全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (2): 197~202 197
收稿 2013-09-11　　修定 2014-01-13
资助 “十二五”国家科技支撑项目(2012BAD01B01)。
* 通讯作者(E-mail: wangjh@caf.ac.cn; Tel: 010-62888539)。
粗枝云杉胚性愈伤组织增殖后期的体细胞胚发生方式转变
张建伟1, 王军辉1,*, 马建伟2
1中国林业科学研究院林业研究所, 国家林业局林木培育重点实验室, 北京100091; 2甘肃省小陇山林业科学研究所, 甘肃天
水741022

摘要: 粗枝云杉愈伤组织在增殖后期体细胞胚的分化能力显著降低, 转变愈伤组织增殖方式和体细胞胚分化培养方式有利
于体细胞胚发生能力的提高。采用液体悬浮增殖取代半固体增殖更有利于胚性的保持。在增殖后期, 首选的体细胞胚发
生方式为“液体增殖-滤纸分化”, 其次为“块状增殖-块状分化”, 最后是“块状增殖-滤纸分化”。
关键词: 粗枝云杉; 胚性愈伤组织; 增殖时期; 体细胞胚胎发生
The Way Change of Somatic Embryogenesis at the Late Stage of Embryogenic
Callus Proliferation of Picea asperata Mast
ZHANG Jian-Wei1, WANG Jun-Hui1,*, MA Jian-Wei2
1Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Research Institute of Forestry, Chinese Academy
of Forestry, Beijing 100091, China; 2Xiaolongshan Forestry Research Institute, Tianshui, Gansu 741022, China
Abstract: Somatic embryogenesis of Picea asperata decreased significantly (P<0.01) as the time extension. At
the late proliferation stage, changing the ways of proliferation and maturation could significantly increase the
capacity for somatic embryogenesis. Compared with semi-solid culture, suspension culture was more conducive
to retention of embryogenesis. At the late stage of proliferation, the optimal maturation approach was
suspension culture-paper differentiation, chunk culture-chunk differentiation came in second, followed by
chunk culture-paper differentiation.
Key words: Picea asperata; embryogenic callus; proliferation stage; somatic embryogenesis
植物体细胞胚胎发生是指在离体条件下, 已
分化的体细胞在特定的环境条件下, 发育成与合
子胚类似的胚状体的过程。作为一种最具潜力的
植物无性繁殖技术, 体细胞胚胎发生是利用植物
细胞工程手段实现植株再生的重要途径之一, 尤
其对于难以扦插繁殖且繁殖周期较长的针叶树种
