全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (12): 1277~1285 1277
收稿 2013-07-15　　修定 2013-09-18
资助 高校博士点专项基金(20113702110008)、作物生物学国家
重点实验室开放基金(2011KF03)和西北农林科技大学国
际合作交流项目(A213021202)。
* 通讯作者 (E-mail : gaohy@sdau.edu.cn; Tel : 0538-
8245985)。
叶绿素延迟荧光的发生及其在光合作用研究中的应用
杨程1, 李鹏民2, 张子山1, Vasilij Goltsev3, 高辉远1,*
1山东农业大学, 作物生物学国家重点实验室, 山东省作物生物学重点实验室, 山东泰安271018; 2西北农林科技大学, 旱区作
物逆境生物学国家重点实验室, 陕西杨凌712100; 3Department of Biophysics and Radiobiology, Faculty of Biology, St. Kliment
Ohridski University of Sofia, 8, Dragan Tzankov Boulevard, 1164 Sofia, Bulgaria
摘要: 叶绿素延迟荧光主要由绿色植物中光系统II的天线色素产生, 光系统II反应中心色素P680接受天线色素吸收的光能后
转变为激发态的P680
*, P680
*回到基态时释放出一个电子传给原初电子受体, 随后电子沿光合电子传递链向PSI传递。当进入
电子传递链的电子发生电荷重组时会使P680再次激发形成P680
*, P680
*将激发能传递给天线色素后, 激发能以荧光的形式释放
出来, 即为延迟荧光。延迟荧光的检测和分析技术为无损测定植物光合机构的结构与功能变化提供了新的方法。利用该
方法可以获得丰富的光合机构信息, 如光系统II受体侧及供体侧的伤害程度、跨类囊体膜质子梯度的大小等。本文介绍了
延迟荧光的产生原理和测定方法, 并且举例说明了延迟荧光测定技术在光合作用研究中的应用。
关键词: 延迟荧光; 瞬时荧光; 光合机构; PSII; 电荷重组
Arising of Chlorophyll Delayed Fluorescence and Its Application in Photosyn-
thesis Research
YANG Cheng1, LI Peng-Min2, ZHANG Zi-Shan1, Vasilij Goltsev3, GAO Hui-Yuan1,*
1Shandong Key Laboratory of Crop Biology, State Key Laboratory of Crop Biology, Shandong Agricultural university, Tai’an,
Shandong 271018, China; 2State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Northwest A&F University, Yangling,
Shaanxi 712100, China; 3Department of Biophysics and Radiobiology, Faculty of Biology, St. Kliment Ohridski University of
Sofia, 8, Dragan Tzankov Boulevard, 1164 Sofia, Bulgaria
Abstract: Chlorophyll delayed fluorescence is predominantly emitted from antenna chlorophyll of photosystem II
(PSII) in green plants. It is emitted from repopulated excited chlorophylls as a result of recombination of the
charge pairs in electron transport chain. Detection and analysis of delayed fluorescence provides a new approach
to measure the change of structure and function of photosynthetic apparatus. Abundant information can be got
from delayed fluorescence, such as the damage extent of either donor or acceptor side of PSII and the change of
the proton gradient across thylakoid membrane. In this paper, the emission mechanism and detecting method of
delayed fluorescence were introduced, and illustrations of its use in photosynthesis research were also given.
Key words: delayed fluorescence; prompt fluorescence; photosynthetic apparatus; PSII; charge recombination.
