全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (1): 70~7470
收稿 2012-12-12　　修定 2012-12-27
资助 农业部公益性行业科研专项(201103037)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: zypiao@syau.edu.cn; Tel: 024-88487143)。
北五味子体细胞胚发生过程中内源IAA、ABA和GA3含量的动态变化
孙丹*, 李宏博*, 李千, 朴钟云**
沈阳农业大学园艺学院, 沈阳110866
摘要: 以北五味子不同发育阶段的体细胞胚为材料, 利用高效液相色谱法(HPLC)对其内源吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)
和赤霉素(GA3)含量进行了测定, 探讨内源激素在体细胞胚正常发育过程中所具有的作用。在北五味子体细胞胚发生过程
中, IAA和GA3含量均呈现先增加后降低趋势, ABA含量表现为先降低后增加趋势。IAA和ABA含量分别在球形胚阶段达
到最大值和最小值, 而GA3含量在心形胚阶段达到最大值。与正常体细胞胚相比, 畸形胚中IAA和GA3含量高于各时期的正
常胚状体, 而ABA含量则显著低于其他各时期的正常胚状体。高水平的IAA在北五味子体细胞胚的发生阶段起重要的作
用, 而ABA在体细胞胚的成熟过程中起关键作用, GA3则与其体细胞胚的生长发育过程密切相关。但过高水平的IAA和
GA3, 以及过低水平的ABA会使体胚无法正常发育成熟, 可能是引起畸形胚数量增加的主要原因之一。
关键词: 北五味子; 体细胞胚; 生长发育; 内源激素
Dynamic Variation of Endogenous Hormone during Somatic Embryo Develop-
ment of Schisandra incarnata
SUN Dan*, LI Hong-Bo*, LI Qian, PIAO Zhong-Yun**
College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China
Abstract: To explore the dynamic variation regularity and the role of plant endogenous hormones (IAA, ABA
and GA3) in somatic embryo development of Schisandra incarnata, different development stages of somatic
embryo of S. incarnata were used as material determined by HPLC. The experimental results showed that the
contents of IAA and GA3 present first increases and then reduce, whereas ABA was opposite. The contents of
IAA and ABA achieved maximum and minimum in globular embryo stage, respectively, and the content of GA3
reached maximum in heart-shaped embryo stage. Compared with normal somatic embryo, the contents of IAA
and GA3 were higher and the content of ABA was significantly lower in malformed embryos. High levels of
IAA played key roles in somatic embryo development; meanwhile, ABA might be beneficial in embryo matura-