来说具有巨大的应用价值(Klimaszewska等2007)。在
体细胞胚胎发生过程中, 最为关键的形态建成事
件即是在分化培养基上胚性愈伤组织由胚性细胞
团向体细胞胚的转变(Stasolla和Yeung 2003; von
Arnold和Clapham 2008; Joshi和Kumar 2013)。在
胚性愈伤组织增殖过程中, 随着增殖时间的延长,
愈伤组织内源激素不断积累, 胚性也随之逐渐降
低(Bozhkov等2002), 严重降低了体细胞胚的质量
和收获量(Stasolla和Yeung 2003)。在增殖后期, 如
何继续保持愈伤组织的高度胚性以及延长愈伤组
织胚性的保持时间, 一直是体细胞胚胎发生技术
研究所面临的难题。目前, 在由胚性愈伤组织增
殖和体细胞胚分化培养构成的体细胞胚发生过程
中, 常用的愈伤组织增殖方式有半固体增殖(Gem-
perlova等2009; 刘宝光等2010; Montalbán等2012)
和液体悬浮增殖两种(Gupta和Timmis 2005; Pullman
和Skryabina 2007; 陈志等2007); 常用的体细胞胚
分化方式有“块状增殖-滤纸分化” (Bozhkov和von
Arnold 1998; von Arnold等2005; 杨模华等2011)和
“块状增殖-块状分化” (吕守芳等2005; Kim等2009;
Nakagawa等2011)。目前, 不同树种多采用单一的
体细胞胚发生方式, 这不仅不能解决愈伤组织增
殖后期胚性降低的问题, 还有可能由于评价失误
导致一些珍贵细胞系的丢失。
粗枝云杉也称云杉, 为我国特有种, 也是国内
云杉属树种中分布较广的树种, 具有重要的工业
价值(Fu等1999; 四川省粗枝云杉纸浆材协作组
2001)。本文针对粗枝云杉胚性愈伤组织在增殖后
植物生理学报198
期存在的胚性降低的问题, 通过构建多样化的体
细胞胚发生方式, 以期在增殖后期继续维持愈伤组
织的高度胚性, 提高体细胞胚的发生频率和质量。
材料与方法
1 植物材料
粗枝云杉(Picea asperata Mast)未成熟球果采
自甘肃省小陇山林科所云杉国家级种质资源库,
于2012年6月用未成熟合子胚诱导胚性愈伤组织,
包括1113、1911、1921、1931、2322、2614和
2711共7个不同分化能力的细胞系。愈伤组织诱导
和增殖培养基为: 1/2LM (Litvay等1985)+2.2 mg·L-1
2,4-D+1.1 mg·L-1 6-BA, 附加500 mg·L-1谷氨酰胺
(过滤灭菌, Sigma公司产品)、1 g·L-1酶水解酪蛋白
(Sigma公司产品)、10 g·L-1蔗糖、2 g·L-1凝胶
(gellan gum, Sigma公司产品), pH 5.8。所有细胞系
均在相同培养基上增殖 , 每14 d转接继代一次 ,
(24±1) ℃黑暗中培养。根据体细胞胚分化能力的
变化, 将增殖2个月的胚性愈伤组织定义为增殖的
早期阶段, 此时胚性细胞系刚刚建立起来; 将增殖
8个月的胚性愈伤组织定义为增殖的后期阶段, 此
时规模化的胚性愈伤组织增殖细胞系已经建立。
2 方法
2.1 体细胞胚分化培养
采用实验室常用的“块状增殖-滤纸分化”方
式, 对分别增殖2月和8月的7个细胞系胚性愈伤组
织进行体细胞胚分化, 即转接增殖14 d后, 从表面
取约1 g鲜重的愈伤组织平铺到一张边缘经过剪裁
的滤纸(WhatmanTM 2, 直径90 mm)上, 随后将附有
胚性愈伤组织的滤纸平铺到分化培养基上。体细
胞胚分化培养基为: 1/2LM+16 mg·L-1脱落酸(ABA,
过滤灭菌, Gibco公司产品)+50 g·L-1 PEG4000
(Merck公司产品)+30 g·L-1蔗糖+1 g·L-1活性炭
(Sigma公司产品)+4 g·L-1凝胶, 附加500 mg·L-1谷氨
