全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (3): 293–302　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0537 293
收稿 2015-10-08　　修定 2016-01-25
资助 国家自然科学基金(31501190)和重庆市教委科学技术研究
项目(KJ1500330)。
* 通讯作者(E-mail: nanwenbin513@163.com)。
拟南芥鸟苷酸环化酶基因AtGC1表达与功能分析
南文斌*
重庆师范大学生命科学学院, 重庆市植物环境适应分子生物学重点实验室, 重庆401331
摘要: 第二信使环鸟苷酸(cGMP)在植物生长发育和胁迫应答中具有重要的调节作用, 研究表明cGMP在植物体内由鸟苷酸
环化酶(GC)催化合成, 但是目前关于其合成基因GC1 (At5g05930)的表达调控模式和功能仍然知之甚少。因此, 我们构建了
pGC1::GUS和p35SGC1::GFP转基因株系, 并对AtGC1基因的表达模式和功能进行了初步探究。结果表明: AtGC1基因在拟
南芥各个组织中均有表达, 但根中表达量明显高于其他组织。此外, AtGC1基因的表达能被外源脱落酸(ABA)、生长素
(IAA)、赤霉素(GA)和一氧化氮(NO)以及盐和低温胁迫迅速诱导。pGC1::GUS报告基因的结果进一步显示AtGC1基因在
拟南芥幼苗主根、侧根、根毛中大量表达, 主根尖分生组织表达量最高。此外, 研究发现虽然超表达株系GC活性显著增
加, 但其和基因缺失突变体gc1-1与野生型相比在表型、激素和胁迫响应等方面并未呈现明显差异, 说明GC的编码基因可
能具有冗余性, 这些结果为进一步深入研究cGMP信号转导途径提供了证据支持和良好的研究材料。
关键词: cGMP信号; 鸟苷酸环化酶; GC1; 基因表达; 拟南芥
第二信使是联系外界环境和植物激素与植物
内部生理反应之间的桥梁, 并形成复杂的信号转
导交联途径(Meier和Gehring 2006)。作为第二信
使, 环核苷酸单磷酸盐(cNMPs)包括环腺苷酸单磷
酸盐(cAMP)和环鸟苷酸单磷酸盐(cGMP), 在植物
生长发育中的作用是非常重要的, 并且它们在包
括对激素、生物和非生物胁迫的许多生理响应过
程中相互协作(Irving和Gehring 2013; Wong和Geh-
ring 2013)。
cGMP是参与调控植物生长发育的信号分子,
也是应对胁迫反应的重要分子(Newton和Smith
2004; Meier和Gehring 2006)。在过去的十年里, 进
行了大量有关cGMP作用的研究, 包括对盐、渗透
胁迫、冷胁迫(Donaldson等2004; Pasqualini等
2009; Li等2011; Wang等2012)和臭氧胁迫等各种
胁迫响应。而且, 研究表明cGMP能参与各种植物
分子和生理过程 , 例如cGMP调节的转录分析
(Durner等1998; Maathuis 2006)、NO-cGMP信号转
导(Wang等2010)、大麦淀粉酶和小麦糊粉层产生
(Penson等1996; Wu等2013)、种子萌发(Teng等
2010)、花粉管的再定位反应(Prado等2004)、细胞
极性的形成(Salmi等2007)、气孔运动(Cousson
2010; Dubovskaya等2011; Joudoi等2013)、牵牛花
光敏色素控制的开花(Szmidt-Jaworska等2009)和
植物根系的生长发育等(Pagnussat 2003; Hu等
2005; Bai等2012)。再者, 有证据表明cGMP对花青
素和类黄酮合成是必需的(Bowler等1994; Suita等
2009), 并且cGMP能够调节甘薯叶片中伤害响应
miR828的表达(Lin等2012)。另外, cGMP在应对各
种植物激素的反应中也发挥了重要作用, 这些激素
包括赤霉素(GA)、生长素(IAA)和脱落酸(ABA)
(Penson等1996; Pagnussat 2003; Dubovskaya等2011)。
在这些反应中, cGMP位于激素响应的下游, 并调
节植物激素信号, 因此说明在植物激素和cGMP之
间存在着可能的相互作用。cGMP除了与植物激
