全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (4): 373~381　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2013.0455 373
收稿 2013-12-03　　修定 2014-02-19
资助 江西省观赏植物遗传改良重点实验室开放基金(2011-
KLB-02)和国家自然基金项目(31300567和31170628)。
* 通讯作者(E-mail: echoyyf@caf.ac.cn, Tel: 010-62889672;
E-mail: qiudy@caf.ac.cn, Tel: 010-62889641)。
红豆杉分子生物学研究进展
周华1, 朱祺1, 杨艳芳2,*, 余发新1, 邱德有2,*
1江西省科学院生物资源研究所, 江西省观赏植物遗传改良重点实验室, 江西南昌330096; 2中国林业科学研究院林业研究
所, 林木遗传育种国家重点实验室, 北京100091
摘要: 红豆杉作为抗癌药物紫杉醇的药源植物得到了国际上的广泛关注。本文综述了近年来国内外关于红豆杉分子生物
学方面的研究进展, 主要包括编码紫杉醇生物合成的紫杉二烯合成酶、羟基化酶、酰基转移酶等功能基因以及相关转录
因子编码基因的分离克隆、表达转化的研究, 红豆杉遗传多样性、紫杉醇含量相关的分子标记研究, 红豆杉谱系地理学的
研究以及解析紫杉醇合成分子机理的红豆杉转录组和代谢组研究等; 最后对当前研究的不足和对今后利用分子手段研究
红豆杉的发展前景进行了展望。
关键词: 红豆杉; 基因克隆; 转录因子; 分子标记; 转录组测序
Progress in Molecular Biology Study of Taxus
ZHOU Hua1, ZHU Qi1, YANG Yan-Fang2,*, YU Fa-Xin1, QIU De-You2,*
1Key Laboratory of Horticultural Plant Genetic and Improvement of Jiangxi, Institute of Biology and Resources, Jiangxi Academy
of Sciences, Nanchang, Jiangxi 330096, China; 2State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of
Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China
Abstract: Taxus L. has been widely recognized as an important plant because it can produce a number of chem-
icals with anticancer properties, especially Taxol, which was widely used in clinical of lung, ovarian and breast
cancer. This paper summarized several aspects about the recent progress in the application of molecular biology
technology in Taxus, included isolating and cloning of Taxol biosynthesis genes, molecular markers in genetic
diversity, phylogeography, transcriptome and metabolome. Finally, the problems and the limitation of current
study were discussed and proposed the future molecular biology research on Taxus.
Key words: Taxus L.; gene cloning; transcription factor; molecular markers; transcriptome sequencing
红豆杉(Taxus L.)又名紫杉, 为红豆杉科红豆
杉属植物, 多年生小乔木或灌木, 主要分布于北半
球的温带至亚热带地区, 我国云南、江西、福建
以及东北等地具有栽培或野生。红豆杉全世界共
有11个种, 中国拥有其中4个种和1个变种, 即: 东
北红豆杉(T. cuspidata Sieb. Et. Zucc)、云南红豆杉
(T. yunnanensis Cheng et L. K. Fu)、西藏红豆杉(T.
wallichiana Zucc)、中国红豆杉[(T. chinensis (Pilger)
Rehd]和南方红豆杉[T. chinensis (Pilger) Rehd. var.