酰胺和1 g·L-1水解酪蛋白(Sigma公司产品), pH
5.8。(24±1) ℃黑暗培养。增殖2个月的愈伤组织
每个细胞系3次生物学重复, 增殖8个月的愈伤组
织每个细胞系6次生物学重复, 以一个培养皿(87
mm×15 mm)为一个重复, 连续培养6周后统计发育
正常的体细胞胚数量。
2.2 胚性愈伤组织增殖后期的增殖培养
将在1/2LM培养基上增殖8个月后的7个胚性
细胞系, 转接增殖14 d后, 分别用半固体和液体悬
浮两种方式进行增殖。半固体增殖培养基为 :
1/2LM+2.2 mg·L-1 2,4-D+1.1 mg·L-1 6-BA, 附加500
mg·L-1谷氨酰胺、1 g·L-1酶水解酪蛋白、10 g·L-1蔗
糖、2 g·L-1凝胶, pH 5.8。液体悬浮增殖培养基中
不添加凝胶, 两者成分相同。将半固体增殖培养
的愈伤组织表面分成直径约0.5 cm的小块, 取约3 g
放置在盛有50 mL液体培养基的250 mL锥形瓶中,
(24±1) ℃下黑暗培养, 摇床转速110 r·min-1。每个
细胞系4瓶, 10 d转接一次。
2.3 胚性愈伤组织增殖后期的分化培养
胚性愈伤组织增殖后期, 采用3种方式进行体
细胞胚的分化。(1) “块状增殖-块状分化”。将7个
细胞系的胚性愈伤组织在半固体培养基上增殖8
个月后, 继续转接增殖14 d, 用镊子将其分成1 cm
左右的小块, 直接进行分化培养, 每个培养皿放置
7块。(2) “块状增殖-滤纸分化”。将7个细胞系的
胚性愈伤组织在半固体培养基上增殖8个月后, 继
续转接增殖14 d, 再进行分化培养。(3) “液体增殖-
滤纸分化”。将建立起液体悬浮增殖体系的1921和
1931两个细胞系, 继续转接增殖14 d, 取胚性愈伤
组织转到未添加生长调节剂的液体培养基中, 按
照细胞静置体积和液体培养基体积之比1:3进行混
合, 取5 mL混匀的愈伤组织平铺到滤纸上, 用布氏
漏斗抽滤后转到分化培养基上培养。分化培养基
和培养条件同2.1节, 每个细胞系6次生物学重复。
2.4 数据分析
体细胞胚的分化能力用单位鲜重的胚性愈伤
组织分化产生发育正常的体细胞胚数量[个 ·g-1
(FW)]表示, 按下式进行计算: 培养皿中分化的发
育正常的体细胞胚数量/分化接种量; 分化接种量=
接种胚性愈伤组织后的培养皿质量–接种前的培
养皿质量。方差分析采用SPSS 16.0, Duncan法进
行多重比较。
实验结果
1 粗枝云杉体细胞胚的发育过程及不同增殖时期
的分化能力比较
胚性愈伤组织分化培养1 d后球形胚开始出现
(图1-A), 分化第1周内淡黄色球形胚数量不断增加
(图1-B、C、F); 随后, 球形胚伸长, 发育产生柱状
胚, 2周后柱状胚大量产生(图1-D、G、H); 继续培
张建伟等: 粗枝云杉胚性愈伤组织增殖后期的体细胞胚发生方式转变 199
养3~4周后, 早期子叶胚开始出现(图1-I); 培养5~7
周后, 发育为成熟子叶胚; 成熟子叶胚呈淡黄色,
子叶伸展, 胚轴明显(图1-E和J)。
方差分析表明, 愈伤组织在增殖的不同时期,
各细胞系的分化能力均不同程度地极显著降低
(P<0.01)。在增殖后期, 愈伤组织平均分化产生体
细胞胚17.30个·g-1 (FW), 较增殖早期降低了9.6倍;
且部分细胞系(如1113、2322和2614)几乎不能正
常分化(图2-A)。在分化培养基中, 增殖早期分化
产生的体细胞胚呈现高度的同步化现象(图3-A);
而在后期分化的滤纸上, 非胚性愈伤组织呈黑褐
色颗粒状堆积, 降低了体细胞胚的质量(图3-B)。
此外, 体细胞胚的分化能力在不同分化方式及细
胞系和分化方式的交互作用间也存在极显著的差
异(P<0.01)。分化方式对体细胞胚的发生能力影
响较大, 方差分量达到53.62%; 其次是细胞系和分
化方式的交互作用, 方差分量为23.17%。
