全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(1): 6671 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由中央高校基本科研业务费专项(DL12CA10, DL11CA03, 2572014EA03-02)和国家基础科学人才培养基金(J1210053)资助。
通讯作者(Corresponding author): 闫海芳, E-mail: icyhf@yahoo.com
Received(收稿日期): 2014-06-20; Accepted(接受日期): 2014-09-30; Published online(网络出版日期): 2014-11-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141111.1556.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00066
津田芜菁泛素化相关蛋白基因 BrRUB1的克隆及表达分析
闫海芳* 王 斐 李 桥 李鸿昌 杨虎城
东北林业大学生命科学学院, 黑龙江哈尔滨 150040
摘 要: RUB1 (related to ubiquitin 1)是植物和酵母中一种泛素类似蛋白质, 是 Cullin家族的一个成员。为阐释津田芜
菁 BrRUB1 基因的表达特性, 本研究克隆了津田芜菁 RUB1基因的全长 cDNA 序列, 命名为 BrRUB1, GenBank 登录
号为 KF501173。其 ORF全长 471 bp, 编码 156个氨基酸; 亚细胞定位结果显示, BrRUB1-GFP定位于细胞核, 表明
BrRUB1蛋白可能在细胞核中发挥其功能。qRT-PCR检测 BrRUB1的表达表明, 该基因表达量在花蕾中最高, 花瓣中
次之, 具有组织特异性。而且 Br RUB1在芜菁根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导。
关键词: 津田芜菁; RUB1; 基因克隆; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of Ubiquitin-Related Protein Gene BrRUB1 in
Brassica rapa L. cv. Tsuda
YAN Hai-Fang*, WANG Fei, LI Qiao, LI Hong-Chang, and YANG Hu-Cheng
College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: RUB1 (related to ubiquitin 1) is a ubiquitin-like protein in plant and yeast, belong to Cullin family. To elucidate the
expression feature of RUB1 in Tsuda, we isolated cDNA of RUB1 gene from this plant and named BrRUB1 (GenBank accession
No. KF501173). The cDNA of BrRUBI was 670 bp in full length and its open reading frame (ORF) was 471 bp in full length,
encoding 157 amino acids. BrRUB1-GFP was localized to nucleus, indicating that BrRUB1 may play an important role in the
nucleus. qRT-PCR analysis showed that BrRUB1 expressed highly in bud and less in petal, showing tissue specificity. Furthermore,
the expression of BrRUB1 was induced by UV-A light in the swollen hypocotyls.
Keywords: Brassica rapa; RUB1; Gene cloning; Expression analysis
RUB1 (related to ubiquitin 1)是植物和酵母中一
种类似泛素分子的蛋白质 , 在哺乳动物中又称为
NEDD8 蛋白(neural precursor cell-expressed, deve-
lopmentally down-regulated protein)。RUB1是泛素化
E3 连接酶家族 Cullin 家族的一个成员, 它可以对蛋
白质肽链进行修饰, 也可以被参与调控植物体感受
激素信号的蛋白 AXR1 (auxin resistant1)和 ECR1
(erythrocyte complement receptor type1)以异源二聚
体的形式构成 RUB激活酶, 与 Cullin蛋白内保守的
赖氨酸残基结合, 正调控 Cullin蛋白组成的 E3复合
体, 加强 E3复合体和 Ub-E2复合体的稳定性, 影响
生物体内多种调节蛋白的功能, 从而调控植物体生
长发育与形态建成[1-3]。
RUB1 作为泛素调控途径的一员, 除了参与植物
生长发育和形态建成外, 还在包括植物膜受体的内
在化、染色质异构、转录激活以及 DNA修复、植物
应对干旱和冷害等非生物胁迫反应中发挥功能[4-7]。
津田芜菁(Brassica rapa L. cv. Tsuda)膨大的肉质根不
见光部分呈白色, 无花青素的合成; 而见光部分呈紫
色, 有花青素的合成。单色光中只有在 UV-A诱导下
可合成花青素[8]。本文根据已经报道的拟南芥序列,
通过 RT-PCR结合 RACE技术克隆了芜菁 BrRUB1基
因, 并对该基因的定位和表达进行研究, 以期为深入
探讨 RUB1在芜菁中的功能提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料处理
样品为温室中生长至60 d的津田芜菁(Brassica
第 1期 闫海芳等: 津田芜菁泛素化相关蛋白基因 BrRUB1的克隆及表达分析 67
rapa L. cv. Tsuda)膨大根部的白色根皮(不见光)、红
色根皮(自然光下)、叶片, 以及长至5个月的津田芜
菁花瓣和花蕾(0.8 cm), 另取60 d的津田芜菁白色根
皮用UV-A光(352 nm, 15 W m–2)处理1、3、6和24 h。
将样品放在液氮中速冻后于–80℃超低温冰箱贮存
待用。将UV-A光照处理的根皮(1 cm×1 cm)置色素提
取液(含1%盐酸的甲醇溶液)中, 4℃放置24 h[9]。测定
样品在530 nm的光吸收。以OD值表示花色素苷的含
量, 重复测定3次, 生物学重复3次。
1.2 RNA的提取和 cDNA第 1链的合成
以芜菁根白色根皮、UV-A 处理过的白色根皮,
红色根皮、叶片、花瓣和花蕾为试验材料 , 采用
CTAB法提取各组织总 RNA, 检测 RNA质量和浓度
后, 取红色根皮 1 µg 的总 RNA 用于 cDNA 第 1 链
的合成。
1.3 rRUB1的 cDNA克隆与序列测定
参照 TaKaRa公司的 RNA PCR Kit (AMV) Ver.