mairei (Lemee et levl) Cheng et L. K. Fu]。1971年
Wini等从红豆杉中分离出了一种复杂的二萜类次
生代谢物质紫杉醇(Taxol), 发现其具有很强的抗癌
能力, 尤其在治疗乳腺癌、肺癌和卵巢癌等方面疗
效显著。当前, 随着癌症患者日益增加, 紫杉醇作
为目前最为有效的天然抗癌药物之一, 需求不断扩
大, 作为其药源植物的红豆杉更是成为国内外的研
究热点。近年来研究者利用多种分子生物学手段
全面展开了红豆杉遗传多样性、系统分类、蛋白质
组学和功能基因组学等多项研究。这些研究为深入
阐明红豆杉的生长发育机理、提高生物量以及进一
步探讨紫杉醇生物合成分子机理奠定了基础。本
文综述了近年来国内外科研工作者利用分子生物
学手段对红豆杉展开的一系列研究, 并对今后未来
红豆杉分子生物学研究的前景进行了展望。
1 紫杉醇生物合成途径功能基因和调节基因的分
离克隆
紫杉醇是公认的近30年来发现的最有效的抗
综　述 Review
植物生理学报374
癌药物之一, 红豆杉作为其药源植物, 其合成紫杉
醇的分子机理早已得到了较为充分的研究, 其中
美国华盛顿大学Croteau教授领导的实验室进行的
工作最有成效。该实验室不仅论证了从紫杉醇合
成前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl
pyrophosphate, GGPP)到紫杉醇的合成约需20步酶
促反应, 并且完成了其中包含编码羟基化酶和酰
基化酶在内的14个基因的克隆(Croteau等2006) (表
1)。此后, 国内外学者对于紫杉醇生物合成相关的
关键酶基因进行了大量的研究, 获得了多个与紫
杉醇生物合成相关的基因, 并对这些基因转录水
平的表达与紫杉烷类化合物的合成之间的关系展
开了相关的研究(Katkovcinová等2008; 高明波等
2011; Onrubia等2011, 2013)。
紫杉二烯合成酶(taxadiene synthease, TS)是
第一个被详细研究和迄今为止所发现的最重要
的紫杉醇合成代谢酶 , 催化GGPP环化形成紫
杉-4(5),11(12)-二烯, 该反应为紫杉醇生物合成中
的第一个定向、慢速的步骤。研究者最早从太平
洋红豆杉(T. brevifolia)树苗以及加拿大红豆杉(T.
canadensis)悬浮细胞中分离出了TS, 并对其催化活
性进行了鉴定(Hezari等1995, 1997)。编码TS的
cDNA序列最早则是通过同源序列克隆的方法从
太平洋红豆杉中得到(Wildung和Croteau 1996), 此
后, 从中国红豆杉、南方红豆杉(愈伤组织)、东北
红豆杉(愈伤组织)以及曼地亚红豆杉中都分离克
隆出了TS基因的cDNA全长或片段(石青等1999;
胡国武等2000; Wang等2002; Kai等2005; 肖颖等
2006)。并且, Köksal等(2011)对TS的晶体结构进行
了分析。此外, Zhao等(2010)通过Southern杂交技
术初步证实TS存在于内生真菌之中。目前有关TS
基因转化红豆杉细胞的研究报道较少, 韩国研究
者报道将TS基因转化到人参细胞系中, 在每克干
重转基因人参细胞中可得到9.1 μg紫杉二烯, 在经
过茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)诱导3或6 d
后, 每克干重转基因人参细胞紫杉二烯含量可分
别达到14.6或15.9 μg (Cha等2012)。Ajikumar等
(2010)利用上游MEP途径(methylerythritol-phos-
phate pathway, MEP途径)以及下游萜类化合物合
成通路中已知基因信息, 成功在大肠杆菌中过量
表达包括TS基因在内的多个合成紫杉醇前体的基
因, 促进紫杉二烯的合成量达到约1 g·L-1, 大大增
加了大肠杆菌中紫杉二烯的水平。尽管上述有关
TS基因的研究工作为进一步研究紫杉二烯合成酶
的作用机理和紫杉醇生物合成代谢调控机制奠定
了良好基础, 但是也不难看出, 利用分子生物学手
段调控TS基因还只是停留在促进紫杉二烯合成的
阶段, 距离实现提高紫杉醇的含量还存在着很长
表1 已获得的14个紫杉醇生物合成途径相关关键酶
Table 1 Information of the 14 related taxol biosynthetic enzymes in Taxus