tion while GA3 was related with growth and development of somatic embryos. High IAA and GA3 and low
ABA hindered maturation of somatic embryos, which might be the cause of increasing of malformed embryos.
Key words: Schisandra incarnata; somatic embryo; growth and development; endogenous hormone
北五味子为五味子科落叶木质藤本植物, 北
五味子以果实入药, 其果实以甘、酸、辛、苦、
咸五味具兼而得名, 主要含有木脂素、萜类化合
物等化学成分(陈业高等2001; 张兰杰等2002; 周英
等2003)。由于北五味子为多年生木本植物, 同时
种子具有严重的休眠现象和受枝条扦插不易生根
的影响, 体细胞胚胎发生是建立优良无性系、种
质资源保存的一条理想途径。植物激素在体细胞
胚的发生和发育过程中起着重要的调控作用, 随
着体细胞胚发育的进程而呈现出规律性的消长变
化(孔冬梅和沈海龙2008), 对体胚正常的形态建成
至关重要。同时, 在体细胞胚发生过程中, 畸形胚
由于其形态、生理异常, 难以发育成苗或不能移
栽成活, 严重制约了体胚发生技术在生产和育种
中的应用。因此, 本试验研究了植物激素在北五
味子体细胞胚发育过程中的变化规律, 对建立高
效的北五味子体细胞胚再生体系以及指导种质资
源保存具有重要意义。
材料与方法
1 试验材料
北五味子(Schisandra incarnata Stapf)材料采
孙丹等: 北五味子体细胞胚发生过程中内源IAA、ABA和GA3含量的动态变化 71
自辽宁省新宾县新泰药业北五味子种植基地。
2 试验方法
2.1 北五味子体细胞胚的诱导与发生过程
以北五味子的休眠芽为外植体, 在MS+2,4-D
3.0 mg·L-1+TDZ (噻重氮苯基脲) 0.2 mg·L-1培养基
上诱导初始愈伤组织; 在MS+TDZ 1.0 mg·L-1+ZT
0.2 mg·L-1培养基上诱导胚性愈伤组织; 在无任何
激素的1/2MS培养基上使胚状体进一步发育并获
得再生植株。培养基中蔗糖浓度为30 g·L-1, 琼脂
为6.5 g·L-1, 灭菌前pH值调至5.8, 在温度121 ℃、
压力1.2 kg·cm-2的条件下高压灭菌15~20 min, 培养
温度(23±2) ℃, 30 µmol·m-2·s-1光照条件下每日光照
16 h, 培养材料每月继代一次。
2.2 内源激素的提取
准确称取愈伤组织、胚性愈伤组织、球形
胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚和畸形胚的材
料各1.0000 g, 切碎后加10 mL纯甲醇在4 ℃冰箱中
放置24 h; 然后在避光条件下将样品冰浴研磨成匀
浆, 分3次总共加80%甲醇20 mL (10 mL+5 mL+5
mL), 超声处理30 min后, 4 ℃冷浸提取24 h。13
000 r·min-1冷冻(4 ℃)离心10 min, 取上清液, 向残
渣加入20 mL 80%甲醇, 13 000 r·min-1冷冻(4 ℃)离
心10 min, 合并上清液。在弱光下蒸干甲醇, 加入
10 mL石油醚脱色3次。萃取出水相, 用0.1 mol·L-1
的NaOH调节pH至8.0, 加入等体积的乙酸乙酯萃
取3次; 再用1 mol·L-1的柠檬酸调节pH=3.0, 加入等
体积的乙酸乙酯萃取3次, 保留酯相, 旋转蒸发至
干, 用2 mL甲醇(色谱纯)溶解, 过0.45 μm的有机微
孔滤膜, 取20 μL进行HPLC分析。每个时期的样品
重复3次。
2.3 内源激素测定的主要仪器和试剂
主要仪器有Agilent 1100高效液相色谱仪, 包
括在线真空脱气机、四元泵、DAD检测器、
VWD可变波长检测器、HPCHEM色谱工作站;
JA5003A型电子分析天平; KQ-100DV型超声波清
洗器。IAA、GA3、ABA标准品购自上海融禾医
药科技有限公司, 纯度均大于98%。甲醇(色谱纯)
购自Fisher公司, 95%甲醇等其他试剂均为国产分
析纯, 水为超纯水。
2.4 内源激素测定的色谱条件
