全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 2期，2009年 2月 137
黑杨胚抢救技术体系优化
奚晓军, 魏芳, 张金凤 *
北京林业大学生物科学与技术学院, 教育部林木花卉遗传育种重点实验室, 林木育种国家工程实验室, 北京 100083
提要: 采用组织培养技术进行黑杨胚抢救和比较不同黑杨派树种杂交组合以及不同胚抢救时间的结果表明黑杨胚抢救的
最佳时间范围为授粉后 30~35 d。已长有 3支以上须根的胚培苗进行移栽时保持的温度为 20~25 ℃, 湿度为 70%左右, 3 d
可成活, 1周即可完全适应外界环境。
关键词: 黑杨; 胚抢救; 组织培养; 移栽
Optimized Embryo Rescue System of Section Aigeiros
XI Xiao-Jun, WEI Fang, ZHANG Jin-Feng*
National Engineering Laboratory for Tree Breeding, Key Laboratory for Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental
Plants, Ministry of Education, College of Biological Science and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
Abstract: The different time and conditions of embryo rescue in Section Aigeiros were studied for the estab-
lishment of optimized embryo rescue system. Effects of different hybrid combination among poplar trees on
embryo rescue system were also studied. The results showed that the optimal time of embryo rescue ranged
from 30 d to 35 d after pollination. When embryos with more than 3 fibrous roots were transplanted, the
temperature should range from 20 ℃ to 25 ℃, the humidity should be about 70%. Under the optimal conditions,
embryos with more than 3 fibrous roots could be alive in 3 d and the seedlings could adapt external environment
in one week.
Key words: Section Aigeiros; embryo rescue; tissue culture; transplantation
收稿 2008-10-20 修定 2008-12-10
资助 国家林业局专项课题(2 00 2 -66 )。
* 通讯作者(E-mail: zjf@bjfu.edu.cn; Tel: 010-62338415)。
在杨属(Populus L.)各派中, 黑杨派(Section
Aigeiros)树种种子发育成熟期较长, 在进行室内切
枝水培杂交育种过程中, 常由于营养不足或处理损
伤等问题, 出现蒴果失水干缩、果皮开裂、果穗
脱落(徐纬英1988)以及多倍体杂交幼胚易出现早期
败育(梁青等 2006)等现象。此时, 蒴果中的种子还
未发育成熟, 自然播种时没有发芽能力。杂种胚离
体培养在果树育种中应用较多(Ramming等 1990;
Ramming 1990; 伊华林等 2001; Yamane等 1993;
Soost和Cameron 1985), 采用植物组织培养技术(牛
焕琼等2003; 马宗新等2004; 祁春芳和郑智礼2000;
李红等 2004; 于志水等 2002; 李云 2001)进行胚抢
救(赵艳华等2003)试验, 是黑杨切枝水培杂交育种
获得成功的重要途径。荀守华等(2003)在黑杨胚
珠离体培养试验时发现从授粉后 25 d起即可将带
皮种胚进行离体培养, 并能获得杂种实生苗; 而授
粉后时间越长, 杂种胚珠的成熟度越大, 组培萌发
期越短, 萌发率越高。本文在前人研究基础上, 对
培养基配方、胚抢救时间和移栽等问题进行了深
入对比, 从而建立一套优化的黑杨从幼胚到成苗的
完整技术体系, 并对不同父母本之间的交叉比较探
索杂交亲和性对胚抢救的影响。
材料与方法
试验采用 ‘山海关杨 ’ (Populus deltoides
Marsh. cv. ‘Shanhaiguanensis’)、钻天杨[Populus
nigra var. Italica (Moench.) Koehne]、欧美杨
[Populus euramericana (Dode) Guinier]以及黑杨与
青杨的派间杂种 ‘群众杨 ’ [Populus simonii×(P.
