全 文 ：青藤碱对吗啡依赖小鼠脊髓与小脑中 HO2、sGCα1和
sGCα2基因 mRNA表达的影响
郑济芳 ,刘　珍 ,朱允华 ,刘　俊 ,胡　弼
(南华大学生命科学与技术学院 ,湖南 衡阳　421001)
收稿日期:2008-02-20,修回日期:2008-05-10
基金项目:湖南南华大学博士启动基金资助项目(No5-03-XJQ-03-
044);湖南省自然科学基金资助项目(No04JJ30046)
作者简介:郑济芳(1966-),男 ,博士 ,副教授;
胡　弼(1950-), 男 ,教授 , 硕士生导师 , 研究方向:神经
生理学 ,通讯作者 , E-mail:hubigene@yahoo.com.cn
中国图书分类号:R-332;R 284.1;R 342.22;R 394.2;
R749.61;R977.6
文献标识码:A　文章编号:1001-1978(2008)08-1044-05
摘要:目的　评价青藤碱治疗前后吗啡依赖与戒断小鼠脊髓
和小脑中 HO2、sGCα1和 sGCα2基因 mRNA水平的变化 , 探
讨青藤碱作用于吗啡依赖小鼠的分子机制。方法　采用吗
啡剂量递增法 , 建立小鼠吗啡依赖模型 , 用青藤碱(40 mg·
kg-1 , ip)治疗吗啡依赖小鼠后 ,再用纳洛酮激发急性戒断症
状 , 半定量 RT-PCR测脊髓和小脑 HO2、sGCα1和 sGCα2基
因的 mRNA水平变化。结果　慢性吗啡用药使小鼠脊髓与
小脑中 HO2和 sGCα1基因的 mRNA水平发生异常上调 ,
sGCα2基因的 mRNA水平没有异常上调。单独使用青藤碱 ,
没有引起小鼠脊髓与小脑中这些指标异常升高。 青藤碱治
疗后 , 小鼠吗啡依赖与戒断时在脊髓与小脑中异常上调的
HO2和 sGCα1基因的 mRNA水平下降到接近对照组水平。
结论　慢性吗啡用药使HO2和 sGCα1基因的 mRNA水平发
生不同程度的异常上调 , 这种上调在青藤碱治疗后可以恢复
到接近正常水平 , 这可能是青藤碱对吗啡依赖小鼠治疗作用
的分子机制之一。
关键词:青藤碱;吗啡;血红素加氧酶 2;可溶性鸟苷酸环化
酶
　　在哺乳动物神经系统中 ,有一条 CO-cGMP信号
传导途径 ,血红素加氧酶(HO2)和可溶性鸟苷酸环
化酶(sGC)是该途径中的 2个关键酶 ,其中 , sGCα1
和 sGCα2是 sGC的 2种同工酶 , HO2酶催化血红素
生成胆绿素 、铁及 CO,作为一种重要的第二信使分
子 , CO在神经系统中的主要靶点是 sGC酶 , sGC酶
被激活后 ,催化 GTP生成 cGMP而发挥生物学效
应 [ 1] 。目前 ,该信号传导途径被证实参与了吗啡耐
受与戒断的形成 。Liang等[ 2]研究表明 ,慢性吗啡用
药可使小鼠脊髓中 HO2基因的 mRNA表达与酶活
性都明显升高 ,与 cGMP水平的变化具有相同的时
相性 ,当使用 HO2抑制剂或敲除 HO2基因时 ,小鼠
的戒断症状明显减少 。在吗啡处理的小鼠体内 ,
sGCα1和 sGCα2基因的 mRNA水平和酶活性都有
明显升高 ,它们的抑制剂亚甲基蓝及口恶二咪可降低
对吗啡镇痛效应的耐受 [ 3] 。
　　青藤碱(Sinomenine)是青风藤的主要化学成
分 ,化学结构类似于吗啡 ,是目前所知的植物中最强
的组胺释放剂之一 ,有镇痛 、镇静 、抗炎 、抑制免疫及
降血压等功效 。研究表明 ,青藤碱自身没有奖赏或
厌恶效应 ,能减轻吗啡依赖大鼠的戒断症状 ,明显抑
制吗啡的精神依赖模型条件性位置偏爱的形成 ,且
对已形成的位置偏爱亦有拮抗作用[ 4] 。用青藤碱
治疗吗啡依赖小鼠 ,可降低吗啡耐受小鼠的中枢神
经系统中 cAMP水平 ,并降低戒断后骤增的单胺类
神经递质的含量[ 5, 6] 。作者已有工作表明 , 青藤碱
能恢复吗啡依赖小鼠的小脑与脊髓引起的 NO/
nNOS系统的异常上调 ,且这种作用不能被纳洛酮
催促戒断所逆转 [ 7] 。由于 NO/nNOS系统和 CO/
HO2系统具有协同性 , sGC酶是 CO和 NO作用的
共同靶点 [ 1] ,因此 ,为了进一步了解青藤碱在小鼠
吗啡依赖形成中的作用机制 ,本实验将青藤碱用于
治疗吗啡依赖小鼠 ,检测其对小脑与脊髓中 HO2、