色谱柱: Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250
mm, 5 μm), 柱温: 30 ℃, 流速: 1.0 mL·min-1, 流动
相: 甲醇:0.8%乙酸(50:50), 检测波长为210 nm。进
样量: 20 μL。
实验结果
1 北五味子体细胞胚发生和发育过程中的形态变
化
将北五味子休眠芽接种到MS+2,4-D 3.0 mg·L-1+
TDZ 0.2 mg·L-1培养基上诱导60 d左右可以形成大
量和绿色致密的初始愈伤组织(图1-A)。经继代、
扩繁后将其转入MS+TDZ 1.0 mg·L-1+ZT 0.2 mg·L-1
培养基上诱导胚性愈伤组织, 大约30 d初始愈伤组
织逐渐转变成质地松散, 表面湿润的胚性愈伤组
织(图1-B)。在无任何激素的1/2MS培养基上胚性
愈伤组织开始经历了球形(图1-C)、心形(图1-D)、
鱼雷形(图1-E)和子叶形(图1-F)胚的连续发育, 直
至获得再生植株(图1-G和图1-H)。在由初始愈伤
组织向胚性愈伤组织转变的过程中, 少量形成胚
性愈伤组织, 大部分愈伤组织变得结构致密, 并不
具有胚性, 以后的诱导过程中也不能形成体细胞
胚。在体细胞胚发育的不同阶段中也伴有大量的
畸形胚出现, 如根部膨大胚(图1-I)、多极胚(图
1-J)、玻璃化胚(图1-K)等。另外, 在胚性愈伤组织
增殖过程中发现, 独立的胚性愈伤颗粒难以成活,
只有连同少量的愈伤组织一起转至新鲜的培养基
中才可成活。可见, 在北五味子体细胞胚诱导过
程中, 由初始愈伤组织向胚性愈伤组织转变的效
率、以及畸形胚的发生率是制约其植株再生的关
键因素。
2 北五味子体细胞胚发生过程中内源IAA、ABA
和GA3含量的动态变化
如图2所示, 北五味子体细胞胚发育过程中,
吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA3)均呈现先增加后降
低趋势, 而脱落酸(ABA)含量则表现为先降低后增
加趋势。当初始愈伤组织向胚性愈伤组织转变后,
IAA含量迅速上升, 球形胚时期达到最大值, 与其
他时期相比均存在显著性差异(P<0.05), 在心形胚
时开始降低, 在鱼雷形胚和子叶形胚阶段IAA含量
更低, 两种愈伤组织及其他不同体细胞胚阶段之
间的IAA含量均存在显著性差异(P<0.05)。与IAA
相反, 在球形胚阶段ABA含量迅速降到最低点, 与
植物生理学报72
前两个阶段均存在极显著性差异(P<0.05), 然后呈
显著性上升趋势, 在子叶形胚阶段恢复到较高水
平, 不同阶段之间的ABA含量均存在显著性差异
(P<0.05)。整个培养过程中, GA3含量变化趋势与
IAA相似, 不同的是其含量最高点出现在心形胚阶
段, 各时期之间的显著性差异不明显。北五味子
体细胞胚发生过程中内源IAA、ABA和GA3含量
的动态变化表明, 早期阶段较高含量的IAA和较低
含量的ABA对体细胞胚的发生具有密切的关系,
而GA3含量变化较前两者具有滞后性, 在体细胞胚
发育过程中发挥重要作用。
3 畸形胚与正常体细胞胚中三种内源激素含量的
比较
针对北五味子体细胞胚诱导过程中畸形胚发
生率较高的现象, 比较了畸形胚与正常体细胞胚
中3种主要内源激素的含量, 结果见表1所示。在
畸形胚中, 3种内源激素IAA、ABA和GA3的含量
分别为620.54、47.69、503.72 ng·g-1, 其中IAA和
图1 北五味子体细胞胚的发生及植株再生
Fig.1 Somatic embryogenesis and plant regeneration of S. incarnata
A: 愈伤组织; B: 胚性愈伤组织; C: 球形胚; D: 心形胚; E: 鱼雷形胚; F: 子叶形胚; G: 再生植株; H: 移栽苗; I: 根部膨大胚; J: 多极胚; K:
玻璃化胚。
孙丹等: 北五味子体细胞胚发生过程中内源IAA、ABA和GA3含量的动态变化 73
GA3含量均显著高于正常体细胞胚, 而ABA含量则
显著低于正常体细胞胚。与正常体细胞相比, 三
种激素含量均存在显著性差异(P<0.05)。上述结
果表明IAA和GA3含量的偏高以及ABA含量的偏
低可能是畸形胚形成的主要原因之一。
讨　　论