pyramidalis+Salix matsudana)]为材料。‘山海关杨 ’
采自秦皇岛, 钻天杨采自北京植物园, 欧美杨采自
北京大东流苗圃, ‘群众杨 ’ 采自北京中国林科院
内。
不同发育时期的幼胚培养实验于授粉25 d后,
每隔 5 d采蒴果若干, 经表面消毒后, 进行解剖接
种。调查记载幼胚的萌发率, 比较不同胚抢救时期
萌发的差异, 从而确定最佳胚抢救时期。
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启动培养基为1/2MS+0.3 mg·L-1 NAA+30 g·L-1
蔗糖 +7 g·L-1琼脂; 生根培养基为 1/2MS+0.2 mg·L-1
IBA+15 g·L-1蔗糖 +7.5 g·L-1琼脂。
胚培苗的移栽于春季选择不同时间, 炼苗1周
后, 分不同杂交组合移栽。移栽 30 d后统计胚培
苗的移栽成活率。
按公式 “萌发率 =萌发数 /接种数 ”和 “移栽
成活率 =成活苗数 /总移栽苗数 ”计算萌发率和移
栽成活率。
实验结果
1 授粉后不同发育期各组合的胚珠萌发
5个杂交组合授粉后不同发育期的胚珠萌发情
况见表 1。从以上 5个组合的 25 d、30 d和 35 d
的胚珠萌发率数据可以看出, 25 d时的萌发率非常
低, 因为此时胚基本上发育不全, 各组合基本在 30
d或 35 d就能实现 50%以上的萌发。实际观察可
知, 25 d的果序平均 3~5粒 ·果 -1, 但多数空, 种皮
透亮, 无胚乳。30 d以后的种子一般发育较为成
熟, 种子饱满, 接种 3 d后即能萌发，长出 2片完
整子叶。
不同黑杨杂交组合的胚萌发率有以下 3种情
况。
(1)父本相同, 母本不同。如表 1所示, 比较
以钻天杨为父本的 2个杂交组合, 整体看来 ‘欧美
杨 B’为母本时的萌发率较 ‘山海关杨 ’为母本时
高。相同条件下, 前者在 35 d时萌发率达到最高,
为 61.29%, 而后者在 30 d时达到最高的 45.22%。
‘山海关杨’是黑杨原种, 而‘欧美杨B’是派内杂种,
由萌发率可以看出, ‘欧美杨B’较 ‘山海关杨 ’与钻
天杨的亲和性强。以 ‘群众杨 ’为父本的 2个杂交
组合, 母本分别为 ‘欧美杨A’和 ‘欧美杨B’时的萌
发率相对都比较高, 但在时间上有少许差别, 前者
在 30 d时达到最高的 64.29%, 后者则是在 35 d时
达到最高, 为 54.55%。
上述结果表明, 欧美杨系列的2个品种的亲和
性普遍较好, 作为母本有一定的优势。
(2)母本相同, 父本不同。如表 1所示, 这类
组合也有 2对。第一对是以 ‘山海关杨 ’为母本,
钻天杨和 ‘欧美杨 C’分别作为父本。两种组合结
果差别很大, ‘山海关杨×欧美杨C’组合只有13.24%
的萌发率, 且只在 30 d时有少量萌发; 而 ‘山海关
杨 ×钻天杨 ’组合在 30 d时能达到 45.22%的萌发
率。从上述结果分析: 一是 ‘山海关杨 ’和钻天杨
虽然都是原种, 但由于黑杨派与青杨派亲缘关系较
近, 在杂交时不但没有表现出严重的远缘杂交的障
碍, 反而可能产生杂种优势; 二是欧美杨为黑杨派
内杂种, 它作为派内杂交组合中的父本所产生的后
表 1 授粉后不同发育期各组合的胚珠萌发率
Table 1 Different embryo germination rates after pollination
　杂交组合 授粉日期 接种日期 授粉后天数 接种数 萌发数 萌发率 /%
1×2 07.03.07 07.04.02 2 5 1 8 2 11.11
07.04.07 3 0 115 5 2 45.22
07.04.12 3 5 100 1 9 1 9
3×2 07.02.20 07.03.15 2 5 5 4 6 11.11
07.03.20 3 0 5 0 1 1 2 2
07.03.25 3 5 6 2 3 8 61.29
1×6 07.03.07 07.04.02 2 5 5 0 0 0
07.04.07 3 0 6 8 9 13.24
07.04.12 3 5 5 0 0 0
4×5 07.02.20 07.03.15 2 5 2 0 0 0
07.03.20 3 0 2 8 1 8 64.29
07.03.25 3 5 3 5 0 0