sGCα1和 sGCα2基因 mRNA表达的影响。
1　材料与方法
1.1　主要试剂与仪器　盐酸青藤碱(湖南正清制
药厂),盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药厂),纳洛酮
注射液(北京四环制药厂), RT-PCR试剂盒(上海生
物工程有限公司)。核酸蛋白紫外分析仪(Beckman
Du640), PCR扩增仪(Hema480),数码凝胶图像分
析系统(KodakEDAS290)。
1.2　小鼠药物处理　昆明种♂小鼠 64只 ,体重 20
～ 25 g,由本校实验动物中心提供。小鼠随机分为 8
组 ,每组 8只 ,置于(25±2)℃,光照 12 h· d-1 ,自
由饮食条件下喂养 7 d以适应环境 。根据文献 [ 2] ,
建立小鼠吗啡依赖模型 。实验动物分为两批 ,两批
同时进行处理 。
　　第 1批(5 d组 , Tab1):设置对照组 1、Mor组 、
Mor催促组 、Sin组共 4组 ,其中 ,对照组 1为注射生
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理盐水 5 d对照组 , Mor组为吗啡依赖组 , Mor催促
组为吗啡依赖形成后再用纳洛酮催促戒断组 , Sin组
为检测青藤碱是否有依赖性而设置的单独注射青藤
碱组。每天 8:00称量小鼠体重 ,采用吗啡剂量递增
法 ,于 d1 ～ 5对 Mor组和 Mor催促组小鼠注射吗啡
(d1 :10 mg· kg-1 , d2:20 mg·kg-1 , d3:30 mg·
kg-1 , d4:40 mg·kg-1 , d5:50 mg· kg-1 ,注射时依
据的体重为当天测量的小鼠体重 ,每天注射 2次 ,分
别在 8:00和 20:00, sc, 0.15ml/次),建立吗啡依赖
模型。对照组 1和 Sin组的小鼠分别注射生理盐水
(ip0.15 ml/次)和青藤碱 (40 mg· kg-1 , ip0.15
ml/次),每天注射 2次 。d5,最后一次注射完成 2 h
后 ,于 22:00给对照组 1、Mor催促组 、Sin组小鼠注
射纳洛酮(4 mg· kg-1 , ip0.15 ml/次),观察戒断症
状 , 30 min后与 Mor组小鼠同时分别用 CO2处死 ,
解剖分离小脑和胸腰段脊髓组织置 -80 ℃保存。
Tab1　Groupingandfactorsadministeredtomiceduring
pharmacologicaltreatments(five-daygroup)
Group Treatmentd1 ～ 5 d5(at22:00)
Firstbatch1 Control1 Saline Nal(Sacrificed)
2 Mor Mor Sacrificed
3 Mor+Nal Mor Nal(Sacrificed)
4 Sin+Nal Sin Nal(Sacrificed)
　　Mor:morphine;Sin:Sinomenine;Nal:naloxone
　　第 2批(10 d组 , Tab2):设置对照组 2、Mor+
Sin组 、Mor+Sin催促组 、对照组 3共 4组 ,其中 ,对
照组 2为注射生理盐水 10天组 , Mor+Sin组为吗啡
依赖形成后青藤碱治疗组 , Mor+Sin催促组是用青
藤碱治疗吗啡依赖小鼠后再用纳洛酮催促戒断组 。
由于吗啡停药后 ,随着戒断时间的延长 ,小鼠的身体
依赖症状会逐渐减轻 ,为排除时间因素的影响 ,故设
对照组 3。前 5 d,向对照组 2小鼠注射生理盐水 ,
对 Mor+Sin组 、Mor+Sin催促组 、对照组 3小鼠注
射吗啡 ,注射方式 、剂量 、时间皆与第 1批的注射相
同 。后 5d,青藤碱(40mg· kg-1 , ip0.15 ml/次)用
于治疗已形成吗啡依赖的 Mor+Sin组 、Mor+Sin催
促组。在停止吗啡注射后的 5 d内 ,对照组 3和对
照组 2小鼠一样注射生理盐水(ip0.15ml/次)。于
d10最后一次用药后 2 h向对照组 2、Mor+Sin催
促组 、对照组 3注射纳洛酮(4 mg· kg-1)以激发急