素存在交互调节作用外, 还与NO、H2O2和Ca
2+等
第二信使也存在着密切的联系形成复杂的网络调
控系统(Boon等2005; Lanteri等2006; Dubovskaya等
2011; 郑远和陈兆进2015)。此外, cGMP还依赖于
cGMP依赖的蛋白激酶(PKGs)、cGMP调节的磷酸
二酯酶(G-PDEs)和环核苷酸离子通道(CNGCs)来
发挥作用(Butt等1990; Ali等2007; Wang等2013; 王
文颖等2015)。
最近, 细胞内的cGMP含量能用内源cGMP传
感器的荧光报告蛋白FlincG进行检测, 因而可以在
时间和空间上来研究植物cGMP信号以及它在其
他信号通路中的交互作用(Isner和 Maathuis 2011;
Isner等2012)。cGMP信号通路以及它的反馈调节
是通过cGMP合成和降解的相互作用来控制的, 而
其合成和降解分别是由鸟氨酸环化酶(GC)和磷酸
二酯酶(PDE)完成的(Meier和Gehring 2006)。GC
植物生理学报294
能催化GTP形成cGMP, 使其发挥生物学功能, 而
PDE能使cGMP变成5’GMP而失活, 因此, 植物体
能精确的调控cGMP在体内的含量, 进而参与各种
生理过程的调控(Pagnussat等2003)。在拟南芥中,
目前研究发现鸟氨酸环化酶(AtGC1) (Mulaudzi等
2011)、细胞壁相关的蛋白激酶(AtWAKL10) (Meier
等2010)、油菜素内酯受体(AtBRI1) (Kwezi等
2007)、Pep1受体(AtPepR1) (Qi等2010)、植物磺
肽素受体(AtPSKR) (Kwezi等2011)和NO-结合GC
(AtNOGC1) (Mulaudzi等2011)共六种蛋白表现出
了GC活性, 能在体内和体外将GTP转化成cGMP
(Wong和Gehring 2013), 证明拟南芥有能力合成
cGMP (Ludidi和Gehring 2003; Mulaudzi等2011)。
但是植物中cGMP信号的研究还并不深入, 很
多与其相关的生理过程具体的细胞和分子机制仍
然不清楚, 主要是因为响应这些刺激导致cGMP浓
度变化的特异的GC并不清楚或难以研究。因此,
本研究以AtGC1基因为出发点, 运用分子生物学手
段初步分析了其表达模式和功能, 并构建了相关
的转基因株系, 以期为全面解析cGMP信号转导机
制提供新的研究思路和证据支持。
材料与方法
1 材料
1.1 植物材料
拟南芥[Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.]野
生型Col-0为本实验室所有, 突变体gc1-1 (Salk_
072331C)购自拟南芥植物资源中心(Arabidopsis
Biological Resource Center, ABRC)。种子播种于
含1/3蛭石的营养土中, 在18 h光照/6 h黑暗, 22°C
的培养室生长。
1.2 菌株、载体和生化试剂
大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌LBM4404和载
体pDonr221为本实验室保存。各种抗生素购自上
海生工。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、Primer
star高保真酶和DNA marker均购自大连宝生物
(TaKaRa)。BP反应酶、LR反应酶、引物合成和测
序由Invitrogen公司提供。
2 实验方法
2.1 植物总RNA提取和反转录cDNA
总RNA的提取和反转录cDNA参照Nan等
(2014)的方法进行, 取100 mg拟南芥样品在液氮中
研磨后, 加入1 mL Trizol震荡混匀, 室温放置10
min后, 13 000×g离心15 min。上清转移至新的EP
管中, 加入300 µL氯仿, 剧烈震荡30 s, 12 000×g离
心10 min。上层水相转移至新的EP管, 加入等体积
异丙醇后轻轻混匀, 室温放置5 min, 12 000×g离心
10 min。弃去上清液, 加入500 µL 75%乙醇(DEPC
水配制), 上下颠倒混匀, 8 000×g离心5 min, 倒掉
乙醇(重复1次)。室温干燥数分钟后加入50 µL DE-
