全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (10): 1541~1545　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0332 1541
收稿 2014-07-21　　修定 2014-08-20
资助 中央财政林业科技推广示范项目([2012]TS008号)。
* 通讯作者(E-mail: 51576419@qq.com; Tel: 0571-86020113)。
北美冬青‘奥斯特’的组织培养和快速繁殖
张俊林1, 余有祥2, 沈柏春1, 丁旭升1, 钱飞1, 孙英坤1, 吴光洪1,*
1杭州市园林绿化股份有限公司, 杭州310000; 2杭州润土园艺科技有限公司, 杭州310000
摘要: 以北美冬青‘奥斯特’ (‘Oosterwijk’)成年雌性优良单株半木质化茎段为材料, 建立了组织培养快速繁殖体系。结果表
明, WPM+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1可作为启动培养基, 最佳的继代增殖培养基为WPM+6-BA 1.00 mg·L-1+NAA
0.10 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1, 25 d的增殖系数为6.1; 生根培养基为1/2WPM+IBA 0.20 mg·L-1+NAA 0.40 mg·L-1, 生根率达95.2%,
每株平均生根5.7条。经生根培养30 d和日光温室炼苗10 d后, 试管苗移入泥炭和珍珠岩(1:1, V/V)混合基质中, 移栽后的成
活率达98%。该体系的建立为北美冬青规模化生产提供了技术平台。
关键词: 北美冬青; 组织培养; 快速繁殖
Tissue Culture and Rapid Propagation of Ilex verticillata ‘Oosterwijk’
ZHANG Jun-Lin1, YU You-Xiang2, SHEN Bo-Chun1, DING Xu-Sheng1, QIAN Fei1, SUN Ying-Kun1, WU Guang-Hong1,*
1Hangzhou Landscaping Incorporated, Hangzhou 310000, China, 2Hangzhou RUN-TU Gardening Science and Technology Co.,
Ltd., Hangzhou 310000, China
Abstract: The tissue culture technology was studied in this research by using semi-lignified shoots from female
individual ‘Oosterwijk’ (Ilex verticillata). The results showed that bud formation on the nodal explants was in-
duced on the WPM medium supplementing with 6-BA 0.50 mg·L-1 and NAA 0.05 mg·L-1; the best medium for
proliferation was WPM supplemented with 6-BA 1.00 mg·L-1, NAA 0.10 mg·L-1 and sucrose 20 g·L-1, the pro-
liferation coefficient was 6.1 after subculturing for 25 d; the optimal rooting medium was 1/2WPM supplement-
ed with IBA 0.20 mg·L-1 and NAA 0.40 mg·L-1, with rooting rate up to 95.2% and 5.7 roots per shoot. After
rooting culture for 30 days and acclimatization in greenhouse for 10 days, the shoots were transferred to the
substrate of perlite and peaty soil (1:1, V/V) and the survival rate was 98%. These results can provide the tech-
nical basis for scale production of plantlets of I. verticillata ‘Oosterwijk’.
