全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (4): 373~378 373
收稿 2010-12-14　　修定 2011-01-26
资助 国家自然科学基金重点项目(30730078)和中央高校基本科
研业务费专项资金(DL09BA09)。
* 通讯作者 (E-ma i l : l yhshen@126 .com; Te l : 0451-
82191783)。
‘津田’ 芜菁Transparent Testa Glabra 1 (BrTTG1)基因的克隆及表达分析
闫海芳, 李玉花*, 刘振华, 闵远琴
东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨150040
摘要: TTG1 (Transparent Testa Glabra 1)蛋白是一种WD40类蛋白, 参与植物的生长和发育。采用RT-PCR方法从芜菁品种
‘津田’中克隆了BrTTG1 cDNA序列(GenBank登录号HM208590)。该基因cDNA开放阅读框长度为1 014 bp, 编码一个由337
个氨基酸残基组成的蛋白, 该蛋白分子量为37.28 kDa, 理论等电点为4.66。与其他植物中的TTG1蛋白进行同源性比对结
果显示, BrTTG1与甘蓝型油菜的TTG1同源性最高。BrTTG1蛋白在31~337位氨基酸处含有WD40超家族的保守结构域。
荧光定量PCR检测BrTTG1在‘津田’芜菁不同组织中的表达结果表明, 该基因在有花青素合成的红色‘津田’芜菁根皮中表达
量最高。
关键词: ‘津田’芜菁; TTG1; 基因克隆; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of Transparent Testa Glabra 1 (BrTTG1) in
Brassica rapa L. cv. ‘Tsuda’
YAN Hai-Fang, LI Yu-Hua*, LIU Zhen-Hua, MIN Yuan-Qin
College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: TTG1 (transparent testa glabra 1) is a WD40 protein that is involved in plant growth and develop-
ment. Here, a homologue of transparent testa glabra 1 gene, designated BrTTG1, was isolated from ‘Tsuda’
(Brassica rapa L.) by RT-PCR (GenBank accession number HM208590). The ORF of the BrTTG1 was 1 014
bp long and encoded a putative protein of 337 amino acids with a molecular weight of 37.28 kDa and a theoreti-
cal pI of 4.66. BrTTG1 protein contained a WD40 superfamily conserved domain and had a high identity with
TTG1 homologous member from Brassica napus. Quantitative-PCR analysis showed that the BrTTG1 was the
highest expressed in the in red root of turnip.
Key words: Brassica rapa L. cv. ‘Tsuda’; TTG1; gene cloning; expressing analysis
TTG1是一类WD40蛋白, 这类蛋白结构高度
保守, 每个WD基序由大约40个氨基酸残基组成保
守序列, 该序列以N末端11~24个残基处GH二肽
(Gly-His, GH)开始, C末端WD结尾(Trp-Asp, WD),
这是一个高度保守的核心区域, 称为WD40基序
(Neer等1994; Smith等1999), 这种基序在同样的蛋
白中一般可串联4~16个。该结构域赋予WD40蛋
白家族成员一个共同的特征: 介导蛋白质之间的
互作、调整多蛋白复合物的装配, 其重复的WD基
元作为蛋白质互作的支架, 可以同时参与几个蛋
白质的相互作用, 但是缺乏DNA结合区域, 并且
没有任何酶类的催化功能(Smith等1999; Tyers和
Willems 1999)。
目前, 有关植物WD40蛋白的研究还不多, 主
要局限于拟南芥(Arabidopsis thaliana) WD40蛋白
家族, 它们在花青素合成、分生组织形成、幼苗
发育、花发育、光信号传递和感知等方面具有
重要的作用(Ullah等2003; Yamagishi等2005)。拟
南芥WD40蛋白类TTG1通过与bHLH类转录因子
GL3、EGL3和TT8 (Zhang等2003)以及MYB类转
录因子拟南芥TT2或PAP1 (Baudry等2004; Ramsay
和Glover 2005)相互作用来实现控制花青素结构基
因的时空表达(Nesi等2001)。在前期研究UV-A光
