全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (10): 1077~1081 1077
收稿 2013-06-03　　修定 2013-07-16
资助 林业行业专项(201204304)和广东省林业科技创新项目
(2012KJCX001-05)。
* 通讯作者(E-mail: qzf5702@163.com; Tel: 020-87032851)。
米老排的组织培养和快速繁殖
裘珍飞*, 曾炳山, 李湘阳, 刘英, 范春节
中国林业科学研究院热带林业研究所, 广州510520
摘要: 以米老排人工林成年优树当年生枝条茎段为外植体, 建立了“以芽繁芽”的组织培养快速繁殖体系。丛芽诱导培养最
快的无性系, 经过3个月的培养, 一个外植体可获得17.2个芽。在添加6-BA 1.0 mg·L-1的MS培养基上增殖率最高, 月增殖率
为2.43。促进苗高生长的最有效培养基是MS+6-BA 0.4 mg·L-1+GA3 0.4 mg·L
-1。生根培养基为1/2MS+IBA 0.4 mg·L-1+0.1
g·L-1活性炭, 生根率达81.8%以上, 每株苗生根7.8条, 平均苗高为1.2 cm。经生根培养20 d和日光温室炼苗15 d后, 试管苗移
植入黄泥和泥炭土(4:1, V/V)混合基质中, 成活率达85%以上。
关键词: 米老排; 组织培养; 快速繁殖
Tissue Culture and Rapid Propagation of Mytilaria laosensis Lecomte
QIU Zhen-Fei*, ZENG Bing-Shan, LI Xiang-Yang, LIU Ying, FAN Chun-Jie
Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, China
Abstract: This paper deals with tissue culture of Mytilaria laosensis Lecomte by tender stem explants. The
clone which was induced to proliferate at the highest speed produced 17.2 shoots per explant within 3-month
induction culture. MS medium supplemented with 6-BA 1.0 mg·L-1 was favorable to multiplication culture and
the maximum propagation coefficient of adventitious shoots reached 2.43. The optimum medium for shoot
elongation was MS+6-BA 0.4 mg·L-1+GA3 0.4 mg·L
-1. The rooting medium was 1/2MS+IBA 0.4 mg·L-1+
activated carbons 0.1 g·L-1, with rooting rate up to 81.8%, 7.8 roots per shoot and the average plantlet height of
1.2 cm. The plantlets with 20 days’ rooting culture and 15 days’ acclimatization in greenhouse were transferred
to the substrate of yellow subsoil and peaty soil (4:1, V/V) and the outplanting survival rate was 85%.
Key words: Mytilaria laosensis Lecomte; tissue culture; rapid propagation