中文名 英文名 缩写 基因库登录号 完整编码区/bp 参考文献
牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 geranylgeranyl diphosphate synthase GGPPS AF081514 1 182 Hefner等1998
紫杉二烯合成酶 taxadiene synthase TS U48796 2 586 Wildung和Croteau 1996
紫杉二烯-5α-醇-乙酰基转运酶 taxadien-5α-ol-O-acetyl transferase TAT AF190130 1 317 Walker等2000
紫杉烷2α-O-苯甲酰转运酶 taxane 2α-O-benzoyltransferase TBT AF297618 1 320 Walker和Croteau 2000b
3-氨基-3苯基丙酰转移酶 baccatin III: 3-animo-3- BAPT AY082804 1 335 Walker等2002a
phenyl-propanoyltransferase
去乙酰基巴卡亭III-10β-O-乙酰 10-deacetylbaccatin DBAT AF193765 1 320 Walker和Croteau 2000a
基转运酶 III-10-O-acetyltransferase
紫杉烷-C13-侧链-N-苯甲酰转 3′-N-debenzoyl-2′-deoxytaxol DBTNBT AF466397 1 323 Walker等2002b
移酶 N-benzoyltransferase
紫杉烷2α-羟基化酶 taxane 2α-hydroxylase T2αH AY518383 1 488 Chau和Croteau 2000
紫杉烷5α-羟基化酶 taxane 5α-hydroxylase T5αH AY289209 1 503 Jennewein等2004a
紫杉烷7β-羟基化酶 taxane 7β-hydroxylase T7βH AY307951 1 509 Chau等2004
紫杉烷10β-羟基化酶 taxane 10β-hydroxylase T10βH AF318211 1 494 Schoendorf等2001
紫杉烷13α-羟基化酶 taxane 13α-hydroxylase T13αH AY056019 1 458 Jennewein等2001
紫杉烷14β-羟基化酶 taxane 14β-hydroxylase T14βH AY188177 1 530 Jennewein等2003
苯丙氨酸氨基变位酶 phenylalanine aminomutase PAM AY582743 2 094 Jennewein等2004b
周华等: 红豆杉分子生物学研究进展 375
一段路程, 因此, 这方面的研究仍然是科研工作者
今后的研究重点。
紫杉醇的生物合成是一个复杂的多步骤过程,
主要包括四环骨架的构建和加入各种羟基和酰基
基团, 其中羟基的加入由细胞色素P450氧化酶催
化。紫杉醇生物合成途径的19步反应中有将近一
半由细胞色素P450氧化酶催化。自研究者从太平
洋红豆杉和东北红豆杉中最早发现细胞色素P450
氧化酶以来(Hefner等1996; Wheeler等2001), 目前
已经克隆出了T2αH、T5αH、T7βH 、T10βH、
T13αH和T14βH等6个编码细胞色素P450氧化酶的
基因(表1), 还有C1位的细胞色素P450氧化酶编码
基因目前尚未被克隆。尽管一个C9位的T9αH
(taxoid 9α-hydroxylase, T9αH)的cDNA序列已经报
道被克隆 , 但功能尚待进一步确定(Croteau等
2006)。研究发现T2αH 、T5αH、T7βH 、T10βH
和T13αH的序列具有70%以上的相似性, 然而与其
他植物来源的细胞色素P450氧化酶编码基因的序
列相似性却低于35% (Jennewein等2004b; Kaspera
和Croteau 2006)。因此, 发现新的潜在的紫杉烷类
细胞色素P450氧化酶编码基因也许可以从序列相
似性角度展开相关研究工作。按照此思路, Jenne-
wein等(2004b)利用cDNA文库方法找到了序列相
似性>75%的10条新的紫杉烷类细胞色素P450氧化
酶候选基因, 而且, 他们还鉴定分离了一个新的