3×5 07.02.20 07.03.15 2 5 1 8 0 0
07.03.20 3 0 2 1 0 0
07.03.25 3 5 1 1 6 54.55
　　杂交组合中, 1: ‘山海关杨 ’; 2: 钻天杨; 3: ‘欧美杨 B’; 4: ‘欧美杨A’; 5: ‘群众杨 ’; 6: ‘欧美杨 C’。‘欧美杨 A、B、C’分别代
表欧美杨的 3 个人工杂交栽培种。
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代生活力不强, 表现出杂交亲和性差。虽然欧美杨
作为母本有相当的优势, 但其作为父本进行杂交还
有待进一步的试验和改良。另一对是以 ‘欧美杨
B’为母本, 分别以钻天杨和 ‘群众杨 ’为父本, 两
者的萌发率都在 35 d时达到最高, 且均在 50%以
上。‘欧美杨A’作为母本与 ‘群众杨 ’杂交, 胚抢
救的萌发率在 30 d时也达到 50%以上。这个结果
也再一次证明, 欧美杨作为母本亲和性较强。
(3)相同组合内部的遗传差异性。为了进一步
研究相同组合内部的遗传差异性, 比较 ‘山海关杨 ’
和钻天杨不同基因型的杂交组合授粉 30 d后胚珠
的萌发情况。如表 2所示, ‘山海关杨 ’有取自同
一地区的 3个基因型, 钻天杨有取自同一地区的 2
个基因型。其中, 萌发率最高的是 ‘山海关杨 2×
钻天杨 5’, 达到 80%, 萌发率最低的是 ‘山海关杨
3×钻天杨 4’组合, 只有 23.68%。由此可以看出,
即使是种内, 也存在差异。父母本的生长环境都相
似, 最大的差异可能主要来源于基因的差异和由此
基因控制的树种之间的亲和性的不同。
2 实施胚抢救与自然萌发的比较
对 ‘欧美杨 B×钻天杨 ’杂交组合授粉后 20 d
到 40 d实施胚抢救后的萌发情况与它的自然萌发
进行对比。由表 3可以明显看出胚抢救对于黑杨
育种的明显优势。随着水培时间的增加, 组培萌发
率也逐渐增加, 在 35 d的时候最多。理论上 40 d
应该更接近种子的成熟期, 但由于此时切枝水培时
间过长, 枝条提供给幼胚的营养不足, 实际上此时
很多蒴果已开始脱落或失水干瘪, 对胚造成一定的
损伤, 故萌发率再度降低。至自然成熟时, 所收集
到的种子种质较差, 播种后萌发率很低, 远远低于
胚抢救的萌发率, 从而显示出对黑杨进行胚抢救的
必要性和优势。
表 2 ‘山海关杨 ×钻天杨 ’不同基因型
授粉后 30 d胚珠萌发率
Table 2 Embryo germination rates of different gene
types of ‘P. deltoides cv. ‘Shanhaiguanensis’ ×
P. nigra var. Italica ’ 30 d after pollination
‘山海关杨 ’ 钻天杨 接种数 萌发数 萌发率 /%
1 4 4 2 2 4 57.14
2 5 1 0 8 8 0
2 4 2 4 1 1 45.83
3 4 3 8 9 23.68　　
　　1~3 代表 ‘ 山海关杨 ’ 的 3 个基因型; 4、5 代表钻天杨的 2
个基因型。
表 4 胚培苗的移栽成活率
Table 4 Surviving rate of plantlets generated from embryos after transplantation
炼苗日期 移苗日期 杂交组合 移苗数 /株 成活数 /株 存活率 /% 总移苗数 /株 总存活数 /株 总存活率 /%
08.03.29 08.04.06 1×2 2 1 7 33.33
1×5 6 0 0 3 3 9 27.27
3×4 6 2 33.33
08.04.25 08.05.02 3×4 2 0 1 9 9 5 2 0 1 9 9 5
08.05.01 08.05.08 1×2 2 0 1 9 9 5
1×5 1 0 7 7 0 4 0 3 5 87.5
3×4 1 0 9 9 0
　　杂交组合中, 1: ‘山海关杨 ’; 2: 钻天杨; 3: ‘欧美杨A’; 4: ‘群众杨 ’; 5: ‘欧美杨 C’。‘欧美杨A、C’分别代表欧美杨的 2个人工
杂交栽培种。
表 3 授粉后 ‘欧美杨B×钻天杨 ’胚珠不同发育期萌发率
Table 3 Different embryo germination rates of ‘P.