Key words: Ilex verticillata; tissue culture; rapid propagation
北美冬青(Ilex verticillata)又名轮生冬青、美
洲冬青, 为冬青科冬青属多年生落叶灌木。北美
冬青‘奥斯特’自2006年从荷兰引进, 通过8年安全
性、适应性及生物学性状的观察(余有祥等2012),
在浙江杭州地区, 10月上旬果实成熟, 果实由绿色
转为红色, 挂果期10月至翌年4月, 果实鲜红, 有
光泽, 可做切枝、盆栽, 是新型优良的年宵花观果
树种。
北美冬青通常采用播种、扦插和嫁接等方式
繁殖。采用种子繁殖时, 由于种子深度休眠, 经处
理的种子层积一个冬天发芽率为17.1%, 而对照种
子则颗粒不发(徐本美等2002)。另外, 籽播苗开花
结果前雌雄株难以区分; 种子苗会出现分离现象,
不能保持亲本的优良性状; 同时实生苗童期较长,
推迟了开花结果时间。采用扦插繁殖, 受季节及
穗条质量限制, 影响具有优良性状植株的繁育系
数, 限制了其推广应用。利用组织培养技术对冬青
属植物进行离体培养和快繁已有一些报道。李登
中(2004)以日本金叶冬青(I. crenata)顶芽和带腋芽
的嫩茎段为外植体, 获得了大量再生植株。王桂
文等(1997)在进行苦丁茶(I. kudingcha)组织培养繁
殖的研究中, 发现在MS培养基中添加1.00~4.00
mg·L-1 6-BA, 可让苦丁茶快速增殖, 而生长素NAA
对苦丁茶的组培繁殖没有促进效应。李永欣等
(2007)以美洲冬青带腋芽茎段为外植体进行快繁
试验 , 结果表明在MS+氯吡苯脲 (CPPU) 1.00
mg·L-1+NAA 0.50 mg·L-1培养基上的增殖效果较
好, 取得了组培快繁的成功。目前, 北美冬青‘奥斯
植物生理学报1542
特’尚未见组培快繁的相关报道。本研究以‘奥斯
特’的优良雌性单株茎段为外植体, 建立了组织培
养无性系工厂化生产体系, 旨在短期内培育出大
量优质无性系‘奥斯特’种苗, 以满足市场的需求。
材料与方法
1 外植体来源
供试材料来自杭州润土园艺科技有限公司苗
圃10~12年生的北美冬青‘奥斯特’ [Ilex verticillata
(L.) A. Gray ‘Oosterwijk’]地栽苗的优良雌株。在6
月份晴天午后, 采集当年抽生的15~30 cm长的健
壮、无病虫害萌条, 去掉叶片并保留1~2 cm叶柄,
用湿润报纸包裹保湿, 置于4 ℃冰箱保存备用。
2 外植体处理
将枝条截成2~3 cm长带1~2个节的茎段, 用饱
和洗衣粉溶液浸泡, 置磁力搅拌器上旋转30 min,
然后用自来水冲洗干净, 并用流水冲洗20 min左
右。然后在超净工作台上, 用75%酒精浸泡60 s, 1
g·L-1升汞溶液消毒7 min, 再用无菌水冲洗4~5次,
期间不断摇动。然后将茎段取出置于接种盘中,
待风干后, 将茎段两端各切去0.5~0.7 cm, 切成
1.0~1.5 cm长的带0.5~1.0 cm叶柄的茎段, 接种至
诱芽培养基上。
3 诱芽培养
诱芽培养基为WPM+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA
0.05 mg·L-1, 另添加蔗糖30 g·L-1、琼脂7 g·L-1, pH
调至5.8。
4 继代增殖培养
L9(3
4)正交试验设计筛选最优增殖培养基配
方试验, 基本培养基分别为B5、1/2MS和WPM,
6-BA浓度分别为0.50、1.00和1.50 mg·L-1, NAA
浓度分别为0.05、0.10和0.20 mg·L-1, 蔗糖用量分
别为20、30和40 g·L-1的四因素三水平设计试验,
以繁殖系数和生长状况为指标 , 筛选合适的培
养基。
按照正交试验设计的生长物质配比, 将诱芽
培养基上形成的无菌苗切割成长0.5~1.0 cm单芽
或顶芽茎段接到不同生长物质配比的增殖培养基
中。每处理10瓶, 每瓶接种5个茎段或顶芽, 重复3
次。接种25 d后, 观察不同培养基对试管苗生长状
况的影响。增殖系数=培养后获得的芽数/接种时
的芽数(计数芽长度≥0.5 cm)。
5 生根培养
生根培养基为1/2WPM, 加蔗糖20 g·L-1、琼脂
7 g·L-1, pH 5.8。IBA的浓度为0、0.10和0.20 mg·L-1;
NAA的浓度为0.20、0.30和0.40 mg·L-1。培养基配
制后经121 ℃高温高压灭菌20 min后备用。选择
长1.5~2.0 cm, 生长健壮、长势一致的组培苗嫩茎,
分别转接到不同生长物质配比的生根培养基中。
接种30 d后调查生根数, 2条及以上为有效根,统计
生根率。每个处理10瓶, 每瓶接种10个嫩茎, 重复
3次, 筛选合适的生根培养基, 同时设置不加生长
物质的培养基为对照处理。
6 培养条件
外植体芽诱导、继代增殖及生根均在(25±3)