性戒断症状 ,观察记录小鼠戒断症状后 ,与前 4组一
样用 CO2处死 ,解剖分离小脑与胸腰段脊髓组织 -
80℃保存。
Tab2　Groupingandfactorsadministeredtomiceduring
pharmacologicaltreatments(ten-daygroup)
Group Treatmentd1～ 5 d6～ 10 d10(22:00)
Secondbatch5 Control2 Saline Saline Nal(Sacrificed)
6 Mor+Sin Mor Sin Sacrificed
7 Mor+Sin Mor Sin Nal(Sacrificed)
8 Control3 Mor Saline Nal(Sacrificed)
　　Mor:morphine;Sin:Sinomenine;Nal:naloxone
1.3　体重变化与行为学评价　处理期间每天 8:00
测量小鼠体重。注射纳洛酮后 ,置于透明烧杯内 5
min以适应环境。在戒断后 30 min内 ,记录小鼠相
关戒断症状 ,最后进行评分。评分标准[ 8]为:每 5
min记录一次齿颤 、扭体 、直立和跳跃出现的次数 , 0
=0次 , 1=1-4次 , 2=5 -9次 , 3≥10次;喷嚏与
眼睑下垂按每 2 min内出现 1次给 1。
1.4　半定量 RT-PCR分析　参照文献[ 9]合成引物
(Tab3)。按说明书操作步骤 ,用 TRIzol试剂提取总
RNA。反转录反应体系 20 μl(含总 RNA1 μg, 1
mmol· L-1 dNTP, 5 mmol· L-1 KCl, 5 mmol· L-1
MgCl2 , 10 mmol· L-1 Tris-HCl(pH8.3), 2.5 g·
L-1 oligo(dT)18 primer, 1 URNaseinhibitor, 2.5 U
MuLVreversetranscriptase), 于 40℃反应 30 min。
PCR反应体系 20 μl(含 cDNA200 ng, 1.5 mmol·
L-1 MgCl2 , 1UTaqDNApolymerase, 250 mmol· L-1
dNTPs, HO2、sGCα1、sGCα2和 β -actin的引物浓度
各 0.5 μmol· L-1), PCR扩增条件为:94℃ 30 s,
56℃(β-actin)/54℃ (HO2)/52℃(sGCα1)/52℃
(sGCα2)30s, 72℃ 40s,对目的基因扩增 30个循
环 , β-actin基因扩增 28个循环 ,最后 72℃ 10 min
结束反应 。为排除基因组 DNA的污染 ,特设置 1个
阴性对照组 ,即用 200 ng总 RNA为扩增模板 ,其他
反应物和扩增条件与上述组织样本的扩增完全相
同。每个 RNA样本的 PCR扩增至少重复 3次。取
10μlPCR产物用 1.5%琼脂糖凝胶进行电泳 ,用数
码凝胶图像分析系统作条带密度扫描 , 结果用
HO2、sGCα1或 sGCα2/β -actin光密度比值表示。
Tab3　ThesequencesofprimersusedintheRT-PCRexperiments
Gene Senseprimer(5′-3′)
Anti-senseprimer　　
(5′-3′)　　
Expected
size(bp)
HO2 AGGGCAGCACAAACAACTCA
TCTGGCTCATT
CTGTCCTAC 463
sGCα1 GAAATCTTCAAGGGTTATG
CACAAAGCC
AGGACAGTC 726
sGCα2 CGAAAGCAACTTCGATGTGA
AAATGGGGTGG
ACAATCGTA 120
β-actin TTTGATGTCACGCACGATTTCC
TGTGATGGTG
GGAATGGGTCAG 514
·1045·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2008 Aug;24(8)
1.5　数据处理　采用 SPSS11.5统计软件对数据
进行单因素分析 ,各组数据以 x±s表示(n=8)。采