euramericana×P. nigra var. Italica’ after pollination
授粉后天数 萌发率 /%
20 0
25 11.11
30 2 2
35 61.29
40 9.66
自然成熟(45~50) 4.17
3 胚培苗的移栽成活
待胚培苗在培养基中的根系达到至少二回的
分生须根时进行炼苗和移栽试验的结果如表 4。
整个移栽过程都是经过1周的炼苗期后开展的, 一
共移栽3次, 3次胚培苗的移栽组合都是‘山海关杨×
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钻天杨 ’、‘ 山海关杨 ×欧美杨 C’、‘ 欧美杨 A×
群众杨 ’。第 1次是预试验, 一共移栽 12瓶 33株,
这次的成活率比较低, 平均 27.27%。到 4月下旬
时, 开展正式移栽试验, 后 2次的成活率分别达到
了 95%和 87.5%。
总之, 黑杨派切枝水培杂交育种得出的结论如
下: (1)在不同黑杨派树种的杂交组合进行不同胚抢
救时间比较时, 发现其最适宜的胚抢救时间范围为
30~35 d。(2)对已有 3支以上须根的胚培苗进行移
栽时, 保持温度 20~25 ℃, 湿度 70%左右, 3 d就可
成活, 一周即可完全适应外界环境。应用组织培养
方法进行黑杨胚抢救对育种研究和生产都有积极意
义, 不仅能够显著缩短生产周期, 而且可以通过扩
繁增加优良基因型植株的数量。
讨　　论
1 胚挽救的时间
荀守华等(2003)曾通过试验得出黑杨雌花从授
粉后 25 d起, 即可利用植物组织培养方法, 将杂种
胚珠接种在MS基本培养基上进行培养, 可获得杂
种实生苗的结果。授粉日期越长, 发育成熟度增
大, 胚珠萌发期越短, 萌发率越高, 其中授粉后30 d
为最佳组培时间。本文从黑杨授粉后 25 d起每隔
5 d进行一次胚抢救, 得出胚抢救的最佳时间范围为
30~35 d, 与荀守华等(2003)的试验结果大致相符。
从本试验的结果还可以看出萌发率并不是随着授粉
后时间的延长而逐渐提高, 而是在授粉后 30~35 d
达到最高后开始下降, 这与荀守华等(2003)的试验
结果不相符。胚培养最佳时期是影响胚抢救成功
的关键因素, 直接影响到胚培养成苗率的高低和胚
培苗的生长势。而从本试验结果可知不同黑杨杂
交组合的胚抢救最佳时期各不相同, 所以应对其各
自的最佳培养时期进行胚抢救。
2 亲和性对胚抢救萌发率的影响
荀守华等(2003)的研究表明不同杂交组合其杂
种胚珠组培萌发率有差异。‘美洲黑杨×美洲黑杨 ’
的杂交亲合力高于 ‘美洲黑杨×欧美杨 ’, 表现为前
者的杂种胚珠组培萌发率高, 后者的杂种胚珠部分
无生命力, 组培萌发率低。本文通过对父本相同,
母本不同的两对杂交组合以及母本相同, 父本不同
的两对杂交组合进行比较分析, 得出亲和性对杂种
胚珠组培萌发率有显著影响, 亲和力高的杂交组合
胚珠组培萌发率高, 所以亲和性也是影响胚抢救成
功的因素之一。从本试验结果可知欧美杨系列的
2个品种的亲和性普遍较好, 作为母本时胚珠组培
萌发率较高。本试验还进一步研究相同组合内部
的遗传差异性, 发现即使是种内, 亲和性也差异显
著, 不同基因型的父母本的生长环境相似, 然而相
互之间杂交后各胚珠组培萌发率差别很大, 由此可
见, 亲和性对胚抢救胚珠组培萌发率的影响很大。
3 培养基对胚抢救的影响
在果树胚抢救育种中, 培养基是胚抢救的重要
环节, 不同发育时期、不同品种的果树需要的培养
基各不相同。桃属、李属等核果类果树使用较多
的为Monnie、UP、C2d、SH、MS和White培
养基(Pinto等1994; Kantharajah等1992); 适合硬核
期杏胚发育的培养基为 Tukey培养基(陈学森等
1996); 枣的胚抢救多采用MS培养基(祁业凤和刘
盂军 2004; 杜学梅等 2005)。本文采用胚抢救组培
苗的茎段继代培养时在 1/2MS培养基中相应配入
0.2 mg·L-1的 IBA。实验发现, 应用 IBA为生根激
素, 对 ‘欧美杨B×钻天杨 ’的杂交组合有较好的扩
繁效果, 平均 20 d即可生根长成 3 cm以上的正常
植株, 而对 ‘山海关杨 ’的杂交组合则生根速度较
慢, 生根时间以 1个月到 3个月不等, 且须根较少。
由此可以看出黑杨派内差异较显著, 且培养基配方
不能通用, 同样应根据各自特性选择合适的培养
基。
4 不同杂交组合对移栽成活率的影响
本文中3次移栽的胚培苗都是 ‘山海关杨×钻
天杨 ’、‘山海关杨 ×欧美杨 C’和 ‘欧美杨A×群
众杨 ’这 3个杂交组合, 移栽是根据胚培苗在培养
基中的根系是否已达到移栽要求, 即至少二回的分
生须根, 并不是通过人工选取出的。由此可见这 3
个组合的杂交苗生长较快较好, 且对环境适应性较
强。据此认为, 不同杂交组合对胚培苗的移栽成活
率有一定的影响。
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