2 胚性愈伤组织增殖后期的增殖方式转变
7个胚性细胞系的愈伤组织经过1个月的转接
增殖后, 只有1921和1931两个胚性细胞系能够建
立液体悬浮增殖体系(图4-A和B); 其他细胞系仍然
呈块状或粘连丝状(图4-C~G)。观察半固体增殖的
7个细胞系发现, 不能进行悬浮培养的愈伤组织大
多非常粘稠, 丝状明显, 不易分开; 而能够悬浮增
殖的愈伤组织稍疏松, 易分开, 在液体培养基中分
散性较好, 新的胚性愈伤组织能够在小块状愈伤
组织周围快速形成(图4-H)。在液体悬浮增殖过程
中, 胚性愈伤组织生长迅速, 9~12 d后培养基即变
浑浊, 增殖量增加4倍以上, 较相同时间内半固体
增殖的增加2倍以上。此外, 悬浮增殖的胚性愈伤
组织多为细小颗粒状, 细胞均一性程度高, 保证了
后期体细胞胚分化的高度同步化。
图1 粗枝云杉体细胞胚的发育过程及显微结构观察
Fig.1 Development process and histological observation of P. asperata somatic embryos
A~E: 体细胞胚的发育过程。A~C: 分别为发育1、4和7 d的球形胚, 标尺=1 mm; D: 发育2周时的柱状胚, 标尺=1 mm; E: 发育6周时的
成熟子叶胚, 标尺=500 µm。F~J: 体细胞胚发育各阶段的石蜡切片观察。F: 分化7 d时的球形胚, 标尺=100 µm; G: 分化10 d时的柱状胚, 标
尺=200 µm; H: 分化2周时的柱状胚, 标尺=200 µm; I: 分化4周时的早期子叶胚, 标尺=500 µm; J: 分化6周时的成熟子叶胚, 标尺=500 µm。
植物生理学报200
3 胚性愈伤组织增殖后期的3种分化方式比较
由图2-B可知, 在增殖后期, 和“块状增殖-滤纸
分化”方式相比, 采用“块状增殖-块状分化”的方式,
可使绝大多数细胞系的体细胞胚分化能力显著提
高(P<0.05); 同时, 分化产生的体细胞胚多聚集在
愈伤组织的表面, 同步化程度较高, 子叶明显, 胚
轴健壮(图3-C)。此外, 用分化培养判断愈伤组织
是否有胚性时, 由于胚性细胞堆积, 容易分化产生
体细胞胚, 而用“块状增殖-块状分化”的方式更有
利于胚性的鉴别, 可以避免珍贵的低胚性细胞系
的丢失。
由图2-C可知, 在增殖后期, 和“块状增殖-块状
分化”方式相比, 通过建立液体悬浮增殖体系, 采用
“液体增殖-滤纸分化”的方式进行体细胞胚分化,
不仅能够获得数量巨大的体细胞胚, 而且同步化
程度更高(图3-D)。在后期愈伤组织胚性降低的情
况下, 甚至能够产生和早期“块状增殖-滤纸分化”
方式分化数量相当的体细胞胚。由此可见, 随着
愈伤组织胚性的降低, 在增殖后期, 适合的体细胞
胚分化方式应当优先选择“液体增殖-滤纸分化”,
其次是“块状增殖-块状分化”, 最后是“块状增殖-
滤纸分化”。
讨　　论
在粗枝云杉体细胞胚胎发生过程中, 采用半
固体增殖方式进行胚性愈伤组织增殖时, 随着增
殖时间的延长, 愈伤组织的胚性不断降低。在胚
性愈伤组织增殖后期, 采用悬浮增殖, 不仅自动化
程度高, 增殖效率也极大地提高(Avila等1996)。目
前, 液体悬浮培养已被认为是最有可能使针叶树
种的体细胞胚发生技术实现商业化的关键技术
(Aquea等2008)。在粗枝云杉胚性愈伤组织增殖后
期, 通过构建液体悬浮增殖体系, 不仅能够获得较
大的收获量, 还能提高胚性愈伤组织的质量, 有利
于后期体细胞胚的分化(Gupta和Timmis 2005)。
在增殖早期, 采用“块状增殖-滤纸分化”可以
获得大量且同步化程度较高的体细胞胚。对马尾
松愈伤组织进行体细胞胚分化时发现, 将愈伤组
织放置在滤纸上进行分化培养, 每克最多能够获
得244个发育正常的体细胞胚(杨模华等2011)。而
在胚性愈伤组织增殖后期, 采用“块状增殖-块状分