光合作用是存在于植物与光合细菌中最重要
的生理生化过程。通过光合作用, 植物将吸收的
光能转化为稳定的化学能, 为植物生命活动提供
能量。植物叶绿素吸收的光能除了用于光化学反
应和热耗散外 , 还有一小部分以荧光的形式释
放。叶绿素荧光主要由光系统II (PSII)的天线激发
产生。在叶绿素的激发能用于原初光化学反应之
前产生的荧光, 寿命很短, 在停止照光后只能持续
1 ns, 称为瞬时荧光(Goltsev等2009)。尽管光合作
用电子传递效率非常高, 在光合机构中进行的光
化学反应过程仍然是可逆的。当光化学反应分离
的电荷在PSII反应中心发生重组时, 会使P680再次
激发形成P680
*, P680
*将激发能传递给天线色素后, 激
发能以荧光的形式释放出来, 产生的荧光在停止
照光后依然能够延续相当长一段时间, 弛豫时间
从几纳秒到几十秒甚至更长时间, 这种荧光称为
特约综述 Invited Review
植物生理学报1278
延迟荧光(Goltsev等2009)。
Strehler和Arnold (1951)最早发现了延迟荧光
现象。他们在用荧光法测定小球藻中光诱导的
ATP的积累时观察到, 即使在不添加荧光素酶和荧
光素的情况下, 停止照光后藻类细胞也有长寿命
的荧光发出。随后, 这种现象也分别在叶片(Stre-
hler和Arnold 1951)、叶绿体和光合细菌(Arnold和
Thompson 1956)等不同材料中被发现。由于受延
迟荧光检测技术的限制, 以及对延迟荧光解读困
难, 延迟荧光在光合作用研究中的应用远不如瞬
时荧光普及。但是, 延迟荧光蕴含着大量的关于
光合作用过程的信息, 且对环境胁迫的响应比瞬
时荧光更敏感(Bjorn和Forsberg 1979), 因此, 半个
世纪以来, 延迟荧光的检测和分析始终吸引着很
多学者的关注。
目前, 对于延迟荧光的原理及其应用的研究
多集中在生物物理学研究领域, 而在植物生理学
研究领域中的应用还非常有限。虽有一些学者对
延迟荧光和光合作用的关系进行了探讨, 但是它
们之间的相互关系仍未被完全揭示(Lavorel 1975;
Amesz和Van Gorkom 1978; Malkin 1979; Tyystjarvi
和Vass 2004)。本文将结合国内外学者近些年来的
研究成果和我们研究室的应用经验, 从延迟荧光
的产生原理、测定方法及延迟荧光在光合作用研
究中的应用等方面进行简要介绍, 为延迟荧光在
植物科学研究中的应用提供参考。
1 延迟荧光产生的原理
延迟荧光的产生主要由PSII电子传递过程中
的氧化还原反应决定。如图1所示, 当 PSII将天线
吸收的光能和转化的电能从1→5传递时, PSII反应
中心(P680)激发后产生的电子能够进入原初电子受
体和次级电子受体并最终形成稳定的化学能(ATP
和NADPH), 这是光合电子传递的主要方向。然
而, 任何氧化还原反应都是可逆的。在电子进行
正向传递的同时, 还会有一小部分电子进行逆向
传递。当电子逆向传递到P680
+ 时, 会使P680再次被
激发成 P680
*, 部分P680
*将激发能传给天线色素后,
天线色素将激发能以荧光的形式释放, 从而产生
延迟荧光。
研究表明, 与延迟荧光产生相关的电子传递
体主要有以下几种: (1)位于P680供体侧的放氧复合
体和YZ (Z), 放氧复合体包括S0~S4 5种不同的氧化
状态, Z是D1蛋白第161位酪氨酸残基, 是P680的原
初电子供体; (2) P680, P680接受天线色素吸收的能量
后被激发, 形成P680
*, P680
*极不稳定, 回到基态后释
放出一个电子传给原初电子受体, 从而将光能转
变为化学能 ; (3)位于P 680受体侧的去镁叶绿素
(Pheo)、QA、QB、PQ、P700等, Pheo作为P680的原
初电子受体, 直接接受P680
*给出的电子, 电子依次
经过QA、QB和PQ等向PSI传递。在电子传递的不