℃、光照强度40 μmol·m-2·s-1、每天12 h光照条件
下培养。
实验结果
1 无菌快繁体系的建立
未污染并成活的外植体, 接种后7 d, 叶柄出现
松动脱落, 腋芽开始膨大; 10 d可见冒出的腋芽, 25
d时腋芽伸长且有叶片展开, 以单芽生长为主, 培
养40 d后嫩茎长至3~4 cm (图1-A)。切割嫩茎后转
接入相同的芽诱导培养基, 经过2~3次继代后, 腋
芽分化出丛生芽, 丛生芽繁殖能力增强, 无菌无性
系群体数量变大。
启动培养过程中出现了一个有趣的现象, 茎
段外植体在诱芽培养基上不但抽生了健壮的嫩茎,
同时也形成了致密的绿色愈伤组织(图1-B), 切割
继代嫩茎的同时, 将茎段外植体愈伤组织切除干
净, 转入芽诱导培养基中继续培养, 30 d后再次收
获高度3~4 cm的嫩茎, 外植体基部依然出现致密
绿色愈伤组织; 再次同上操作后培养30 d, 依然出
现以上现象。反复培养了6次, 收获嫩茎7次, 持续
时间达7个月之久。第4次收获时, 抽生嫩茎叶色
转黄, 愈伤组织变小, 第5~7次收获的嫩茎质量依
次变差, 最后一次收获时, 嫩茎纤细、高度不足1
cm、叶片黄化、愈伤组织黄褐色、成松散状, 外
植体茎段干瘪。再次转接, 10 d后死亡。
2 不同植物生长物质配比对北美冬青继代增殖的
影响
增殖培养采用茎段切割的方式进行繁殖, 选
取经2~3次芽诱导培养基中培养的扩大群体内的
张俊林等: 北美冬青‘奥斯特’的组织培养和快速繁殖 1543
长势及叶片数量基本一致的茎段接种到继代培养
基中。
由表1可知, 接种在WPM+6-BA 1.50 mg·L-1+
0.10 NAA mg·L-1+蔗糖20 g·L-1的培养基上增殖系
数最大, 为6.1, 但在此培养基配方下, 继代培养时
发现组培苗有玻璃化现象。将6-BA浓度降到1.00
mg·L-1时玻璃化现象消失, 增殖率仍为6.1。根据试
验结果得到最佳的增殖培养基配方为: WPM+6-BA
1.00 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1, 增殖
系数为6.1, 芽苗健壮、叶色浓绿(图1-C)。
3 不同植物生长物质配比对北美冬青根诱导的影响
将无根壮苗转入生根培养基中进行生根诱
导。统计不同浓度的IBA和NAA处理对试管苗生
根的影响。从表2可以看出 , 不同浓度的IBA和
NAA组合对根诱导效果都明显高于不添加任何生
长物质的对照处理; 添加IBA对根的诱导有促进作
图1 北美冬青‘奥斯特’的组织培养及快速繁殖
Fig.1 Tissue culture and rapid propagation of I. verticillata ‘Oosterwijk’
A: 外植体萌芽; B: 芽基部形成绿色致密愈伤组织的外植体萌芽; C: 继代培养基上培养15 d形成的丛生芽; D: 根系发达的生根苗; E:
移栽至苗床的生根苗; F: 炼苗40 d的成活苗。
表1 不同继代培养基对北美冬青增殖的影响
Table 1 Effects of different subculture mediums on the multiplication of I. verticillata
处理 培养基 6-BA浓度/ NAA浓度/ 蔗糖含量/ 增殖 生长状况
mg·L-1 mg·L-1 g·L-1 系数
1 B5 (1) 0.50 (1) 0.05 (1) 20 (1) 2.3
e 新梢有死亡, 新叶黄绿
2 B5 (1) 1.00 (2) 0.10 (2) 30 (2) 2.6cde 新梢有死亡, 新叶黄绿
3 B5 (1) 1.50 (3) 0.20 (3) 40 (3) 3.1
cd 新梢死亡严重, 新叶黄绿, 丛生芽较多
4 1/2MS (2) 0.50 (1) 0.10 (2) 40 (3) 2.9cde 新叶黄绿
5 1/2MS (2) 1.00 (2) 0.20 (3) 20 (1) 3.3bc 叶绿
6 1/2MS (2) 1.50 (3) 0.05 (1) 30 (2) 3.3bc 健壮, 叶绿
7 WPM (3) 0.50 (1) 0.20 (3) 30 (2) 2.5de 健壮, 叶浓绿
8 WPM (3) 1.00 (2) 0.05 (1) 40 (3) 4.0b 健壮, 叶浓绿, 丛芽整齐
9 WPM (3) 1.50 (3) 0.10 (2) 20 (1) 6.1a 叶黄绿, 丛芽多, 短小, 偶见玻璃化
T1 2.68 2.57 3.20 3.89
T2 3.20 3.32 3.88 2.82
T3 4.19 4.18 2.99 3.36
R 1.51 1.61 0.89 1.07
　　同列数据旁不同小字字母表示α=0.05水平下差异显著, 表2同。T1、T2、T3为各因素3个水平(括号内数字)的均值; R为极差。