用方差分析 ,不同组之间的比较使用 Dunnet′st检
验 。
2　结果
2.1　体重变化　为评价吗啡和青藤碱分别对小鼠
体重变化的影响 ,每天早上 8:00注射药物前称量小
鼠体重 。对第 1批小鼠相对体重分析结果显示(Fig
1 A),与对照组 1小鼠的体重相比 ,注射吗啡的 Mor
组小鼠的相对体重从 d2起呈负增长趋势;而注射
青藤碱的 Sin组小鼠体重变化与对照组 1小鼠体重
变化没有差异 ,表明青藤碱没有影响小鼠体重 。对
第 2批小鼠体重分析结果表明(Fig1 B),已形成吗
啡依赖的小鼠注射青藤碱(Mor+Sin组)后于 d8,
体重的负增长趋势已经得到扭转 ,而对照组 3小鼠
体重下降却相对恢复较慢 ,至d8时仍与对照组 2
Fig1　Thealt66erationratioofmeanrelative
bodyweightinmice(%)
Thealterationratiosofmeanbodyweightinmicewerecalculatedac-
cordingtotheformula:(thebodyweightofthisday-thebodyweightofthe
daybefore)÷thebodyweightofthedaybefore×100%.A:themean
relativebodyweightalterationswithinthefirst5days.＊P<0.05vscor-
respondingcontrol-1value;B:themeanrelativebodyweightalterations
withinthesecond5days.＊P<0.05, ＊＊P<0.01vscorespondingcon-
trol-2value.
小鼠比较差异有显著性 ,结果表明 ,虽然对照组 3
(阳性对照组)的小鼠体重也会下降 ,但其效果不如
青藤碱治疗的明显 。
2.2　戒断症状评分　第 1批中注射吗啡的 Mor催
促组小鼠的齿颤 、扭体 、喷嚏及眼睑下垂等戒断症状
评分分别是 4.2 ±1.28、12.2 ±1.92、8.0 ±1.52、
15.0±1.25和 8.3±1.15,对照组 1相应戒断症状
评分分别是 1.7±0.32、3.0±0.75、1.6±0.14、2.3
±0.33和 1.8 ±0.23, Mor催促组仍高于对照组 1
(P<0.05)。仅用青藤碱处理的 Sin组小鼠在纳洛
酮催促戒断后 ,没有出现明显的戒断症状。第 2批
中已形成吗啡依赖的 Mor+Sin催促组小鼠经青藤
碱治疗后 ,在纳洛酮催促戒断时症状比未经治疗的
Mor催促组明显得到缓解 。吗啡停药后 ,注射生理
盐水的对照组 3小鼠的扭体和眼睑下垂等戒断症状
评分分别是 11.6 ±2.96和 5.6±0.41,而对照组 2
的对应戒断症状评分分别是 4.0 ±1.23和 1.4 ±
0.27,对照组 3仍高于对照组 2(P<0.05)。
2.3　半定量 RT-PCR分析　在第 1批处理的小鼠
中 ,与对照组 1比较 ,注射吗啡 5d的 Mor组小鼠的
HO2基因表达在脊髓中有较明显的上调 (P<
0.05),而在小脑中差异无显著性 (Fig2A), sGCα1
基因在脊髓和小脑中都有明显上调(P<0.05, Fig
2B),但 sGCα2基因在该两个组织中的表达都没有
变化(Fig2C)。纳洛酮催促戒断后 , Mor催促组小
鼠的脊髓和小脑中 3个目的基因的 mRNA水平都
升高(P<0.05), sGCα1在脊髓和小脑中的上调与
对照组 1相比差异有显著性(P<0.01), sGCα2在
脊髓中的上调也高于对照组 1。单独注射青藤碱 5
天的 Sin组小鼠在纳洛酮戒断后 ,脊髓与小脑中 3
个目的基因的 mRNA水平没有发生变化 。
　　在第 2批处理的小鼠中 ,对已形成吗啡依赖的
小鼠用青藤碱(Mor+Sin组)治疗 5 d后发现 ,脊髓
和小脑中的 3个目的基因的 mRNA表达几乎已下
降到接近对照组 2的水平 。经青藤碱治疗 5 d的
Mor+Sin催促组小鼠再用纳洛酮催促戒断后 ,脊髓
和小脑中 3个目的基因的 mRNA表达水平与 Mor
催促组比较差异有显著性 ,表明青藤碱治疗有效地