诱导花青素合成中发现, ‘津田’芜菁中存在特殊的
调节途径来特异的调控花青素的合成, 因此TTG1
作为花青素合成调控因子, 克隆该基因、研究该
基因的表达特性就尤为重要(Zhou等2007)。本研究
植物生理学报374
根据已经报道的甘蓝型油菜序列设计引物, 通过
RT-PCR扩增克隆获得‘津田’芜菁TTG1基因cDNA
片段, 并对该基因在‘津田’芜菁不同组织中的表达
进行分析。
材料与方法
温室中生长至2个月的‘津田’芜菁(Brassica
rapa L. cv. ‘Tsuda’)膨大根的白色根皮、红色根
皮、根肉、叶子、花瓣和花蕾为试验材料, 放在液
氮中速冻后置于-80 ℃超低温冰箱中贮存待用。
以‘津田’芜菁膨大根的白色根皮、红色根
皮、根肉、叶子、花瓣和花蕾为试验材料, 采用上
海宝生生物公司的Trizol试剂提取该组织总RNA,
进行RNA质量和浓度检测后取红色根皮1 μg总
RNA用于cDNA第1链的合成。参照TaKaRa公司
的RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒说明书合成
cDNA第1链。以甘蓝型油菜TTG1基因(GenBank
登录号EF175929)核酸序列为参考设计完整cDNA
序列PCR引物: BrTTG1-F, 5-AGAGAGAGAGA-
GAGACGATG-3; BrTTG1-R, 5-ATCTCAAA-
CTCTAAGGAGCT-3。用cDNA第一链为模板,
PCR条件为: 94 ℃ 3 min预变性; 94 ℃ 30 s, 52 ℃
30 s, 72 ℃ 90 s, 35个扩增循环; 最后72 ℃延伸10
min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测、回收
目的条带 , 与pGEM-T载体(TIANGENE)连接 ,
16 ℃过夜。连接产物转化到大肠杆菌TOP10, 在
X-gal/IPTG琼脂糖平板上挑选白色克隆, 由宝生物
(大连)有限公司完成序列测定。
BrTTG1基因生物信息学分析采用下列方法:
(1) BrTTG1序列同源性比对由NCBI的BLAST程序
进行(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。(2)蛋白
质一级结构(等电点、分子量)的预测由ProtParam
完成(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)。
(3)氨基酸的多序列比较用Clustalx进行, 并用BOX-
SHADE软件进行处理 , 进化树的构建由DNA-
MAN-Tree View程序完成。
BrTTG1基因在‘津田’芜菁膨大根的白色根
皮、 红色根皮、根肉、叶子、花瓣和花蕾的表达
表达分析采用7500 Real Time PCR System (Applied
Biosystems, USA)。所用BrTTG1引物为BrTTG1-F:
5-GGTGAGGATCTTCGATCTGC-3, BrTTG1-R:
5-CCTCAAGTCCTGCTTGTTCC-3; 内标BrAC-
TIN引物为BrACTIN-F: 5-GCTCAGTCCAAGA-
GAGGTATTC-3, BrACTIN-R: 5-GCTCGTTGTA-
GAAAGTGTGATC-3。所用试剂为SYBR® Premix
Ex TaqTM (TaKaRa, Japan)。10 μL反应体系中包括
5 μL SYBR® Premix Ex TaqTM, 0.2 μL ROX Refer-
ence Dye (50×) (TaKaRa, Japan), 4.5 μL ddH2O
(TIANGEN, China), 1/6 μL cDNA, 1/3 μL引物混合
液(含正向引物和反向引物, 10 μmol·L-1)。采用的
Real-Time PCR程序如下: 95 ℃ 30 s 进行预变性,
40个扩增循环(95 ℃ 10 s, 60 ℃ 31 s), 最后是一个
从60 ℃加热到90 ℃的溶解过程。以BrACTIN的转
录表达水平为内参, 目的基因相对转录表达水平
的计算参照Bogs等(2005)的方法 , 公式为2-∆Ct,
∆Ct=Ct目的基因-CtACTIN。每个样品设3个生物学重复
试验。
结果与讨论
1 BrTTG1基因的克隆
以甘蓝型油菜基因TTG1序列为参考紧邻起
始密码和终止密码设计引物, 以‘津田’芜菁cDNA
第1链为模板, 进行RT-PCR扩增, 得到约1 000 bp的
片段(图1)。连接到T载体且转化TOP10后, 挑取阳
性克隆测序。测序结果用NCBI的BLAST程序检
图1 ‘津田’ 芜菁BrTTG1基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of amplification product of
BrTTG1 from B. rapa L. cv. ‘Tsuda’
M: DL2000, 条带由大到小分别为 2 000、1 000、750、500、
250和100 bp。
闫海芳等: ‘津田’ 芜菁Transparent Testa Glabra 1 (BrTTG1)基因的克隆及表达分析 375
索数据库, 显示该序列与甘蓝型油菜和花椰菜具
有极高的同源性, 高达99%以上, 确定该片段为‘津