同阶段, 上述电子传递体会形成不同的基团, 例如
Z+P680PheoQA
–QB和Z
+P680PheoQA
–QB
2–。延迟荧光就
是由一些特定状态的基团发生电荷重组产生的。
发生电荷重组的基团不同, 产生的延迟荧光的寿
命以及强度也不同。大多数情况下, 延迟荧光的
信号是由多种不同特征的延迟荧光组分构成, 而
不同组分延迟荧光的寿命则由相应基团的存在时
间决定。
在光合电子传递过程中, 电子传递的越远, 逆
向返回到P680的概率就越低, 产生的延迟荧光的强
度也越低。在停止照光后, 随着时间的延续, 能够
重组的电荷逐渐减少, 延迟荧光强度也会逐渐降
低。因此, 照光后在黑暗中能够观察到延迟荧光
的衰减。延迟荧光的衰减过程主要由三个生理过
程决定: (1)产生延迟荧光的基团如P680
+Pheo–失去
正电荷或者负电荷导致的该基团的减少, 而QA对
图1 光系统II延迟荧光产生的示意图
Fig.1 Scheme of reactions in PSII leading to delayed fluorescence (DF) emission
杨程等: 叶绿素延迟荧光的发生及其在光合作用研究中的应用 1279
Pheo–的再氧化或电子供体Z对P680
+的再还原都会
导致这种结果的发生。这种延迟荧光的衰减方式
称为“电荷渗漏(leakage)”, 微秒级(1~100 µs)和亚
毫秒级(100~1 000 µs)延迟荧光的衰减都属于这个
类型。(2)延迟荧光基团内发生的氧化还原反应,
如P680
+Pheo–基团中Pheo–对P680
+的还原, 该过程导
致的延迟荧光的衰减被称为去激作用(deactiva-
tion) (Lavorel 1975)。而当PSII的正向电子传递不
能进行(如PQ库被完全还原)时, 这种方式导致延迟
荧光的衰减起主导作用。大部分慢组分延迟荧光
(>1 s)的衰减都属于这个类型。(3)速率常数是化
学动力学的一个重要的物理常量, 其数值直接反
映反应速率的快慢, 当电荷重组的速率常数发生
改变时也会导致延迟荧光衰减发生变化, 这通常
与黑暗中类囊体跨膜电位的衰减有关(Goltsev等
2009)。
2 延迟荧光的测定
延迟荧光与瞬时荧光具有相同的光谱特征
(Strehler和Arnold 1951; Hideg等1991), 而强度与瞬
时荧光相比又非常弱, 因此无法通过波长来区分
延迟荧光与瞬时荧光。但是瞬时荧光在关光后很
快弛豫, 延迟荧光关光后弛豫较慢, 所以可以通过
衰减时间的不同来区分二者。目前延迟荧光的测
定主要有两种方式: (1)充分暗适应的叶片在照光
一段时间后关光, 记录关光后较长一段时间内荧
光的变化, 即延迟荧光的衰减过程。通过这种方
式可以获得较多的延迟荧光组分信息; (2)对完全
暗适应的叶片照光, 在照光过程中不断给予短暂
的黑暗间隔, 记录黑暗间隔时期的荧光信号, 从而
获得延迟荧光的诱导动力学曲线。这种方法的优
点是可以分析光-暗转换过程中光合电子传递链上
每个载体以及类囊体膜能级的变化, 同时还可以
在照光过程中记录瞬时荧光, 从而实现两种荧光
的结合应用。缺点是由于要测定延迟荧光的诱导
过程, 所以黑暗周期往往较短, 只能得到较少的延
迟荧光组分的信息。
Strehler 和Arnold 于1951年发明了第一台能
够测定延迟荧光的仪器(Strehler和Arnold 1951)。
之后随着延迟荧光研究的深入, 世界多个国家的
研究机构及学者都组建了相应的延迟荧光测定装
置, 并且不断改进沿用至今, 其功能和构造都有很
大的不同(Kalaji等2012)。而商品化的延迟荧光测
定仪器目前主要有两种, 英国Hansatech公司生产
的M-PEA系列多功能植物效率仪和俄罗斯TEST
公司生产的Becquerel-type FL-2006 磷光计。
3 延迟荧光的衰减曲线
对植物叶片或者藻类进行一次闪光或者持续
一段时间照光后, 关闭光源并同时开始记录延迟
