKY DNA-
binding protein ３８ )与 WRKY６２ (WRKY DNA-
binding protein ６２)的表达而参与了植物的抗病过
程(Xie et al．,２０１０).PKS５ 参与植物体内的多种
调控过程说明其功能的重要性与多样性.蛋白激酶
功能是通过磷酸化其所参与的信号转导过程中的下
激信号元件实现,其激酶活性的改变是其调控作用
的主要方式.本研究结果显示其不同的结构域在激
酶活性中起着不同的作用,可推测 PKS５ 的激酶活
性在体内也同样受到严格的调控,此精细调控可能
是通过对其不同的结构域的调节而实现.本研究仅
通过体外测试方式对 PKS５ 不同点突变蛋白的激酶
活性进行研究,对 PKS５ 点突变在体内的活性测试
以及筛选与 PKS５ 有相互作用的元件是本研究的进
一步工作.
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作者： 赵菲佚， 焦成瑾， 陈荃， 马伟超， 安建平， 呼丽萍， ZHAO Fei-Yi， JIAO Cheng-Jin
， CHEN Quan， MA Wei-Chao， AN Jian-Ping， HU Li-Ping
作者单位： 赵菲佚,呼丽萍,ZHAO Fei-Yi,HU Li-Ping(天水师范学院 生命科学与化学学院，甘肃 天水
741000; 甘肃大樱桃工程技术中心，甘肃 天水 741000)， 焦成瑾,陈荃,马伟超,安建平
,JIAO Cheng-Jin,CHEN Quan,MA Wei-Chao,AN Jian-Ping(天水师范学院 生命科学与化学学
院,甘肃 天水,741000)
刊名： 广西植物
英文刊名： Guihaia
年，卷(期)： 2015(3)

参考文献(16条)
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引用本文格式：赵菲佚.焦成瑾.陈荃.马伟超.安建平.呼丽萍.ZHAO Fei-Yi.JIAO Cheng-Jin.CHEN Quan.MA Wei-
Chao.AN Jian-Ping.HU Li-Ping 拟南芥 PKS5激酶点突变体外表达与磷酸化测试[期刊论文]-广西植物 2015(3)