米老排别名壳菜果、三角枫, 属金缕梅科常
绿阔叶大乔木, 是我国栽培的珍贵树种, 树高达30
m以上, 胸径达1 m。米老排天然分布于我国的广
东、广西和云南及越南、老挝等地 , 在我国福
建、江西等地也有人工栽培(李振问1997; 刘济祥
和何伟民2006)。1974年, 云南省将米老排推选为
云南热带地区经济价值较高、有发展前途的优良
用材树种(景跃波等2008)。随着米老排人工林种
植年限的增加和种植面积的扩大, 米老排的生态
效果、防火作用、木材性质及利用等方面的特性
不断被研究和认识。米老排可营造速生丰产林,
获得较好的经济效益, 五年生蓄积量均大于乡土
阔叶树种的石梓、红锥和火力楠(汪炳根和卢立华
1995); 而且育苗容易, 造林成活率高, 早期速生且
高速生长期持续较长(郭文福等2006); 另外, 作为
防火路生土带及长期的火烧山土壤造林的先锋树
种, 改善土壤理化性质及防火效果显著(李振问
1997)。米老排与杉木混交林、米老排与红锥和格
木混交林可作为我国南亚热带和中亚热带林业可
持续经营模式推广应用(郭友林2002; 蔡道雄等
2007)。
采用ISSR分子标记技术, 从DNA分子水平上
揭示米老排种群的遗传结构和遗传多样性水平,
为开展遗传改良研究提供理论依据 (彭继庆等
2012)。我国米老排人工林都采用种子苗培育造
林, 种子苗的遗传多样性决定人工林难以获得最
大产量。Sprague和Weir (1973)研究并推测, 美国
枫香最大的遗传增益可通过选取优良林分中的优
良单株而获得。目前尚未见到国内外关于米老排
良种选育和组织培养的报道。本试验通过选取人
工林中优良单株的办法, 建立组织培养无性繁殖
体系, 用于优良株系的繁殖, 旨在短期内培育出大
植物生理学报1078
量优质无性系苗木以满足市场的需求, 同时为进
一步利用基因工程方法对米老排开展遗传改良提
供理论和技术依据。
材料与方法
1 材料
供试材料为采自广东省西江林场三至五年生
的米老排(Mytilaria laosensis Lecomte)人工林中的
优良单株。
2 试验方法
2.1 外植体处理
在7月份连续5个晴天后 , 采集当年生萌条
25~30 cm, 去叶后放入保鲜密实袋中, 当天带回实
验室进行消毒处理。先把采集的枝条放在洗衣粉
溶液浸洗30 min, 用自来水冲洗干净; 在超净工作
台上切成2~3 cm的带节茎段, 用75%的酒精处理
l min, 再用0.1%升汞消毒7~10 min, 期间不断摇动,
用无菌水洗4~5次, 每次3~4 min; 然后将茎段两端
各切去0.5~0.7 cm, 切成1.0~1.5 cm长的带节茎段,
接种到培养基上。
2.2 培养基配制及培养条件
芽诱导培养基: MS+6-BA 1.0 mg·L-1。继代增
殖培养基: MS+6-BA 0.5~2.0 mg·L-1; MS+6-BA
0.2~0.8 mg·L-1+GA3 0.2~0.8 mg·L
-1。生根培养基:
1/2MS+IBA 0.2~0.8 mg·L-1+0.1 g·L-1活性炭。以上
培养基中均加入3%蔗糖和7.0 g·L-1卡拉胶, pH
5.6。培养温度为(25±2) ℃, 光照时间10 h·d-1, 光照
强度30~40 μmol·m-2·s-1。
2.3 培养过程及数据调查
9株优良单株(M1~3, M5~10)枝条外植体经消
毒处理后接种于芽诱导培养基上, 根据采集外植
体的数量接种20~60个·株-1, 每瓶接种1个, 共395
瓶。1个月后统计污染率和成活数; 将成活的外植
体在相同的培养基上连续转接3次, 转接周期为30
d, 3个月后统计分化芽数, 计算平均月增殖率。污染
率=(污染瓶数/接种瓶数)×100%; 平均月增殖率=
(3个月分化芽数/1个月成活外植体数)1/3。
选取同一无性系进行增殖试验。切取生长一
致的芽丛, 接入不同浓度6-BA和6-BA/GA3双因子
试验增殖培养基中, 每处理接种6个芽丛, 重复3
次。接种后观察并记录丛芽增殖和芽高生长状况,
30 d后统计增殖率, 测量芽高。增殖率=培养后获得