图2 不同分化方式下粗枝云杉体细胞胚分化能力的比较
Fig.2 Comparison of maturation capacity of P. asperata
somatic embryos among different differentiation ways
同一细胞系中相邻列间的不同字母表示0.05水平差异显著,
相同字母表示差异不显著。
张建伟等: 粗枝云杉胚性愈伤组织增殖后期的体细胞胚发生方式转变 201
图3 粗枝云杉不同增殖时期3种分化方式产生的体细胞胚
Fig.3 P. asperata somatic embryos developed through three approaches at different stages of proliferation
A: 增殖早期, “块状增殖-滤纸分化”, 标尺=5 mm; B: 增殖后期, “块状增殖-滤纸分化”, 标尺=1 cm; C: 增殖后期, “块状增殖-块状分化”,
标尺=5 mm; D: 增殖后期, “液体增殖-滤纸分化”, 标尺=1 cm。
图4 粗枝云杉7个胚性细胞系的悬浮增殖表现
Fig.4 Suspension culture performance of seven P. asperata embryogenic cell lines
A~G: 分别为1921、1931、1113、1911、2322、2614和2711胚性细胞系, 标尺=1 cm; H: 液体增殖中的胚性愈伤组织的显微结构, 标尺=
100 µm。
化”能够更有效地提高体细胞胚的分化效率。
Afele等(1992)发现, 将北美蓝云杉的愈伤组织分成
直径约为0.5 cm的块状进行分化时, 能够分化产生
同步化程度较高的体细胞胚。将直径为0.5~1 cm
的辐射松块状愈伤组织放置在半固体分化培养基
上, 能够获得生长健壮且易于萌发的成熟体细胞
胚(Aquea等2008)。Nakagawa等(2011)在库页云杉
的体细胞胚分化中, 每克鲜重最多能够获得710个
体细胞胚。在采用“块状增殖-块状分化”方式进行
分化培养时, 胚性愈伤组织呈块状堆积, 对胚性愈
伤组织的需求量大, 因而在粗枝云杉增殖早期并
不适用。相比之下, 在增殖后期, 采用“液体增殖-
滤纸分化”方式能同时发挥液体悬浮增殖和“块状
增殖-滤纸分化”的优势, 不仅获得大量体细胞胚,
而且保证体细胞胚的高度同步化, 这对评价体细
胞胚的分化质量来说十分关键。采用“液体增殖-
滤纸分化”的方式, 增殖4年的欧洲云杉愈伤组织,
每个培养皿仍然能够获得约80个完整的体细胞胚
(Find 1997); 欧洲赤松和海岸松每克鲜重的胚性愈
伤组织分别最高可以获得262和39个成熟的体细
胞胚(Lelu等1999); 同样, 花旗松也能够获得数量
巨大且同步化程度非常高的体细胞胚(Gupta和
Timmis 2005)。因此, 在粗枝云杉胚性愈伤组织增
殖后期, 应该根据细胞系的增殖和分化特性开发
相应的体细胞胚发生方式。
目前, 不同树种大多采用单一的体细胞胚发
生方式, 如“块状增殖-滤纸分化” (Beardmore和
Charest 1995; Klimaszewska等2001)、“块状增殖-
块状分化” (Afele等1992; Krajňáková等2009)和“液
体增殖-滤纸分化” (Harry和Thorpe 1991; Nørgaard
植物生理学报202
1997; Pullman等2005; Viji等2012)等。研究表明,
粗枝云杉不同细胞系都有可能拥有一套独立的体
细胞胚发生方式。本研究仅对目前国内外常用的
增殖方式和分化方式进行了比较, 今后可以开发
更多的愈伤组织增殖和体细胞胚的分化方式, 以
建立更加合理和高效的体细胞胚发生方法。
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