PC-H2O溶解。使用反转录试剂盒(Takara)合成
cDNA第一链, 20 µL反应体系: 5×PrimeScriptTM RT
Enzyme Mix 4 µL, Total RNA 5 µg和RNase-Free
H2O 11 µL, 37°C反应15 min, 85°C 5 s终止反应。
2.2 RT-PCR和qRT-PCR
根据NCBI数据库中AtGC1基因(At5g05930)的
cDNA序列, 利用Primer 5.0软件分别设计RT-PCR
和qRT-PCR引物。以合成的cDNA为模板进行PCR
反应。RT-PCR用普通Taq酶, 以Actin2作为内参基
因, 反应程序为: 94°C 3 min; 94°C 30 s, 58°C 30 s,
72°C 1 min, 30个循环; 72°C延伸10 min。qRT-
PCR使用SYBR Premix Ex TaqTM II实时定量PCR
试剂盒(TaKaRa)在CFX96实时定量PCR仪(Bio-
Rad)中进行, 以UBQ10作为内参基因, 用2–∆∆CT法分
析基因的相对表达量。反应程序为: 95°C 3 min;
95°C 5 s, 60°C 30 s, 重复40个循环; 之后在65~
95°C间隔0.5°C进行溶解曲线分析。所用引物序
列见表1。
2.3 表达载体构建及遗传转化
利用PCR技术克隆AtGC1基因的起始密码子
ATG上游的1 561 bp的启动子序列和从ATG开始的
825 bp的编码序列, 经BP反应连接到Gateway中间
载体pDonr221形成pDonr221-pGC1和pDonr221-
GC1载体。测序正确后, 启动子序列经LR反应建
立pGC1::GUS植物双元表达载体, 基因编码序列经
LR反应建立p35SGC1::GFP超表达载体。克隆所
用引物序列见表1。将新构建的表达载体用热激
法转入根癌农杆菌LBA4404 (利福平抗性), 通过花
浸法(floral-dip)浸染拟南芥Col-0, 然后用Basta喷洒
进行筛选, 每个转基因株系获得12个阳性植株。
将阳性植株通过PCR检测后扩繁获得纯合种子进
行进一步的分析。
南文斌等: 拟南芥鸟苷酸环化酶基因AtGC1表达与功能分析 295
2.4 GUS染色
GUS染色参照Nan等(2014)的方法进行, 将生
长10 d的pGC1::GUS转基因幼苗先用90%丙酮
在–20°C固定1 h, 再用50 mmol·L–1 PBS (PH 7.0)清
洗2次, 然后浸入GUS染色液(1 mmol·L–1 X-Gluc、
100 mmol·L–1 sodium phosphate (pH 7.5)、0.5
mmol·L–1 K3[Fe(CN)6]、0.5 mmol·L
–1 K4[Fe(CN)6]、
10 mmol·L–1 EDTA和0.1% Triton X-100)在37°C培
养箱温育6~18 h, 温育完毕经70%乙醇脱色简易压
片后在显微镜(Nikon Microsystems)观察拍照。
2.5 鸟苷酸环化酶(GC)活性检测
GC活性的测定参照Nan等(2014)的方法进
行。将生长10 d的p35SGC1::GFP超表达株系样品
收集, 并在提取液[175 mmol·L–1 Tris/HCl (pH
7.9)、20 mmol·L–1茶碱和组织样品蛋白酶体抑制
剂]中研磨成匀浆, 4°C, 1 300×g离心5 min。GC活
性通过估算Mn2+-GTP合成cGMP的反应速率来表
示。0.25 mL反应体系包含175 mmol·L–1 Tris/HCl
(pH 7.9)、20 mmol·L–1茶碱、20 mmol·L–1 MnCl2、
1 mmol·L–1 GTP和60 μL总蛋白。最后将反应混合
物在25°C孵育10 min, 然后添加0.25 mL 0.2 mol·L–1
Na2CO3终止反应, 并将混合液混匀置于–70°C, 经
过溶解, 再混匀, 6 000×g离心10 min, 上清液用
cGMP酶联免疫试剂盒(Sigma)按照操作手册测定
cGMP含量, 并最终计算出超表达株系的GC活性。
2.6 生理表型分析
将Col-0、gc1-1和GC1-OE12#拟南芥种子经
1.5%的次氯酸钠表面消毒15 min后, 用无菌水彻底
表1 实验使用的引物序列