植物生理学报1544
表2 不同浓度IBA和NAA对北美冬青根诱导的影响
Table 2 Effect of different concentration of IBA and NAA on the rooting of I. verticillata
处理 IBA浓度/mg·L-1 NAA浓度/mg·L-1 平均生根率/% 平均生根数/条
1 0.20 0.40 95.2a 5.7a
2 0.20 0.30 93.2ab 5.4ab
3 0.20 0.20 91.9bc 5.4ab
4 0.10 0.40 91.3bcd 5.5ab
5 0.10 0.30 88.6de 4.9cd
6 0.10 0.20 82.6f 4.6d
7 0 0.40 90.2cde 5.1bc
8 0 0.30 88.3e 4.9cd
9 0 0.20 78.5g 4.7cd
对照 0 0 62.6h 4.5d
　　接种30 d后统计生根率及生根数。
用, 浓度增大, 促进效果越大, 生根率和平均生根
条数都有提高。综合来看, IBA 0.20 mg·L-1+NAA
0.40 mg·L-1为最佳生长物质组合 , 平均生根率
95.2%, 平均生根5.7条(图1-D)。
4 炼苗与移栽
生根培养30 d后, 打开瓶口, 使生根苗逐渐与
外界接触, 以提高其适应能力。保持较高的空气
湿度, 气温高时注意遮阴, 炼苗10 d。取苗前24~36
h, 培养瓶注入干净的自来水, 以不淹没小苗为标
准。取苗时, 将注水软化的培养基直接倾倒至塑
料盆中, 拾取小苗, 洗净根部的培养基, 用1‰的高
锰酸钾溶液浸泡小苗5~10 min, 然后移入泥炭:珍
珠岩=1:1 (V/V)的基质中(图1-E), 置于相对湿度
80%~90%、温度30~35 ℃的塑料拱棚培养, 移栽
后的成活率达98% (图1-F)。
讨　　论
本研究直接从优良雌性母株上取材, 诱导茎
段腋芽并再生植株, 这种“以芽繁芽”的繁殖方式可
保持母株的优良特性。陈芳等(2000)和刘英等
(2003)分别在扁桃和西南桦组培研究中指出, 采用
以芽繁芽途径, 避免了愈伤组织再生途径可能导
致的遗传不稳定性, 更适于种苗工厂化快繁。
不同的培养基由于其组成成分的不同, 培养
的效果也有差异。通常认为B5培养基是高硝酸钾
培养基, MS为富集元素平衡的高盐培养基, WPM
培养基则属于中等无机盐的培养基, 于是不同的
基本培养基组成对增殖的效果和苗的形态有较大
的影响。在B5为基本培养基的处理下, 芽苗均有不
同程度的茎尖死亡现象, 在1/2MS (大量元素减半)
和WPM为基本培养基的处理下则无此现象, 这可
能与B5培养基中含有较高浓度的硝酸盐有关。在
植物组织培养中, 内源激素与外源生长物质起着
重要的调控作用, 影响繁殖速度的关键往往是多
种激素综合及平衡作用的结果, 通过改变外源细
胞分裂素或者生长素与细胞分裂素的比例, 能影
响增殖系数。因此在北美冬青的继代增殖培养中
设计了6-BA和NAA的组合配方, 结果表明, 北美冬
青的增殖系数随6-BA浓度的升高而有所增高, 但
浓度过高不利于芽苗的生长, 过高浓度的6-BA是
导致芽苗玻璃化产生的重要因素。
继代培养第5代时, 已获得了一定数量的瓶苗,
第6代时, 我们尝试着诱导生根, 依据笔者的多年
工作经验, 采用1/2WPM+IBA 0.10 mg·L-1+NAA
0.30 mg·L-1培养基配方诱导生根, 培养了约90 d, 未
见根的出现; 转接继代第14次时, 在诱导培养上获
得了80%以上的生根率, 继代20次后, 在不添加任
何生长素的空白培养基上能获得60%以上的根诱
导率。由此可推测, 北美冬青根的诱导与继代次
数有一定的关系, 由于实验条件有限, 未做继代次
数与生根诱导率相互变化的试验。
植物组织培养生根阶段, 通常采用大量元素
减半的培养基, 同时减少蔗糖的用量, 可能的原因
是降低培养基中营养成分的含量促进根原基的形
成及发育。本试验采用大量元素减半的WPM作为
基本培养基, 选择IBA和NAA两种植物生长素配比
进行生根试验, 结果表明在IBA 0.20 mg·L-1+NAA
0.40 mg·L-1的处理下, 生根率最高, 为95.2%, 生根
张俊林等: 北美冬青‘奥斯特’的组织培养和快速繁殖 1545
条数也最多, 为5.7条, 同时有大量毛细根, 在炼苗
移栽中发现, 这种根数多的苗更利于成活。
本研究以优良雌性单株半木质化的茎段为外
植体, 获得了较高的增殖系数、生根率和移栽成
活率, 筛选出了‘奥斯特’组培苗快繁过程中各个阶
段所需的最佳培养基, 建立了一种稳定而高效的
组织培养与快繁技术体系, 可为其工厂化快速育
苗提供技术支持。
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