荧光的信号, 会得到一条由强逐渐减弱的曲线, 即
为延迟荧光的衰减曲线(图2)。延迟荧光的衰减曲
线是关光后所有延迟荧光组分衰减过程的叠加,
这些组分的寿命从几纳秒到几十秒不等。
P680
+Pheo-电荷重组产生的延迟荧光寿命最短,
仅有2~4 ns (Shuvalov和Klimov 1976; Jursinic
1986), 很难直接与瞬时荧光进行区分(Schatz等
1988; Christen等2000), 只有通过适当的化学处理
去除光系统中能与P680
+Pheo-进行能量交换的其他
部分之后才能测定(Shuvalov和Klimov 1976)。纳
秒时间范围内延迟荧光的衰减反映了Z对P680
+的还
原(Christen等2000)。研究表明, 在离体类囊体膜
中, 此部分延迟荧光的衰减过程由3个呈指数衰减
的延迟荧光组分组成, 寿命分别为50 ns、300 ns和
1.5 µs, 而后两种组分随着饱和脉冲光的激发次数
以4为周期波动, 与光下放氧复合体从S0到S4状态
的变化过程相对应, 表明它们与P680的供体侧的状
图2 烟草叶片在3 000 µmol·m-2·s-1红光照射5 min后, 在黑暗
中用M-PEA (Hansatech, 英国)记录的延迟荧光衰减曲线。
Fig.2 The decay curve of delayed fluorescence in tobacco
leaves was registered in the dark by a M-PEA (Hansatech,
UK) after illuminated 5 min with 3 000 µmol·m-2·s-1.
植物生理学报1280
态有关(Christen等2000)。　
照光10 µs后, 约80%的PSII处于Z+QA
–状态
(Jeans等2002), 一直到毫秒时间范围内, 大部分的
延迟荧光都是Z+和QA
–重组产生的(Van Gorkom和
Donze 1973; Jursinic 1986)。Grabolle 和Dau (2005)
发现, 在暗适应的PSII颗粒中, 延迟荧光的衰减对
于饱和闪光的照射次数具有强烈的依赖性。Buchta
等(2007)的研究证明, 这种延迟荧光由四种组分构
成, 其中三种较快组分的寿命分别为14 µs、65 µs
和203 µs, 反映了放氧复合体从S1到S4的转化过程,
另一种较慢组分的寿命在毫秒范围, 反映的是S4到
S0的转化过程。因此, Buchta等(2007)认为延迟荧
光在微秒时间范围内的衰减主要受P680供体侧的影
响。此外, 还有研究表明, 延迟荧光中的亚毫秒
(120~200 µs)组分主要由基团Z+P680QA
–QB产生, 它
的衰减是由电子的正向传递即QB对QA
–的氧化导
致(Lazar 1999)。
在稳定的光照下(长时间的光—暗循环后),
第一个毫秒级延迟荧光组分寿命约为1~3.5 ms
(Zaharieva和Goltsev 2003; Goltsev等2005), 主要由
基团Z+P680QA
–QB
–发生电荷重组产生。Goltsev等
(1980)和Buchta等(2007)发现, 在饱和脉冲光的照
射下该基团对放氧复合体的状态具有强烈的依赖
性。在多次光—暗循环后, 放氧复合体处于S3状态
时的基团产生的延迟荧光强度比处于S2状态时的
延迟荧光高出一个数量级, 比处于S1状态时的延迟
荧光高三个数量级(Buchta等2007)。因此, 当处于
不同S状态的放氧复合体与相关发光基团随机分
布时, 延迟荧光主要由S3状态的基团产生。毫秒级
延迟荧光的衰减也属于“电荷渗漏”型, P680供体侧
O2的产生和S3状态的消失以及P680受体侧氧化态的
PQ对QB
2–的氧化都影响着延迟荧光的衰减。在离
体类囊体膜中, 毫秒级延迟荧光的强度随着跨膜
电势的增加呈指数上升(Jursinic等1978; Venediktov