Table 1 Primer sequences used in this study
引物名称 引物序列(5→3) 用途
GC1-cds AAAAAAGCAGGCTTCATGTGGCCTCTTTGTTTTCTGC p35SGC1::GFP载体构建
AGAAAGCTGGGTCATATCCGTTCTGGTTCCTCATATTC
GC1-p AAAAAAGCAGGCTTCAGCATGAACTCTCTCACCTTCTATA pGC1::GUS载体构建
AGAAAGCTGGGTCCAATTACCAAGTGAGCTGTTACGC
RT-GC1 GTTCTCAGAGCAAGTGGCATC 半定量检测
AACTCATCCCTAACAGCATCAT
qRT-GC1 ATTGCCATTGCGTTAGTCG 定量检测
CGAACTCATCCCTAACAGCATC
Actin2 ATCCTCCGTCTTGACCTTGC 内参引物
CAGCGATACCTGAGAACATAGTG
UBQ10 GGCCTTGTATAATCCCTGATGAATAAG 内参引物
AAAGAGATAACAGGAACGGAAACATAGT
冲洗3~5次, 于4°C春化2 d后播种在含有不同浓度
ABA和100 μmol·L–1 NaCl的1/2MS培养基上, 每种
材料50粒, 设置3个重复, 以胚根突破种皮为萌发标
志, 每24 h统计萌发率。将垂直和平铺生长5和7 d的
Col-0、gc1-1和GC1-OE12#拟南芥幼苗移至不同浓
度IAA和200 μmol·L–1 NaCl处理3和5 d后测定主根生
长长度和存活率, 以子叶大部分变白为幼苗死亡。
进行3次独立重复实验, 然后对数据进行分析。
实验结果
1 AtGC1基因的组织表达分析
第二信使cGMP作为信号分子参与调控众多
的植物生长发育过程, 并能被一些植物激素和胁
迫条件迅速诱导(Meier和Gehring 2006; Isner和
Maathuis 2011; Isner等2012; Wang等2012)。此外,
植物体内cGMP主要由GC催化GTP合成, 并已确定
拟南芥中GC的编码基因GC1 (Ludidi和Gehring
2003; Mulaudzi等2011)。然而关于该基因在拟南
芥中的表达模式和作用机理却并未见报道, 这对
深入理解cGMP信号转导途径是至关重要的。因
此, 我们用半定量RT-PCR分析了AtGC1基因在野
生型(Col-0)拟南芥5种组织(根、茎、花、叶和果
荚)中的表达情况。如图1-A所示, AtGC1基因在拟
南芥各个组织中均有表达, 并且根中的表达量显
著高于其他组织, 花中次之。前人研究指出外源
植物激素ABA、IAA、GA和信号分子NO以及盐
胁迫和低温胁迫均能迅速诱导植物内源cGMP含
量的升高(Isner和Maathuis 2011; Isner等2012), 我
植物生理学报296
们的前期研究也表明生长素诱导的内源cGMP增
加是由于刺激GC活性导致(Nan等2014)。因此, 我
们运用定量RT-PCR的方法分析了上述激素、信号
分子和胁迫条件诱导的cGMP含量上升是否与
AtGC1基因相关, 它们能否调节AtGC1基因的表
达。我们将生长10 d的野生型(Col-0)拟南芥幼苗
用30 μmol·L –1 ABA、10 μmol·L –1 IAA、50
μmol·L–1 GA、100 μmol·L–1 SNP (一氧化氮供
体)、150 mmol·L–1 NaCl和4°C低温处理1 h后收集
样品提取RNA。结果显示, 与对照(未经处理的
Col-0幼苗)相比, ABA、IAA、GA、NO、盐和低
温胁迫均能上调AtGC1基因的表达, 且分别升高到
对照的2.1倍、2.9倍、1.9倍、2.2倍、1.8倍和1.8
倍(图1-B), 这说明它们诱导的内源cGMP含量的升
高可能是通过调节GC1基因的表达实现的。
2 AtGC1基因的启动子序列分析
为进一步推测AtGC1基因的表达和功能, 我们
通过生物信息分析工具PlantCARE对其ATG上游
1 352 bp的启动子序列进行了分析(图2)。结果显示:
AtGC1基因具有多个与光、生长素、赤霉素和茉莉
图1 AtGC1基因在拟南芥不同组织(A)和不同处理条件(B)
的表达分析