T10βH基因(GenBank accession no. AY563635)。中国的
红豆杉研究者也从中国红豆杉和中国红豆杉愈伤
组织细胞中克隆出了T10βH基因和细胞色素P450
还原酶基因, 并分别在酿酒酵母或大肠杆菌中进
行了表达研究(Tu等2004; 阮仁余等2010), 为建立
具有高效的电子传递和羟基化反应的紫杉醇中间
体代谢工程途径奠定理论基础。紫杉烷13α-羟基
化酶(T13αH)编码基因也从曼地亚红豆杉和南方
红豆杉中被克隆(滕文静等2008; 黄仕杰等2010b;
Zhang等2010), 并发现其在曼地亚红豆杉叶子中的
表达量较高, 在茎中的表达量较低, 而在果实中没
有检测到其表达(Zhang等2010)。燕丽娜等(2009)
从南方红豆杉中克隆了紫杉烷7β-羟基化酶(T7βH)
基因的DNA序列, 并对红豆杉属细胞色素P450基
因家族成员进行了进化分析, 发现该家族的成员
所受选择压力各异。由于紫杉烷14β-羟基化酶处
在紫杉醇生物合成竞争的分支途径中, 抑制其表
达则很有可能促进紫杉醇类物质的产量。研究者
从中国红豆杉基因组中克隆了紫杉烷14β-羟基化
酶(T14βH)基因前半段序列, 并将其利用反义RNA
和RNAi抑制表达技术转化曼地亚红豆杉细胞系,
结果发现C14位氧化产物明显减少(胡新玲等2006;
李凤岚等2009; Li等2011)。综上可以看出, 细胞色
素P450氧化酶对紫杉醇生物合成起到了多步催化
作用, 为采用基因工程手段和联合其他调控因子,
如茉莉酸甲酯(MeJA), 转化红豆杉细胞, 利用细胞
培养技术大量生产紫杉醇提供了坚实的理论基
础。同时, 还应看到C1位的羟基化酶基因的序列
至今尚未获得, 为何已克隆的红豆杉的羟基化酶
基因序列高度相似, 却与其他植物来源的细胞色
素P450氧化酶的序列相似性很低？这些未解之谜
都需要人们在未来通过包括分子生物学在内的各
种研究手段进行努力探索。
酰基转移酶在紫杉醇生物合成的19步反应中
催化其中的5步, 在紫杉醇生物合成的代谢途径中
也起到了至关重要的作用。例如, 3-氨基-3苯基丙
酰转移酶(3-amino-3-phenyl-propanoyltransferase,
BAPT)专一性地催化β-苯丙氨酰辅酶A与巴卡亭III
上C13羟基反应生成去苯甲酰紫杉醇(3-N-deben-
zoylatxol), 紫杉烷-C13-侧链-N-苯甲酰转移酶
(3′-N-debenzoyl-2′-deoxytaxol N-benzoyltransferase,
DBTNBT)催化苯甲酰CoA和去苯甲酰紫杉醇合成
紫杉醇, 是紫杉醇生物合成途径中的最后一个酰
基转移酶, 因此, 它们在决定紫杉醇合成量上具有
举足轻重的作用。从表1中可以看出, 大约10年前
Croteau实验室就已经完成了这5个酰基转移酶基
因的分离克隆以及功能鉴定的工作, 并且在后续
的工作中, 他们还继续利用建立cDNA文库的方法
等得到了包含之前克隆的5个酰基转移酶基因在
内的16个相关的克隆(Jennewein等2004b)。国内研
究者也对这5个酰基转移酶基因进行了克隆, 并对
其在大肠杆菌中的表达进行了研究(Guo等2007;
韩丽等2008; 黄仕杰等2010a; 张志建等2010; 苗莉
云等2012)。此外, Hampel等(2009)从红豆杉中分
离出了2个促进红豆杉支链代谢物紫杉素(taxusin)
酰基化的酰基转移酶基因(TAX9和TAX14), 为利用
基因敲除等方法促进紫杉醇及其相关前体的合成
植物生理学报376
提供了新思路。
紫杉醇的合成前体GGPP主要通过上游MEP
和MVA途径(mevalonic acid pathway, MVA途径)生
成的法呢基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate, FPP)和
异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate, IPP)在
GGPP合成酶的作用下而生成(Hefner等1998)。对
于红豆杉紫杉醇生物合成的上游途径MEP和MVA
中的关键酶的编码基因, 检索到的国外文献较少,
国内一些研究者进行了相关的报道。例如郑清平
等(2004)从中国红豆杉中克隆了MEP途径中的
DXR基因。Li等(2009)利用荧光定量PCR技术, 对