3.0试剂盒说明书合成 cDNA第 1链。依据 GenBank
中亲缘关系相近的物种拟南芥 AtRUB1 基因的核苷
酸序列, 应用 PrimerPremier 5.0设计引物 BrRUB1-F:
5′-GAGAATTTAAGCAAGAAAAG-3′; BrRUB1-R:
5′-ACAGCAAAGCATCAGACC-3′, 由华大生物公司
合成。以 cDNA 第一链为模板。PCR 条件为 94℃
3 min 预变性, 94℃ 30 s, 52℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30
个扩增循环, 最后 72℃延伸 10 min。PCR扩增产物
经 0.8%琼脂糖凝胶检测、回收目的条带, 与 pGEM-T
Vector (Promega)链接, 16℃过夜, 连接产物转化到
大肠杆菌 TOP10, 在 X-gal/IPTG 琼脂糖平板上挑选
阳性克隆, 并进行 PCR和酶切鉴定, 采用Amersham
phamacia Biotech Inc.提供的 MegaBACE 500毛细管
自动测序仪测序。测序引物分别为 pGEM-T 载体引
物 T7和 SP6, 完成测序。
在已获得 ORF序列的基础上利用 cDNA末端快
速扩增(RACE)法克隆 3-DNA 序列[10], 以红色根皮
1 μg 总 RNA 为模板 , 以 oligo(dT)17 接头引物
5′-GACTCGAGTGCACATCG(T)17-3′及反转录酶 III
(Invitrogen)合成第一链 cDNA。参考已获得的 ORF
序列设计的 5′引物 BrRUB1-F: 5′-ATTGATCGCA
TCAAGGAGCG-3′和接头引物 5′-GACTCGAGTGC
ACATCG-3′进行 PCR扩增。扩增条件为 94℃预变性
5 min, 随后 30个循环, 每循环 94℃变性 30 s、54℃退
火扩增 30 s、72℃延伸 90 s, 完成最后一个循环后,
72℃延伸 10 min。PCR 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶
检测, 回收纯化、克隆、质粒提取、测序同 cDNA
克隆。
根据获得的基因序列设计拼接引物 BrRUB1-
cDNA-F: 5′-GAGAATTTAAGCAAGAAAAG-3′和接
头引物克隆该基因全长 cDNA。PCR 产物的回收纯
化、克隆、质粒提取、测序同 cDNA克隆。
1.4 津田芜菁 BrRUB1基因生物信息学分析
BrRUB1 基因序列同源性比对由 NCBI 的
nucleotide BlastN 程序进行 (http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/blast/)。BrRUB1保守性功能域分析由 NCBI
的 protein BlastP 程序进行 (http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/blast/)。核定位信号分析由 SignalP4.1 程序
预测 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。进化
树的构建由 MEGA5程序完成。
1.5 基因组 BrRUB1的分离
取津田芜菁新鲜的嫩叶, 用 CTAB 法提取基因
组 DNA。根据所得的 BrRUB1全长 cDNA序列, 分
2 段设计特异性引物 BrRUB1-D1-F: 5′-ATGCAGAT
CTTCGTCAAAACCCTGAC-3′、BrRUB1-D1-R: 5′-T
CCCCACCAAAACCAGAAGAGATC-3′, 用 LA Taq
DNA 聚合酶(TaKaRa)进行 PCR 扩增。反应条件为
94℃变性 30 s, 55℃退火 30 s, 72℃延伸 2 min, 35个
循环后, 72℃延伸 7 min。PCR 产物经回收, 插入
peasy-T1载体, 转化到大肠杆菌Top10中, 选择阳性
克隆测序。
1.6 BrRUB1基因在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位
用高保真酶和加有酶切位点的引物对测序验证
过的含有目的基因的质粒DNA进行扩增, 凝胶电泳
回收目的基因片段。用 Sal I和 Spe I双酶切 PCR产
物和 pA7-GFP vector, 经回收、连接、转化、提取质
粒 DNA鉴定。利用真空渗透的方法将构建好的重组
质粒(瞬时表达载体)转入洋葱表皮细胞, 取 1.5 cm×
1.5 cm 该洋葱表皮, 在培养基上面铺一层滤纸, 培
养洋葱表皮细胞时, 培养 16 h, 用 Zeiss 510 nete激
光共聚焦扫描显微镜观察。以激发波长为 488 nm和