Fig.1 The analysis of AtGC1 gene expression in different
tissues (A) and treatments (B) of Arabidopsis
B图中不同的小写字母表示在P<0.05水平有显著差异。
图2 AtGC1基因启动子序列分析
Fig.2 Sequence analysis of AtGC1 promoter
南文斌等: 拟南芥鸟苷酸环化酶基因AtGC1表达与功能分析 297
酸响应相关的顺式作用元件(G-Box、ATCT-motif、
TGA-element、TATC-Box和GT1-Box), 先前的研
究同样证实cGMP信号与光、生长素、赤霉素和
茉莉酸信号相关(Bowler等1994; Penson等1996;
Nan等2014), 这说明它们调控的cGMP信号可能与
AtGC1基因相关。此外, 该启动子序列中还存在与
水杨酸及其在分生组织表达相关的顺式作用元件
(TCA-element和CAT-Box)。
3 pGC1::GUS和p35SGC1::GFP表达载体构建及
遗传转化
为了进一步研究AtGC1基因在植物组织内部
更为精细的表达调控模式及功能, 我们构建了GC1
基因启动子序列与GUS报告基因融合的pGC1::
GUS表达载体 , 以及AtGC1编码序列超表达的
p35SGC1::GFP表达载体。首先通过PCR扩增得到
与预期值大小一致的片段(图3-A)。切胶回收经BP
反应将片段连接到中间载体pDonr221, 转化E. coli
DH5α, 挑取阳性克隆用特异性引物进行菌落PCR
验证。如图3-B和C所示, pDonr221-GC1载体得到7
个阳性克隆, pDonr221-pGC1得到8个阳性克隆。
每个载体随机挑取 2个克隆提取质粒 , 进行
Bsp1407I单酶切验证, 结果均得到目的条带(图
3-D)。将验证正确的阳性克隆送测序, 经序列比对
与AtGC1基因的启动子序列和编码序列完全一致,
未产生碱基突变(数据未显示)。测序正确的质粒
进行LR反应连接到植物双元载体 , 转化E. coli
DH5α, 挑取阳性克隆用特异性引物进行菌落PCR
验证, 将验证正确的菌株送测序, 经序列比对发现
与目标序列一致, 说明我们已成功构建pGC1::GUS
和p35SGC1::GFP植物表达载体。我们将构建成功
的载体质粒进行LBA4404农杆菌转化, 获得阳性
克隆经菌落PCR验证之后扩繁制备菌液, 浸染拟南
芥Col-0植株。得到的拟南芥种子经抗性筛选和
PCR验证之后每个转化获得12株阳性株系, 再将它
们经过自交获得纯合种子用于后续的检测分析。
4 AtGC1在拟南芥转基因株系中的时空表达分析
为进一步详细观察AtGC1基因在拟南芥幼苗
中的表达模式, 我们将生长8 d的pGC1::GUS转基
因株系幼苗进行GUS染色。结果显示: AtGC1基因
在叶片中少量表达, 仅在叶片边缘能观察到, 而在
根中是大量表达的(图4-A), 这与前文Real-time
PCR的结果是一致的。此外 , 进一步实验发现
AtGC1基因在主根、侧根原基、成熟侧根尖和根
毛中均有表达, 成熟侧根中的表达模式和主根中
相似(图4-A~G)。而且, 主根根尖分生组织的表达
量最高, 并呈现从下向上表达量逐渐降低的趋势
(图4-A), 这说明GC1基因的功能可能参与调节拟
南芥幼苗根的生长发育。
图3 载体构建电泳检测
Fig.3 Electrophoresis analysis of vector construction
A: GC1基因启动子和编码序列PCR扩增; B: pDonr221-GC1载体菌落PCR鉴定; C: pDonr221-pGC1载体菌落PCR鉴定; D: 两种载体的
Bsp1407I单酶切分析。
植物生理学报298
5 突变体gc1-1和超表达株系表型与生理响应分析
由于研究表明cGMP参与调节ABA介导的种
子萌发、IAA调控的主根生长和盐胁迫响应(Teng
等2010; Nan等2014; Li等2011), 我们测定了AtGC1
基因的T-DNA插入缺失突变体gc1-1和超表达株系
GC1-OE 12#对ABA、IAA和盐胁迫信号的响应。
结果显示: 随着ABA和IAA浓度的升高, gc1-1和
GC1-OE 12#种子萌发和主根伸长被抑制, 然而与
野生型相比并无差异(图5-A和B)。同样的, 在盐胁