DXR、HMGR、GGPPS和DBAT基因在长期培养(3
年)的红豆杉细胞中的表达进行了研究, 发现4个基
因都呈现了表达下降的趋势, 并推测多个基因转
录水平表达量的降低或许是导致长期培养细胞系
中紫杉醇含量下降的原因。GGPPS基因也分别被
国内研究者从曼地亚红豆杉、南方红豆杉和西藏
红豆杉中克隆(肖明贵等2004; 兰小中和孙敏2006;
韩飞等2011), 同时GGPPS基因的5端侧翼序列也
被从曼地亚红豆杉中克隆, 并将其转化烟草, 验证
了其启动子的活性(郭佳玉等2010)。这为建立红
豆杉转基因表达时、空、量三维调控系统、为功
能基因组研究和运用基因工程方法调控紫杉醇的
合成提供了理论基础。
除了上述紫杉醇生物合成途径关键酶基因之
外, 研究者还对红豆杉中的转录因子展开了相关
研究。转录因子通常是由基因编码的一类蛋白质,
主要以同源或异源二聚体的形式同顺式作用元件
特异结合, 通过和某些辅助调控因子发生作用而
影响转录复合体的形成, 从而调节植物基因的特
异性表达 (Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki
2006)。目前, 研究较多的与植物次生代谢途径相
关的转录因子主要有AP2/EREBP、MYB、bHLH、
WRKY、bZIP和MADS-box等几大类。近年来, 一
些关于转录因子调控紫杉醇生物合成的报道已经
被发表。国外有研究者对MADS-box转录因子调
控影响红豆杉果实的发育进行了相关研究(En-
glund等2011; Lovisetto等2012), 而国内研究者在红
豆杉转录因子的研究方面也取得了一定进展。例
如, 姚瑞枫等(2009)利用酵母单杂交文库对与紫杉
醇生物合成途径中的dbat基因启动子的顺式元件
结合的转录因子进行了筛选探索工作, 得到了6个
可编码结合蛋白的基因。戴怡龄(2008)从东北红
豆杉中分离克隆出2个AP2类转录因子 , 其中
TcDREB还能与紫杉醇合成途径中的TS、T5αH、
T10βH和T13αH四个关键酶基因的启动子相结
合。Li等(2013)利用从中国红豆杉细胞中克隆的
DBAT基因5端片段为饵, 他们通过酵母单杂交方
法成功获取得到了一个WRKY转录因子TcWRKY,
并发现过量表达或者抑制RNAi, TcWRKY都相应
地增强或者降低了DBAT基因的表达。转录因子在
植物次生代谢途径中起到多步调控作用, 能够调
控多个酶编码基因的表达, 进而能够影响整个植
物次生代谢网络, 因此, 结合基因工程的方法调控
转录因子的表达, 将是一个非常重要的调控紫杉
醇生物合成的有效途径。本实验室也已经针对此
研究方向展开相关研究, 克隆获得了包括bHLH在
内的多个转录因子基因, 相关的功能研究工作正
在进行中。
2 分子标记研究
分子标记(molecular marker)是遗传标记中非
常重要的一种, 它是以个体间遗传物质内核苷酸
序列变异为基础的遗传标记, 是基于基因组DNA
存在及其丰富的多态性而发展的一类可以直接反
应生物个体间DNA水平上差异信息的遗传标记方
法。21世纪以来, 分子标记技术已经在植物研究
中得到广泛应用 , 例如植物分子遗传图谱的构
建、植物遗传多样性分析与种质鉴定、重要农艺
性状基因定位与图位克隆以及分子标记辅助育种
等多方面。
国外有关分子标记技术在红豆杉中应用的研
究报道不是很多, Collins等(2003)利用RAPD技术
和trm-F序列对欧洲红豆杉(T. baccata)、加拿大红
豆杉(T. candensis)和东北红豆杉(T. cuspidata)的19
份样品和31份杂交种进行了鉴定研究。国内红豆
杉分子标记研究起初阶段主要围绕红豆杉遗传变
异和亲缘关系方面展开(王艇等2000; 张宏意等
2003; 茹文明等2008; 江建铭等2009; 李乃伟等
2010, 2011)。例如, 周其兴等(1998)在15年前就对
红豆杉属的遗传变异和亲缘关系进行了研究, 茹
文明等(2008)也发现南方红豆杉自然种群具有较
高的遗传多样性。另一方面, 研究者对紫杉醇含
周华等: 红豆杉分子生物学研究进展 377
量性状相关的分子标记进行了研究 (陈毓亨等
1999; 苏建荣等2009), 同时, 也针对遗传变异和紫
杉醇含量的相关性展开研究。于晓芹等(2009)应
用扩增片段长度多态性(amplified fragment length