下调了由吗啡依赖引起的 3个目的基因 mRNA水
平的异常升高 ,青藤碱治疗后用纳洛酮催促戒断也
未能逆转这种下调 。后 5 d注射生理盐水的对照组
3小鼠的 HO2基因表达在脊髓中高于对照组 2(P<
0.05), sGCα1和 sGCα2基因在小脑和脊髓中都高
于对照组 2(P<0.05)。
·1046· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2008 Aug;24(8)
Fig2　RT-PCRanalysisandexpressionprofilesofthetargetgene(HO2, sGCα1orsGCα2)andβ-actininspinalcordandcerebellumtissues
inmice　　Left:Respectiveagarosegelelectrophoresisofthespinalcordandcerebelumtissues.1-8:samplesfrommiceingroup1-8.M:molecularmark-
er.Right:theexpressionprofilesplotshowedrelativeexpression(test-gene/β-actinratio)ofthespinalcordandcerebelumtisues.＊P<0.05and＊＊
P<0.01(group2, 3, 4)vscorrespondingcontrol1value, group8vscontrol2value.#P<0.05vscorrespondinggroup3value.
3　讨论
　　青风藤用于中药戒毒复方已获得较好的实验和
临床效果 ,其主要成分青藤碱已被证实对阿片类的
依赖具有防治作用 [ 6] 。动物实验表明 ,青藤碱对吗
啡身体依赖性小鼠和大鼠的戒断症状 ,以及豚鼠离
体回肠的戒断性收缩具抑制作用 ,能明显减轻吗啡
依赖小鼠的催促戒断症状和体重下降 [ 6] 。本研究
表明 ,在青藤碱治疗后 ,吗啡依赖小鼠的体重减轻和
戒断症状得到改善。本实验还显示 ,在建模过程中 ,
吗啡依赖小鼠出现体重下降 ,但青藤碱注射组没有
出现这种现象;单独使用青藤碱处理 5 d的小鼠经
纳洛酮催促戒断后没有出现明显的戒断症状 ,小脑
与脊髓中 HO2、sGCα1和 sGCα2基因的 mRNA水平
都没有变化 。这些结果表明 ,青藤碱虽然分子结构
类似于吗啡 ,但没有引起类似于吗啡的身体依赖戒
断症状以及 HO2、sGCα1和 sGCα2基因表达的异常
变化。
　　Alexander等 [ 8]研究表明 ,小鼠慢性吗啡用药
后 , Westernblot未检测到 GCα2蛋白的升高 ,本研
究表明 ,吗啡慢性用药小鼠 , HO2和 sGCα1基因的
mRNA水平在小脑和脊髓中都升高 ,但 sGCα2基因
的 mRNA表达与对照组 1相比没有变化 ,吗啡慢性
用药小鼠 sGCα2基因在转录和翻译水平均未发生
升高 ,原因仍需进一步探讨。
　　已有研究表明 ,青藤碱能促进吗啡依赖戒断后
小鼠脑内去甲肾上腺素 (norepinephrine, NE)、多巴
胺(dopamine, DA)、 5-羟色胺 (5-hydroxytryptamine,
5-HT)等单胺类神经递质以及第二信使 cAMP的改
变趋于正常[ 5, 6] 。 NE、DA及 5-HT等单胺类神经递
质可影响吗啡依赖与耐受的形成 [ 10] 。DA可激活腺
苷酸环化酶 (adenylatecyclase, AC),催化 cAMP的
产生 ,吗啡依赖小鼠神经系统中 cAMP水平发生上
调[ 11] 。在 sGCα1和 sGCα2酶催化下 ,由 GTP产生
的 cGMP可激活磷酸二酯酶 3(phosphodiesterase3,
PDE3), PDE3参与 cAMP代谢途径而调节 cAMP水
平[ 1] 。本实验结果显示 ,成瘾小鼠用青藤碱治疗 5
d后 ,由吗啡依赖与戒断引起异常升高的 HO2和
sGCα1基因的 mRNA水平都恢复到接近对照组水
平 ,且这种作用不能被纳洛酮催促戒断所逆转。作
者已有工作表明 ,青藤碱可以抑制吗啡依赖引起的