的芽数/接种时的芽数; 芽高为顶芽到基部的长度。
切取增殖培养中芽高0.5 cm以上的单芽, 转到
含不同浓度IBA的生根培养基上, 每种培养基接种
20株, 重复3次。接种后观察苗及根的生长情况, 35 d
后统计苗高、生根率、生根数、根长等指标。生
根率=(生根苗数/接种苗数)×100%。
接入生根培养基的苗先在培养室生根培养20 d,
然后放入日光温室炼苗培养15 d。移栽时, 取出试
管苗, 洗净根部附着的培养基, 移入预先消毒处理
过的黄泥和泥炭土(4:1, V/V)混合基质中。移栽7 d
内, 薄膜全封闭管理, 定期淋水和遮荫; 移栽7~20
d, 早晚打开薄膜通风, 配合定期淋水和减轻遮荫;
30 d后实行全光照正常苗圃管理, 并统计植株的成
活率。成活率=(成活苗数/移栽苗数)×100%。
3 数据统计分析
所有百分数经平方根反正弦化ASIN (SQRT-
(X))、个数经平方根转化SQRT(X), 采用SAS分析
软件进行方差分析和Duncan多重比较。文中数据
为未转化数据均值。
实验结果
1 无菌无性系的建立
消毒后的9个优良单株外植体经过1个月的培
养, 污染率和成活数各不相同, 总体上采自野外人
工林的枝条外植体污染率较高, 其中M1全部污染,
M2、M3和M8分别只存活1个外植体, 污染率高达
95%以上, M5、M7、M9、M10污染率也达80%以
上, 唯有M6污染率为43.3% (表1)。未污染并成活
下来的外植体, 接种后10 d可见冒出的腋芽, 30 d时
腋芽伸长且有叶片展开 , 以单芽生长为主 (图
1-A)。30 d后转接入相同的芽诱导培养基, 经过
2~3次继代后, 腋芽分化出丛生芽, 丛生芽繁殖能
力强, 叶腋处不断长出新芽。不同无性系的腋芽
生长有较大差异: M2和M3无性系经过3次继代仍
未分化出丛生芽; M5和M7增殖较快, 月增殖率2.5
倍以上, 分别从4和5个外植体发展为67和86个芽,
平均每个外植体获得16.7和17.2个芽(图1-B); 其他
无性系月增殖率在1.25~1.82 (表1)。
2 6-BA对芽增殖和生长的影响
启动培养的快慢很大程度受外植体的影响,
裘珍飞等: 米老排的组织培养和快速繁殖 1079
进一步的增殖培养更主要受培养条件的影响, 6-BA
是组织培养植物中常用的外源生长调节剂, 对促
进细胞分裂、诱导芽的分化起着重要作用。不同
浓度的6-BA对米老排增殖率产生极显著差异: 浓
度在0.5~1 mg·L-1的范围内, 随着6-BA浓度的升高,
增殖率大幅提升; 在1~2 mg·L-1范围内, 增殖率随
6-BA浓度的升高而下降(表2)。因此 , 添加1.0
mg·L-1的6-BA较为适宜, 不仅增殖率高, 而且新芽
生长旺盛(图1-C), 新芽仍从腋芽处发生。这种“以
芽繁芽”的增殖方式, 获得的组织培养苗可以最大
限度地保持原母株的优良特性。
3 6-BA与GA3组合使用对增殖及苗高生长的影响
在增殖培养过程中, 米老排苗高生长缓慢, 茎
部节间短, 可生根的有效苗数少。GA3能诱导植物
茎的细胞伸长, 普遍应用于组织培养中苗高生长
的调控。6-BA和GA3双因子试验表明: 6-BA与GA3
组合使用对增殖及苗高生长有极显著的影响(F增殖率=
18.57**, F苗高=23.29
**, P<0.01)。其中, 6-BA主要影响
增殖率(F6-BA=72.29
**, P<0.01), 在0.2~0.8 mg·L-1范
围内, 增殖率随6-BA浓度增加而显著增加; 而GA3
对增殖率影响不显著。6-BA和GA3组合使用对苗
高生长具有交互作用(F6-BA=24.88
**, FGA3=55.41
**,
F6-BA×GA3=6.44
**, P<0.01), 在添加GA3时, 6-BA浓度
以0.4 mg·L-1最有利于促进苗高生长, 而GA3浓度以
0.4~0.8 mg·L-1为好, 其中6-BA 0.4 mg·L-1+GA3 0.4
mg·L-1 (5号处理)获得最佳的苗高生长效应(表3)。