polymorphism, AFLP)和高效液相色谱(high perfor-
mance liquid chromatography, HPLC)方法研究了云
南红豆杉的遗传多样性与紫杉醇含量之间的关系,
发现紫杉醇含量在红豆杉居群间和居群内个体差
异都较大。在居群水平上, 遗传多样性和紫杉醇
含量有一定程度的关联, 但在个体水平上明显无
对应关系。此外, 研究者针对红豆杉雌雄异株的
特性, 也利用AFLP等技术对其性别早期鉴定的标
记进行了研究(肖璐等2011a, b)。近年来, 研究者
也利用分子标记技术对红豆杉的系统进化进行了
研究。例如, 王艇等(2001)利用限制性内切酶片段
长度多态性(restriction fragment length polymor-
phism, RFLP)方法对红豆杉科及相关类群14种植
物叶绿体rbcL基因PCR产物进行限制酶酶切分析,
初步探讨了红豆杉科、三尖杉科和罗汉松科之间
的系统关系。中国科学院昆明植物研究所李德铢
研究员实验室则一直致力于红豆杉资源保护和生
物地理学的研究。例如, 该实验室结合形态学、
分子生物学以及气候资料对兴都库什-喜马拉雅地
区红豆杉属物种的分类和分布进行研究, 通过对
来自46个居群和47份馆藏标本的743个样本的27
个形态性状的主成分分析和15个气候因子的生态
位模拟, 同时结合对ITS和trnL-F序列的最大简约
法分析 , 发现该地区分布有3种红豆杉属植物
(Poudel等2012)。此外, 他们还以红豆杉为例, 对新
兴起的DNA条形码(DNA-barcoding)技术的改进,
并对其在红豆杉潜在的新种鉴定的应用进行了探
索(Liu等2011, 2012)。同时, 国内研究人员在红豆
杉的谱系地理学方向上也取得了一定进展。例如,
张雪梅等(2012)通过对南方红豆杉18个居群499个
个体叶绿体基因组的trnL-F片段进行了RFLP分析,
结果表明仅有26.39%的遗传变异存在于居群间,
居群内的遗传变异为73.61%, 南方红豆杉现在的
遗传结构可能源于居群的片段化效应。国外有研
究者报道了利用AFLP和简单重复序列或微卫星标
记(simple sequence repeat, SSR)技术研究了生境断
裂对欧洲红豆杉的遗传结构的影响(Chybicki等
2011)。而国内Miao等(2013)也利用微卫星标记技
术对来自14个居群的288个个体南红豆杉生境断
裂谱系地理学和遗传效应进行了研究, 结果发现
生境断裂导致了云南红豆杉显著的遗传瓶颈、近
亲繁殖和种群分化。值得一提的是, AFLP以及在
此基础上发展起来的甲基化敏感扩增多态性
(methylation sensitive amplification polymorphism,
MSAP)技术也被国内研究者用于红豆杉长期组织
培养和脱分化的遗传和表观遗传变异的研究(李丽
琴等2009; Fu等2012)。
随着科学技术的发展, 研究者针对红豆杉展
开的分子标记的研究方法也从传统的RAPD、
AFLP和SSR标记等技术的利用以及展开的技术体
系优化, 转向利用高通量测序(high-throughput
sequencing)技术平台发掘新的分子标记。例如, 吴
琼等(2012)利用基于红豆杉转录组进行高通量测
序, 进而发掘基因表达谱多态性标记(EST-SSRs)。
总体来讲, 红豆杉分子标记研究取得了一定的成
果, 基于目前快速发展的高通量测序技术平台, 今
后可以开展相关的红豆杉单核苷酸多态性(single
nucleotide polymorphisms, SNP)等新型分子标记研
究, 进一步探讨红豆杉系统进化以及紫杉醇含量
性状相关等方面的分子机制。
3 转录组学和代谢组学研究
高通量测序技术, 相对于传统的Sanger测序而
言, 又被称为“下一代测序技术”, 具有高输出量和
高度解析度的特性。高通量测序一般一次可以完
成几十万到几百万条DNA分子序列的测定, 目前
也被积极地应用于红豆杉的研究中。华中农业大
学余龙江教授实验室和中国林业科学研究院邱德
有研究员实验室分别对茉莉酸甲酯(MeJA)诱导下
的中国红豆杉和曼地亚红豆杉细胞进行了转录组
测序分析, 以期进一步阐明MeJA诱导紫杉醇产生
的机理。余龙江等的研究结果表明多个网络途径
受到了调控, 包括植物组蛋白生物合成和苯丙氨
酸合成途径(Li等2012)。邱德有等的研究结果表
明在29个已知的二萜类化合物骨架和紫杉醇生物