迫延迟的拟南芥种子萌发和诱导的幼苗死亡上也
没有观察到其与野生型之间的差别(图5-C和D)。
此外, gc1-1和GC1-OE 12#植株在主根、幼苗和抽
薹阶段均能正常生长(图4-H~J)。上述结果说明
GC1基因的缺失或超表达并不能影响拟南芥对
图4 pGC1::GUS幼苗的GUS染色及Col-0、gc1-1和GC1-OE 12#表型
Fig.4 GUS-staining of pGC1::GUS seedlings and phenotype of Col-0, gc1-1 and GC1-OE 12#
A: 10 d拟南芥幼苗; B: 主根; C: 叶片; D: 主根尖; E: 成熟侧根尖; F: 侧根原基; G: 根毛; H: 主根; I: 幼苗; J: 植株; 标尺长度均为100 μm。
ABA、IAA和盐胁迫的响应, 表明GC编码基因可
能存在冗余。
6 AtGC1超表达株系GC活性分析
为进一步明确AtGC1基因的功能, 我们对构建
的超表达转基因株系进行了分析。由于并未观察
到明显的表型变化, 我们用Real-time PCR的方法检
测了得到的12个超表达株系中GC1基因的表达量,
结果显示12个株系的表达均比野生型显著升高, 其
中2、6和12号株系的表达量最高, 分别达到野生型
的9.8倍、12.2倍和25.1倍(图6-A), 这说明超表达转
基因株系的构建是成功的。我们进一步检测了2、
6和12号株系中GC活性的变化, 发现与野生型相
比, 它们的GC活性同样均有显著升高(图6-B), 这说
明该基因对GC活性具有重要的调节作用。
南文斌等: 拟南芥鸟苷酸环化酶基因AtGC1表达与功能分析 299
讨　　论
感受外界环境和细胞内刺激或信号是植物生
长发育过程中的必要特征, 当植物接收到一种信号
就需要立即进行时间和空间上的处理, 使细胞能在
短时间做出正确的响应(Meier和Gehring 2006)。研
究表明, 环核苷酸(cNMP)信号是植物参与感受刺
激、传递信号重要的第二信使, 包括cAMP和cGMP
(Meier和Gehring 2006; Irving和Gehring 2013)。目
前, 虽然关于cAMP在植物中的存在和生物学功能
尚有争议, 但也有研究指出cAMP对植物花粉管生
长和K+通道活性具有调节作用(Li等1994; Moutinho
等2001), 而大量的研究表明植物中cGMP含量的变
化与众多信号转导途径和生理过程相关, 例如激素
响应、信号肽、病原菌、盐分和干旱胁迫响应以
及种子萌发、花粉管生长、花青素合成和气孔运
动等(Lucas等2000; Irving等2012), 但是具体的细胞
和分子机制仍然不清楚。虽然前人的研究已经确
定拟南芥AtGC1基因在体外表达的蛋白具有GC活
性, 能催化GTP合成cGMP (Ludidi和Gehring 2003),
但是关于AtGC1基因在植物中的表达模式和遗传
功能并未见报道。因此, 本实验以模式植物拟南芥
为材料, 构建相关的转基因材料, 通过正向和反向
遗传学手段对AtGC1基因进行时空表达检测, 并初
步分析了其缺失突变体和超表达株系对激素和胁
迫的响应, 以深入探究cGMP信号和AtGC1基因参
与调控植物生长发育的分子机制。
我们的研究结果表明AtGC1基因在拟南芥不
同组织中均有表达, 但根中的表达量明显高于其
它组织 , 并且能响应外源激素 (ABA、 IAA和
GA)、信号分子(NO)和胁迫环境(盐和低温)的诱
导(图1), 说明这些信号促进细胞内cGMP含量的升
高可能是通过上调AtGC1基因的表达实现的, 为
Isner等(2012)的研究提供补充证据。对AtGC1基因
启动子序列的分析发现其具有多个与光、IAA、
GA、茉莉酸和胁迫响应相关的顺式作用元件(图
2), 这也进一步解释了cGMP作为第二信使与上述
信号交互调节植物生长发育的分子机理。
图5 拟南芥中Col-0、gc1-1和GC1-OE 12#对ABA、IAA和盐胁迫信号的响应
Fig.5 The physiological responses of Col-0, gc1-1 and GC1-OE 12# to ABA, IAA and salt stress signals in Arabidopsis