表1 9个无性系外植体消毒及诱导培养
Table 1 Sterilization of explants and induction culture from nine clones
无性系编号 接种外植体数/个 1个月后存活外植数/个 1个月后污染率/% 3个月后分化芽数/个 平均月增殖率/倍
M1 60 0 100.00 0 0
M2 45 1 97.78 1 1.00
M3 60 1 98.33 1 1.00
M5 50 4 92.00 67 2.56
M6 30 17 43.33 33 1.25
M7 40 5 87.50 86 2.58
M8 20 1 95.00 6 1.82
M9 60 9 85.00 53 1.81
M10 30 6 80.00 31 1.73
图1 米老排的组织培养及快速繁殖
Fig.1 Tissue culture and rapid propagation of M. laosensis
A: 外植体萌芽; B: M7无性系3次继代后的增殖芽; C: 增殖培养(6-BA 1.0 mg·L-1); D: 生根培养(IBA 0.4 mg·L-1); E: 供移栽的组织培养苗。
表2 不同浓度6-BA对芽增殖及生长的影响
Table 2 Effect of different concentrations of 6-BA on the multiplication culture and shoot growth
6-BA浓度/mg·L-1 增殖率/倍 苗木生长状态
0.5 1.65a 叶色深绿, 茎粗壮, 老芽高度生长明显, 苗高小于0.5 cm的新芽少
1.0 2.43b 叶色嫩绿, 苗高小于0.5 cm的新芽生长多, 且生长旺盛, 老芽高度生长不明显
1.5 2.13c 叶色黄绿, 苗高小于0.5 cm的新芽生长一般, 基部部分老叶加厚卷曲
2.0 1.67a 叶色黄绿, 基部老叶加厚卷曲, 苗高小于0.5 cm的新芽生长少, 且轻微玻璃化
　　表中同列数据后不同字母表示差异极显著(P<0.01)。
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表4 不同浓度IBA对生根的影响
Table 4 Effect of different concentrations of IBA on rooting
IBA浓度/mg·L-1 生根率/% 每苗根数/条 每苗总根长/cm 苗高/cm
0.2 88.2 6.0 8.7 1.06a
0.4 81.8 7.8 10.4 1.20b
0.6 80.2 6.4 9.5 1.06a
0.8 87.5 7.8 11.2 1.10a
　　表中同列数据后不同字母表示差异极显著(P<0.01), 无字母
标识表示差异不显著。
表3 6-BA和GA 3不同组合对增殖及苗高生长的影响
Table 3 Effect of different combinations of 6-BA and GA3 on the multiplication culture and shoot elongation
编号 6-BA浓度/mg·L-1 GA3浓度/mg·L
-1 增殖率/倍 苗高大于1.0 cm的株数/株·丛-1
1 0.2 0.2 1.34 1.01
2 0.2 0.4 1.30 1.72
3 0.2 0.8 1.35 2.11
4 0.4 0.2 1.71 1.89
5 0.4 0.4 1.60 2.60
6 0.4 0.8 1.64 2.17
7 0.8 0.2 2.04 0.81
8 0.8 0.4 2.23 1.99
9 0.8 0.8 2.21 2.11
4 IBA对生根的影响
将增殖芽中芽高超过0.5 cm的单芽切下, 接入
添加不同浓度 IBA的生根培养基中 , 在高浓度
(0.6~0.8 mg·L-1) IBA环境下7~10 d开始出根, 且长
出的根系粗壮有力; 低浓度(0.2~0.4 mg·L-1) IBA环
境下10~15 d开始出根, 长出的根系纤细, 苗基部不
产生愈伤组织(图1-D)。生根培养35 d后统计生根