合成相关的基因发现18个基因在受到MeJA诱导后
表达量升高, 通过实时荧光定量PCR (quantitative
real-time PCR, qRT-PCR)实验验证了其中9个紫杉
醇生物合成相关基因的表达显著上调, 并且鉴定
植物生理学报378
了多个紫杉醇未知步骤中的候选基因和发现了一
些有关紫杉醇运输和降解相关的基因, 并对潜在
的miRNA进行了分析, 表明miRNA在MeJA诱导后
的基因表达调控中也起到了重要的作用(Sun等
2013)。植物小RNA通过控制转录后基因表达对植
物的生长、发育以及新陈代谢等具有很大负调控
作用。Qiu等(2009)利用illumina测序技术对MeJA
作用下中国红豆杉细胞产生紫杉醇的miRNA的进
行了鉴定和表达研究, 鉴定出了分属于25个家族
的58个miRNA, 并发现MeJA显著影响了某些
miRNA的表达, 有14个miRNA表达上调, 同时3个
miRNA表达下调。Hao等(2012)以曼地亚红豆杉
叶子为材料也进行了小RNA测序分析, 研究获得
了871个成熟miRNA, 869个已知植物miRNA家族
的前体, 并且他们还发现了T13αH和T2αH分别是
miRNA 164和miR171的剪切靶标。除了illumina测
序平台之外, 454测序平台也被利用到红豆杉转录
组研究中。Wu等(2011)利用454测序技术对东北
红豆杉的针叶进行了转录组测序研究, 共获得了81
148条高质量的短reads, 组装出了20 557条无重复
序列, 包括12 975条singletons和7 582条contigs, 发
现了多个紫杉醇生物合成的推测的基因。尽管之
前已有国外研究者利用消减抑制杂交(suppression
subtractive hybridization, SSH)方法对不同MeJA处
理时间的东北红豆杉的悬浮细胞进行分析, 获取
得到了331个unigene的信息(Lenka等2012), 相比较
而言, 转录组学在红豆杉上的应用得到的信息资
源则显得更为广泛和全面, 为今后展开红豆杉相
关功能基因克隆和分子标记等研究奠定了坚实的
基础。
此外, 代谢组学技术也开始被研究者尝试用
于红豆杉的研究。国外Tanaka等(2011)利用高分
辨率多级质谱(LC-IT-TOF-MS)的手段对1~5年生
的南方红豆杉小苗中的紫杉烷类化合物进行了鉴
定和分离。国内研究者也发表了相关报道。Han
和Yuan (2009)对在层流剪切力的作用下的东北红
豆杉细胞进行了代谢轮廓谱分析, 鉴定出了65个
细胞内的代谢物。Hao等(2011)首先利用illumina
测序平台对南方红豆杉进行了转录组测序研究,
并利用基因表达谱技术分析了红豆杉根、茎、叶
中紫杉烷生物合成相关基因的表达, 发现这些基
因在根中的表达量要高于茎、叶中的表达量。进
而, 他们利用代谢组学超快度液相色谱(ultra fast
liquid chromatography, UFLC)和质谱(mass spec-
trometry, MS)对包括紫杉醇在内的6种典型的紫杉
类化合物在根、针叶中的含量进行了测定比较,
结果证实在紫杉烷类物质在根中的含量要明显高
于针叶中含量。
4 小结与展望
综上所述, 不难看出科研工作者在过去的20
多年里, 在红豆杉分子生物学研究方面取得了很
大进展, 然而, 也应看到在目前的研究工作中仍存
在着一些问题和需要进一步加强。当前虽然已经
克隆获得了多个紫杉醇生物合成相关基因, 但是
围绕这些基因开展的转基因调控工作却很少, 并
且, 转录因子调控紫杉醇生物合成途径的研究也
需要深入展开。紫杉醇整个的生物合成途径中还
有很多未解之谜, 例如C1位的催化酶和D环形成的
基因至今尚未被分离克隆。在当前高通量测序等
科学技术的快速发展的背景下, 我们在获得了前
所未有的大批量的红豆杉基因资源信息的基础上,
应综合利用基因工程、生物信息学、化学以及组
织培养等多学科技术手段来破解这些未解之谜,
深入发掘、充分利用现有的红豆杉基因资源信息,
培育具有优良性状的红豆杉新品种, 进一步阐明
紫杉醇生物合成网络途径和途径中的关键酶的作
用以及与其他诱导子之间的相互影响, 对于提高
紫杉醇产量、实现紫杉醇产业化生产乃至拯救更
多的癌症病人都具有非比寻常的重要意义。
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