植物体细胞胚发生是一个极其复杂的过程,
受到各种内外因素的调控, 植物激素是影响体细
胞胚发生的重要因素。研究表明, 生长素类物质
在植物体细胞胚发生中起重要的作用, 用于启动
细胞分裂和胚性潜力的诱导, 促进体胚的早期发
育(崔凯荣和戴若兰2000)。邢登辉等(1999)的研究
表明, 黄冠草体细胞胚发生过程中, IAA含量在培
养的第10天时达到第一个峰值, 第2个峰值出现在
第25天后。赖钟雄和陈春玲(2002)研究表明, 龙眼
胚性愈伤组织内源IAA含量高于非胚性愈伤组织,
从胚性愈伤组织发育到早期子叶胚, 内源IAA含量
变化都维持在较高水平, 并且在胚性愈伤组织和
球形胚两个时期出现高峰, 球形胚时期后IAA含量
表1 畸形胚与正常体细胞胚之间内源激素含量的比较
Table 1 Comparation of endogenous hormone contents
between malformed embryo and normal somatic embryo
体细胞胚类型 IAA含量/ng·g-1 ABA含量/ng·g-1 GA3含量/ng·g
-1
子叶形胚 196.65b 175.62a 288.45b
畸形胚 620.54a 47.69b 503.72a
　　同列数据旁不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
呈明显下降趋势。本试验中胚性发生的启动伴随
着IAA含量的增加(图2), 但过高水平的IAA也会不
利于体胚的正常发育(表1)。
近年来, 关于ABA在植物体细胞胚发生中起
重要调节作用的研究较多, 特别是对它在针叶树
体细胞胚发生中的作用进行了较多的研究。ABA
与胚性能力的启动或表达有关, 并能抑制体胚早
期萌发和畸形胚的发生, 防止裂生多胚的产生, 是
调节胚胎晚期发育的关键因素(Berry和Bewley
1992)。胡萝卜体细胞胚发生早期, ABA维持在一
个低水平, 球形胚发育成心形胚和鱼雷形胚时增
加(高述民2001)。龙眼在子叶胚形成时ABA达最
大值(赖忠雄和陈春玲2002)。内源ABA也是玉
米、枸杞体胚发生的重要因子, 且ABA能促进体
胚成熟, 抑制体胚过早萌发, 并可抑制畸形胚产生
(崔凯荣等1998; 张向东等2000)。本研究中也发现
ABA在北五味子体细胞胚发生过程中, 特别是在
子叶形胚的成熟过程中可能起到关键的作用(图2),
过低水平的ABA可能是导致体胚无法正常发育成
熟的重要原因(表1)。
目前, 关于GA3在植物体细胞胚发生过程中的
作用报道的并不多, 大多数研究认为大多数植物
的体细胞胚发生都不需添加外源的GA3, GA3对体
胚发生具有负作用(崔凯荣和戴若兰2000)。在胡
萝卜体胚发生中, 高水平的GA3抑制其体胚发生,
认为2,4-D抑制体胚发育是通过维持高GA3来进行
的。当去除2,4-D时, GA3迅速降解到适于体胚发
育的水平(Noma等1982)。在本试验中GA3对球形
胚和心形胚的形成起到了一定作用(图2), 但过高
水平的GA3对北五味子体细胞胚发育表现出有负
作用(表1), 与大多数植物体胚的研究结果类似。
综上所述, 植物内源激素在北五味子体细胞
胚发生和发育过程中起到至关重要的作用, 过高
和过低的激素含量会导致北五味子体细胞胚发育
异常, 出现畸形胚。而导致畸形胚中激素含量差
异的原因可能与培养物在培养基上的接触位置,
以及培养物的继代时间等因素有关。关于畸形胚
及其形成原因以及降低畸形胚发生率的措施等有
待于进一步研究。
参考文献
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图2 北五味子体细胞胚发育过程中3种内源激素(IAA、
ABA和GA3)含量的变化
Fig.2 Variation of endogenous hormone contents (IAA, ABA
and GA3) during somatic embryogenesis of S. incarnata
各柱形上同一激素不同时期不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
植物生理学报74
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