A: ABA延迟的种子萌发; B: IAA抑制的主根伸长; C: NaCl延迟的种子萌发; D: NaCl导致的幼苗死亡。
植物生理学报300
为更加深入的探究AtGC1基因的时空表达模
式和功能, 我们构建了pGC1::GUS和p35SGC1::G-
FP转基因株系(图3)。GUS染色结果显示AtGC1基
因在拟南芥幼苗叶片中少量表达, 根中大量表达
(图4), 这与RT-PCR的结果一致(图1), 说明其表达
不具有组织特异性。通过进一步对根中GUS表达
的观察发现其在根尖分生组织表达量最高, 呈现
从根尖向地上部分逐渐减弱的趋势 , 并且在主
根、侧根原基、成熟侧根和根毛中均有表达(图
4)。这与启动子分析结果相吻合, 其启动子区域存
在与分生组织表达相关的顺式作用元件CAT-Box
(图2)。我们前期的研究结果发现cGMP作为第二
信使能被生长素诱导, 并通过影响生长素响应基
因的表达和AUX/IAA蛋白的降解调节拟南芥根的
生长发育(Nan等2014)。此外, 研究发现cGMP是生
长素调控的植物不定根形成和主根向地性弯曲等
根形态建成过程中重要的信号分子(Pagnussa等
2003; Hu等2005; Bai等2012)。因此, 上述结果说明
AtGC1基因可能通过响应生长素的诱导调节cGMP
在植物根中的含量 , 从而调节植物根的生长发
育。然而, 我们进一步的实验却发现无论是AtGC1
基因的缺失突变体gc1-1还是超表达株系GC1-OE
12#均能正常生长(图4), 且在ABA、IAA和盐胁迫
响应中与野生型相比并无差异(图5), 这说明GC编
码基因存在冗余, 先前的研究同样证实拟南芥中
还有其他5种蛋白能表现出GC活性(Wong和Geh-
ring 2013)。
此外, AtGC1基因启动子分析显示存在与水杨
酸响应相关的顺式作用元件(图2), 说明cGMP信号
可能也参与水杨酸信号对植物生长发育的调控,
虽然目前并无报道提供证据支持, 但也为我们今
后的研究提供新的方向。虽然和野生型相比 ,
AtGC1基因的超表达株系我们并未观察到明显的
表型差异(图4), 但其基因表达量和GC活性均显著
升高(图6)。这可能是因为超表达株系中cGMP的
含量并未升高或升高的cGMP在未执行信号功能
的情况下被磷酸二酯酶(PDE)迅速降解, 从而维持
其低水平的动态平衡。虽然已有不少研究发现
cGMP在不同植物中的作用, 例如大麦、绿豆、烟
草、大豆和拟南芥(Penson等1996; Donaldson等
2004; Hu等2005; Bai等2012)。然而这些研究均未
揭示GC1基因的表达模式和在植物生长发育中的
作用。本研究通过对AtGC1基因的时空表达模式
分析和功能探究, 为该领域的研究提供了新的实
验证据和材料, 并且改变传统只关注cGMP作用的
研究方法, 以AtGC1基因为出发点, 寻找与其相关
的信号元件, 为全面解析第二信使cGMP参与调控
植物生长发育的作用机理提供更为有益的信息和
新的研究思路。
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图6 超表达株系AtGC1基因表达量(A)和GC活性(B)的检测
Fig.6 Detection of the AtGC1 gene expression (A) and GC
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植物生理学报302
The expression and functional study of guanylate cyclase gene AtGC1 in Arabidopsis
NAN Wen-Bin*
Chongqing Key Laboratory of Molecular Biology of Plants Environmental Adaptations, College of Life Sciences, Chongqing Normal
University, Chongqing 401331, China
Abstract: The second messenger cyclic guanosine 3’, 5’-monophosphate (cGMP) plays an important role in