指标, 结果显示: 不同IBA浓度下, 生根率、每苗根
数和根长无显著差异, 生根率大于80%, 每苗根数
6~8条, 总根长10 cm左右; IBA浓度为0.4 mg·L-1时
苗高极显著高于其他处理, 苗长势旺盛, 从有利于
移植成活的角度, 为可选的生根浓度(表4)。
特别对来自人工不可控制的野外材料, 外植体表
面尘埃及杂菌较多, 这也是本试验外植体消毒污
染率高的主要原因。从枝条状况看, 米老排枝条
粗壮, 表皮光滑, 腋芽饱满, 属于比较容易消毒的
树种, 预备试验时采集苗圃枝条, 消毒成功率高达
70%。试验中M6无性系污染率较其他无性系低,
其原因是M6优良单株生长在山脊线上, 阳光充足,
环境相对干爽, 萌条粗壮、干净。因此, 人工促萌
后增加透光度是提高米老排消毒成功率较为有效
的方法。不同无性系增殖能力的差异主要受基因
型的控制, 这在相思(裘珍飞等2002)、枫香(龚峥
等2012)等植物中都有报道。我们在米老排组织培
养中也发现, 虽然有的无性系能够建立组织培养
繁殖体系, 但通过人为的培养基和培养条件等调
控, 难以达到2倍以上的增殖率, 因此这些无性系
可用于科学研究, 但难以应用于规模化大生产。
在金缕梅科植物的组织培养中, 普遍存在不
定芽高度生长缓慢的现象, 如: 长柄双花木在离体
再生培养过程中, 不定芽和再生植株生长非常缓
慢(曾建军等2006); 北美枫香诱导出的丛芽在
MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1培养基上, 每
丛只有2~3个芽可以伸长, 其余的不定芽均处于矮
化状态(吕秀立等2005); 金缕梅在MS+6-BA 1.0
mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培养基上, 芽高仅0.2~1.7
cm (张启香等2005)。米老排组织培养中不定芽的
高度生长也偏慢, 这对规模化生产带来影响。对
此, 主要通过选择适合的生长调节剂并调节其配
比来加以解决。如金缕梅和北美枫香 , 可降低
6-BA浓度以获得较高的芽(张启香等2005; 吕秀立
等2005); 在苗圃地, 300 mg·L-1赤霉素能显著促进
5 炼苗及移植
将经过20 d生根培养的苗转入日光温室中炼
苗15 d, 组织培养苗平均苗高大于1.0 cm, 根系发
达, 苗茎粗壮, 叶片青绿、舒展(图1-E)。移栽30 d
后, 成活率达85%以上。
讨　　论
外植体的表面灭菌是建立无菌无性系的关键,
裘珍飞等: 米老排的组织培养和快速繁殖 1081
米老排苗高和节间长度的生长(陈永密1981)。本
试验结果表明: 6-BA浓度对苗高生长影响不显著,
6-BA和GA3配合使用可以显著促进苗高生长, 效果
最佳的组合是6-BA 0.4 mg·L-1+GA3 0.4 mg·L
-1, 每
丛获得苗高大于1.0 cm的苗2.6株, 且苗生长正常。
红花荷在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1 +
0.5 mg·L-1活性炭的培养基上, 通过2~3次继代, 从
“以芽繁芽”的增殖方式转变为愈伤组织生芽, 增殖
倍数达5倍(戴小英等2009)。我们在米老排组织培
养中, 添加6-BA、GA3和IBA并调节其配比, 都未
能在苗基部产生愈伤组织, 而高质量的愈伤组织
无疑可促进苗的增殖和生长。因此, 进一步提高
增殖率和促进苗高生长仍是米老排规模化生产要
着重解决的问题。
长柄双花木诱导不定根时必须添加IBA, 添加
NAA未见不定根发生(曾建军等2005)。米老排组
织培养苗生根也采用IBA诱导, 很容易生根, 在含
IBA 0.2~0.8 mg·L-1的培养基上生根率达80%以上,
且根系发达, 生根、炼苗培养35 d后, 平均苗高为
1~1.2 cm, 这样的苗木适合于移植成活。
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