505~550 nm扫描图像, 使用 Zeiss LSM软件将其抓
获, 并使用 Adobe Photoshop 软件处理系统, Moun-
tain View, CA[11]。
1.7 津田芜菁 BrRUB1 在芜菁不同组织和 UV-A
处理芜菁根白皮的表达
用 7500 Real time PCR System (Applied Biosys-
tems, 美国)检测 BrRUB1 基因在芜菁膨大根的白色
根皮、红色根皮、叶片、花瓣、花蕾以及 UV-A 处
68 作 物 学 报 第 41卷
理不同时间芜菁根白皮中的表达。所用 BrRUB1 引
物为 BrRUB1-F: 5′-ATTATCCCTTCAAGCCACC-3′;
BrRUB1-R: 5′-AACGAGCAGATCGACAGC-3′。内标
BrActin引物为 BrActin-F: 5′-GCTCAGTCCAAGAG
AGGTATTC-3′; BrActin-R: 5′-GCTCGTTGTAGAAA
GTGTGATC-3′。所选用的试剂为 ABI 公司的 High-
Capacity cDNA Reverse Transcription Kits及 Power
SYBR Green PCR Master Mix。20 µL反应体系中包
括 10 µL Power SYBR Green PCR Master Mix, 8.4 µL
cDNA(稀释后), 正向引物和反向引物各 0.8 µL (10
µmol L–1)。采用的 Real-time PCR程序为 95℃ 30 s
预变性, 40个扩增循环(95℃ 10 s, 60℃ 34 s), 从 60℃
加热到 90℃的熔解过程。以 BrActin 的转录表达水
平为内参 , 目的基因相对转录表达水平为 2–ΔCt,
ΔCt=Ct (目的基因) – Ct (Actin)。每个样品设 3个试
验重复, 生物学重复 3次。
2 结果与分析
2.1 津田芜菁 BrRUB1基因的 cDNA克隆及序列
分析
克隆到的 BrRUB1基因的 cDNA全长为 650 bp,
ORF 区为 471 bp, 编码 156 个氨基酸, 基因组全长
945 bp, 含有 3 个外显子和 2 个内含子, 内含子为
174 bp (intron1)和 121 bp (intron2) (图 1)。蛋白质基
本性质分析工具(ProtParam)分析显示, BrRUBI蛋白
质的分子量为 17.413 kD; 等电点(pI)为 5.77, 其中
带负电荷的氨基酸残基为 25个, 带正电荷的氨基酸
残基有 23个, 分子式为 C771H1283N211O240S2, 原子总
数是 2507; 不稳定系数为 38.15, 属于稳定蛋白; 代
表亲水性的 GRAVY值约为–0.383; 表明 BrRUBI为
亲水性蛋白; 蛋白质结构域的预测显示, BrRUB1具
有 UBQ-E2泛素结合酶位点, 与泛素、NEDD8高度
相似, 属 UBQ超家族。
从NCBI数据可搜索拟南芥、玉山筷子芥和小麦
等9个物种的10个RUB基因, 氨基酸序列同源性分析
表明, BrRUB1与这10个RUB的同源性都很高, 达到
90%以上。其中BrRUB1与同为双子叶、十字花科植
物拟南芥的At RUB1(NP_564379.2)同源性最高达
96%, 与玉山筷子芥的Al RUB1 (XP_002891151.1)同
源性为95%, 与拟南芥的At RUB2(NP_565812.1)
同源性为94%, 它们4个RUB1在进化上属于同一
个进化分支。BrRUB1与其他科植物的RUB1同源
性也很高 , 与野生稻(XP_006660632.1)、谷子(XP_
004965723.1)、大豆 (NP_001276242.1)、番茄 (XP_
004248366.1)的同源性都为95%, 与小麦(EMS64626.1)、
玉米(NP_001148606.1)的同源性都为94%, 这6个物
种的RUB1则属于另一个进化分支(图2)。
2.2 BrRUB1的亚细胞定位
对BrRUB1氨基酸序列进行核定位信号预测 ,
图 1 津田芜菁BrRUB1基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
(框内为内含子)
Fig. 1 cDNA and deduced protein sequence of BrRUB1 from
Tsuda (introns are boxed)
图 2 BrRUB1进化树分析
Fig. 2 BrRUB1 phylogenetic tree
用 1000个重复进行 BootStrap检验, 可信度超过 25%的在接点部
位标出。
The numbers next to the nods indicate bootstrap values of more
than 25% support from 1000 replicates.