plant development and responses to stresses. Studies indicated that the generation of cGMP in plant is catalyzed
by guanylate cyclase (GC), and the encoding gene GC1 (At5g05930) of GC was identified in Arabidopsis.
Nonetheless, the expression pattern and mechanism of GC1 participation in cGMP signal to affect plant growth
and developmental is largely unknown. Therefore, in this study, the transgenic lines pGC1::GUS and p35S-
GC1::GFP were constructed, and the expression pattern and function of GC1 gene were studied in Arabidopsis.
Results showed that the expression of GC1 gene was detected in all tissues of Arabidopsis, while was obviously
higher in root than other tissues. It can be rapidly induced by exogenous ABA, IAA, GA and NO, as well as salt
and low temperature stresses. The results of pGC1::GUS reporter gene further showed that the GC1 gene main-
ly expresses in primary root, lateral root and root hair of Arabidopsis seedlings. The highest expression was
found in meristem tissue of primary root tips. In addition, the analysis of GC1 over-expression plants showed
that the GC activity increases markedly. However, The over-expression line GC1-OE 12# and gc1-1 mutant did
not produce any different effects for phenotype, hormone and stress responses compared to controls, suggested
that the encoding genes of GC are redundant. These results provided the evidence and good study materials for
further indepth research on cGMP signal transduction pathways.
Key words: cGMP signal; guanylate cyclase; GC1; gene expression; Arabidopsis
Received 2015-10-08, Accepted 2016-01-25
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31501190) and the Science and Technology Research
Project of Chongqing Education Committee (Grant No. KJ1500330).
*Corresponding author (E-mail: nanwenbin513@163.com).
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