·1047·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2008 Aug;24(8)
NO/nNOS系统的异常上调 ,且这种作用不能被纳洛
酮催促戒断所逆转 [ 7] ,由于 NO/nNOS系统和 CO/
HO2系统具有协同性 , sGC酶是 CO和 NO作用的
共同靶点[ 1] ,通过激活 sGC调节 cGMP的水平来调
节机体生理活动 ,结合本研究的结果推测 ,青藤碱可
能通过 CO-cGMP系统 、cAMP系统 、NO/nNOS系统 、
及单胺类神经递质间的存在相互作用而影响吗啡依
赖与戒断。
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EfectofsinomenineontheexpressionofHO2, sGCα1and
sGCα2genesofspinalcordandcerebeluminmorphinedependencemice
ZHENGJi-fang, LIUZhen, ZHUYun-hua, LIUJun, HUBi
(CollegeofLifeSciencesandTechnology, NanhuaUniversity, HengyangHunan　421001, China)
Abstract:Aim　Toexplorethemolecularmechanism
ofSinomenineonthemorphinedependencemice, and
toevaluatethemRNA levelsofHO2, sGCα1 and
sGCα2 geneswereevaluatedinthespinalcordand
cerebelum tissuesfrom themorphinedependence
mice.Methods　Miceweresubjectedtoinjectionof
morphinewithanincreasingdoseforfivedays, and
thenweretreatedwithSinomenine(40 mg· kg-1 , ip)
foranotherfivedays.Naloxonewasusedtodevelopa-
cutewithdrawal.ThemRNAlevelsofHO2 sGCα1 and
sGCα2 genesinthespinalcordandcerebelumtissues
weredeterminedbysemi-quantitativeRT-PCR.Results
　Afterexposuretomorphinechronicaly, themRNA
levelsofHO2 andsGCα1 geneswereincreasedobvi-
ously.ThemRNAlevelofsGCα2 genewasnotin-
creasedobviously.Onlyadministrationofsinomenine
alonecouldnotalterthemRNAlevelsofHO2, sGCα1
andsGCα2 genes.Sinomeninecouldreducetheup-
regulationofmRNAlevelsofHO2 andsGCα1 genes.
Conclusions　ThemRNAexpressionsofHO2 and
sGCα1 geneswereincreasedafterchronicmorphine
administrationandcouldberegulatedbysinomenine
treatment.Thismightbeoneofthemolecularmecha-
nismsinwhichsinomeninewastreatedonthemorphine
dependencemice.
Keywords:sinomenine;morphine;hemeoxygenase;
solubleguanylatecyclase
·1048· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2008 Aug;24(8)