第 1期 闫海芳等: 津田芜菁泛素化相关蛋白基因 BrRUB1的克隆及表达分析 69
结果显示该蛋白不具有核定位信号。我们构建了
BrRUB1-GFP瞬时表达载体(图3), 将其转入洋葱表
皮细胞中,并获得了瞬间表达。利用激光共聚焦显微
镜检测表明, 绿色荧光集中分布在细胞核中, 说明
BrRUB1蛋白定位于细胞核(图4)。
图 3 pBrRUB1-GFP表达载体示意图
Fig. 3 Schematic diagram of pBrRUB1-GFP construct
图 4 BrRUB1的亚细胞定位
Fig. 4 Subcellular localization of BrRUB1
GFP和 BrRUB1-GFP在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位。标尺为 100 μm。
Subcellular localization of GFP and BrRUB1-GFP in onion epidermal cells. Bar=100 μm.
2.3 BrRUB1基因表达分析
2.3.1 津田芜菁 BrRUB1基因组织特异性表达
提取芜菁不同组织来源的总 RNA, 以芜菁的
Actin基因作为内参照, 对 BrRUB1基因 qRT-PCR分
析。显示(图 5), 津田芜菁 BrRUB1 在花蕾中表达量
最高, 在花瓣中次之。在有花青素合成的红色根皮
中有少量表达, 在叶和白色根皮中表达量最低。说
明 BrRUB1 基因在芜菁中的表达有较高的组织表达
特异性。
2.3.2 UV-A光诱芜菁根皮中花青素含量检测
温室中长至 60 d的津田芜菁, 取白色根皮进行
图 5 qRT-PCR分析芜菁不同组织中 BrRUB1基因的表达
Fig. 5 Expression of BrRUB1 gene in various Tsuda tissues by
qRT-PCR
UV-A光照诱导花青素合成, 分别取照射 0、1、3、6
和 24 h后的样品检测。在 UV-A光照诱导 1 h后花
青素含量未见明显升高, 3 h后有微量花青素开始合
成, 并且在 6 h和 24 h后花青含量持续增高(图 6)。
2.3.3 UV-A 光诱导 BrRUB1 在津田芜菁白根皮中
的表达 津田芜菁根皮花青素合成受 UV-A 光的
诱导(图 6)。我们提取 UV-A处理 1、3、6和 24 h后
的津田芜菁肉质根皮总 RNA, 以芜菁的 Actin 基因
作为内参照, 对 Br RUB1基因 qRT-PCR分析显示(图
7)白皮中 BrRUB1的表达受 UV-A光诱导, 长于 1 h
的使 BrRUB1 表达量增加, 处理 6 h 后表达量最高,
图 6 UV-A光照诱导芜菁白色根皮花青素合成含量.