田’芜菁的BrTTG1基因。‘津田’芜菁的BrTTG1基
因的全长为1 014 bp (图2), GenBank登录号为
HM208590。
2 BrTTG1及其编码蛋白的生物信息学分析
BrTTG1的cDNA序列含有一个长度为1 014
bp ORF, 编码一个由337个氨基酸残基组成的蛋白,
蛋白分子量为37.28 kDa, 理论等电点为4.66 (图
2)。使用NCBI的蛋白BLAST比对发现, BrTTG1蛋
白在141~290位氨基酸处含有保守的WD40结构域,
表明该蛋白为WD40超家族的一员(图3)。相似性
比较发现 , B r T T G 1蛋白与来自甘蓝型油菜
(TTG1)、花椰菜(WD40)、拟南芥(TTG1)、烟草
(TTG1)和紫罗兰(TTG1)的同源蛋白有很高的一致
性, 分别是99.7%、99.4%、96.4%、96.4%和94.9%
(图4)。为了进一步了解BrTTG1蛋白与其他植物
TTG1蛋白的亲缘关系, 将上述进行同源性比较的
图2 ‘津田’ 芜菁BrTTG1基因的cDNA序列及其推测的氨基酸序列
Fig.2 cDNA sequence of BrTTG1 gene and its deduced amino acid sequence in B. rapa L. cv. ‘Tsuda’
用﹡号标出的为终止密码子, 下划线处碱基编码 WD40结构域。
植物生理学报376
图3 ‘津田’ 芜菁BrTTG1蛋白WD40功能域
Fig.3 WD40 domain of BrTTG1 in B. rapa L. cv. ‘Tsuda’
图4 BrTTG1与其他同源蛋白氨基酸序列比对
Fig.4 Alignment of the amino acid sequence of BrTTG1with that of other homologous
黑色阴影显示相同位点(指的是用来比对的所有序列在这些位点均相同), 灰色阴影显示保守位点(指的是所有对比序列在这些位点大
部分相同)。各物种同源蛋白有: 甘蓝型油菜(Brassica napus, TTG1-1, EF175929); ‘津田’ 芜菁(Brassica rapa, BrTTG1, HM208590); 花椰菜
(Brassica oleracea, BoTTG1, GU219991); 拟南芥(Arabidopsis thaliana, AtTTG1, AJ251523); 烟草(Nicotiana tabacum, NtTTG1, FJ346578); 紫
罗兰(Matthiola incana, MiTTG1, AJ586861)。
闫海芳等: ‘津田’ 芜菁Transparent Testa Glabra 1 (BrTTG1)基因的克隆及表达分析 377
蛋白进行了系统发生分析。如图5所示, ‘津田’芜
菁BrTTG1与甘蓝型油菜TTG1和花椰菜WD40属
于同一亚簇, 与甘蓝型油菜TTG1的亲缘关系更为
相近, 而与拟南芥、烟草和紫罗兰则相对较远。
这与我们克隆基因时, 参考物种序列设计引物遇
到的问题一致, 我们最初克隆BrTTG1基因时参考
拟南芥TTG1基因设计了引物, 未得到相应长度的
克隆片段(结果未显示)。
3 BrTTG1的组织表达特征分析
基因的表达特性与其生理功能密切相关。我
们提取‘津田’芜菁不同组织来源的总RNA, 以‘津
田’芜菁的ACTIN基因作为内参照, 对BrTTG1基因
进行定量PCR分析。结果(图6)显示: ‘津田’芜菁
BrTTG1基因在产生大量花青素的红色根皮部大量
表达, 说明BrTTG1基因的表达与花青素的合成直
接相关, 在‘津田’芜菁根部肉质中表达次之, 有较
图5 六种植物中TTG1进化分析
Fig.5 Phylogenetic analysis of TTG1 in six plants
蛋白质及其索引号同图4。
图6 定量PCR分析 ‘津田’ 芜菁不同组织BrTTG1基因表达
Fig.6 Expression of BrTTG1 gene in various B. rapa L.
cv. ‘Tsuda’ tissues by Quantitative-PCR assay
少量表达, 而此部分与大量花青素合成的根皮紧
邻, 也有微量花青素合成(闫海芳2003)。而在无花
青素合成的白色根皮、叶子、花瓣、花蕾中也有
少量表达。说明‘津田’芜菁WD40家族蛋白BrT-
TG1在不同组织中都有表达, 只是表达量有所不
同, 进一步证明BrTTG1蛋白在‘津田’芜菁中发挥
的功能也相当广泛。这与在拟南芥中发现的TTG1
蛋白功能相一致, 调控类黄酮/花青素的合成(Ram-
say和Glover 2005)、种皮的发育以及叶表皮毛的
形成等多种功能(Larkin等1994, 1999; Walker等
1999; Payne等2000; Ramsay和Glover 2005)。目前
只知道WD40蛋白可以与bHLH类以及MYB类调
控因子广泛的作用, 定位于细胞质或细胞核中, 但
是作用机理还不清楚(Baudry等2004; de Vetten等
1997; Sompornpailin等2002)。总之, BrTTG1基因
的克隆, 以及对该基因在‘津田’芜菁中不同组织中
表达的分析为进一步研究TTG1在‘津田’芜菁中的
功能, 进一步探讨其作用机理奠定了基础。
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