Fig. 6 Content of anthocyanin in white root epidermis of
Tsuda induced by UVA
70 作 物 学 报 第 41卷
图 7 qRT-PCR分析 UV-A光照诱导芜菁白根皮 BrRUB1基因
表达
Fig. 7 Expression of BrRUB1 gene induced by UV-A in white
root epidermis by qRT-PCR assay
而处理 24 h后 BrRUB1的表达量较处理 6 h明显下
降。表明 UV-A诱导 BrRUB1的表达与 UV-A光诱导
花青素合成含量相一致, 花青素合成和 BrRUB基因
的表达趋势相比存在滞后, 这可能与启动花青素合
成相关基因表达需要一定时间有关。
3 讨论
本研究克隆了芜菁泛素化相关基因 BrRUB1 基
因, BrRUB1基因含有 3个外显子和 2个内含子。内
含子的边界并不符合 GT-AG规则, GT-AG规则主要
适用于真核生物基因的剪接位点, 但是也有例外, 比
如甘蓝中硫氧还蛋白编码基因 BoTHL1, 沙冬青低温
诱导基因 AmCIP 等基因的内含子也不符合[12-13]。此
外, 这种保守性也不适用于线粒体、叶绿体和酵母
tRNA基因转录后的加工。该基因的 cDNA序列含有
一个 471 bp的开放读码框, 编码一个 156个氨基酸
的蛋白质。氨基酸序列分析表明, BrRUB1 是泛素
(UBQ)类似物, 是 RUB/Nedd8家族的成员, BrRUB1
氨基酸序列中具有保守的泛素结合酶作用位点。氨
基酸同源性分析结果表明, 芜菁 BrRUB1 与拟南芥
AtBrRUB1的同源性最高, 与拟南芥 AtBrRUB1、玉
山筷子芥 AlBrRUB1、拟南芥的 AtRUB2 在进化上
属于同一个分支。虽然在 BrRUB1 氨基酸序列中没
有预测到核定位信号, 但是研究结果表明 BrRUB1
蛋白定位于细胞核, 可能在细胞核中发挥功能。就
像拟南芥的 MAX2 (more axillary growth2)蛋白一样,
也属于泛素代谢途径蛋白, 其氨基酸序列中也没有
预测到核定位信号, 但它定位在细胞核, 在细胞核
中发挥功能[14], 它们可能都通过核定位信号以外的
机制进入细胞核。
BrRUB1 基因在芜菁中的表达具有较高的组织
表达特异性, 在花蕾中表达量最高, 在花瓣中次之,
在叶和白色根皮中表达量最低。RUB1 蛋白的活力
可以影响 CUL4-DDB1 复合体形成, 进而影响 COP1
(constitutively photomorphogenic 1, COP1)的功能[15]。
泛素化相关蛋白 COP1 可以直接调控与开花相关的
重要转录因子 CONSTANS(CO)发挥功能, CO 可以
接受长日照信号启动开花。黑暗条件下 COP1 可以
降解 CO, 使植物在日照长度不足的条件下不启动
开花进程[16]。RUB1 在开花过程中起到了一定的调
控作用, 这也可能是 BrRUB1 在花蕾和花瓣的表达
量相对高的原因。
在有花青素合成的根皮中, RUB1基因也有少量
的表达。且在 UV-A光诱导下花青素合成, RUB1基
因的表达也被诱导表达, 说明自然光和 UV-A 光诱
导下 RUB1 蛋白都参与了花青素合成的调控。苯基
苯乙烯酮合酶(chalcone synthase, CHS)是花青素合
成途径中的第一个关键的酶, 津田芜菁根皮花青素
合成中 CHS 基因的表达量增加了[8], 而 RUB1 蛋白
可能通过其参与调控的途径影响着 CHS基因的表达,
进而影响花青素的合成和积累。已经有研究表明 ,
RUB1蛋白的活力能够影响 CRL (CULLIN-RING E3
ligases)的活性与稳定性 , 而 CRL 是一类依赖于
Cullin 蛋白的 E3 连接酶 [17], 可以介导包括 HY5
(ELONGATED HYPOCOTYL 5)在内的多种与植物
光信号通路有关正调控因子的降解[18]。而且 COP1
作用于目的基因需要 HY5作为桥梁。黑暗中, COP1
蛋白进入细胞核, COP1蛋白与转录因子HY5等结合,
使这些转录因子失活或离开其作用区即 CHS、叶绿
素 a/b结合蛋白CAB等基因启动子区, 使CHS、CAB
等基因不能表达。在光下, COP1蛋白脱离结合的转
录因子, 转录因子活化, 基因开始表达[19]。这是否是
在光下 RUB1 蛋白参与调控花青素合成的原因, 有
待进一步验证。
4 结论
克隆了津田芜菁 BrRUB1 基因, 该基因基因组
全长 945 bp, 含有 3个外显子和 2个内含子, ORF区
为 471 bp, 编码 156个氨基酸。BrRUB1蛋白定位于
细胞核。BrRUB1 基因表达具有组织特异性, 且在
UV-A光诱导的花青素合成中表达量增加。
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