等1980), 这是由于当跨膜质子梯度存在时, 跨膜电
位促进电子从QA
-到Pheo+和P680+的逆向传递, 此
时, 毫秒级延迟荧光的强度与类囊体膜跨膜电势
的大小密切相关(Fleishman 1971; Venediktov等
1980)。当PSII受体侧电子传递受到抑制, 例如用
DCMU进行处理后, 由于QA到QB的电子传递受到
抑制, 微秒级延迟荧光和毫秒级延迟荧光都会受
到严重的抑制(Wraight和Crofts 1971; Zankel 1971;
Guo和Tan 2009)。
当PSII处于完全还原状态SiZP680Pheo QA
–QB
2–
且PQ库被完全还原时, 产生的延迟荧光寿命较长,
约为1~22 s (Robinson和Crofts 1983), 它的衰减与
QA
–或者QB
2–与PSII供体侧放氧复合体(S2或者S3状
态)的电荷重组有关。
4 延迟荧光的诱导曲线
充分暗适应的叶片通过周期性的照光, 并在
连续的光-暗转变中的黑暗阶段记录延迟荧光的衰
减信号, 然后将每次关光后相同时间段测得的信
号强度连接起来就得到了延迟荧光的诱导曲线。
延迟荧光诱导曲线中所有凸出的峰点用I表示, 凹
陷的谷点用D表示。理论上每两个峰之间都存在
一个谷点, 因此这些位点按照出现的顺序依次命
名为I1、D1、I2、D2……(Goltsev等2009)。
如图3所示, 延迟荧光诱导曲线可以分为快相
和慢相两个阶段, 前者持续约200 ms, 后者持续几
分钟(Itoh等1971; Itoh和Murata1973; Malkin和Bar-
ber 1978)。延迟荧光的快相从产生开始经过约7
ms到达I1、100 ms到达I2, 然后下降到一个较低强
度D2, 之后会有一个小幅度的上升, 大约在1 s位置
上升到I3 (Goltsev等2003)。延迟荧光慢相从I3开始
经过三次短暂的上升即I4、I5和I6之后最终下降到
一个稳定的水平S (Itoh和Murata 1973; Goltsev等
2003)。
一般情况下, 延迟荧光的快相包括I1和I2两个
峰值。I1的出现与两个过程相关, 即相应的产生延
迟荧光快组分的基团的积累和PSI氧化导致的类囊
体膜跨膜电势的积累(Pospisil和Dau 2002; Goltsev
等2009)。I2出现在PQ完全还原之前, 与QB向PQ传
递电子导致的PSII反应中心的持续开放有关。在
有铁氰化钾(人工电子受体, 能够接受PSII传递的
电子)和解偶联剂(能够消除跨类囊体膜的质子梯
度从而加速电子传递的进行)共同存在时观察不到
I2-D2的荧光的下降, 表明I1-I2-D2与PQ的还原有关
(Goltsev等2009)。D2出现的时间可以反映PSII对
PQ库的还原能力也就是PSII的活性, 即D2出现的
越早, PSII的活性越强。I3只在少数情况下会明显
出现在延迟荧光快相的末尾, 大约1s位置(Zahari-
eva和Goltsev 2003), 但是对于它产生的原因至今
杨程等: 叶绿素延迟荧光的发生及其在光合作用研究中的应用 1281
还未确定。D2-I4的上升伴随着照光后PSI的活化,
上升的幅度与跨类囊体膜质子梯度的形成有关,
上升程度越大表明跨类囊体膜质子梯度越大
(Wraight和Crofts 1971; Evans和 Crofts 1973)。Za-
harieva等(2001)认为I5和I6的出现可能与ATP和
NADPH的积累以及卡尔文循环的启动有关。
然而, 需要注意的是, 测量光强不同, 得到的
诱导曲线也明显不同。例如600 μmol·m-2·s-1测量光
条件下检测的延迟荧光与3 000 μmol·m-2·s-1光下检
测的结果相比, 随着时间的延长, 延迟荧光有明显
的改变, 在3 000 μmol·m-2·s-1光下测定时, I4并不明
显, 而在600 μmol·m-2·s-1光下测定时, I4较为明显,
通常不能明显观察到I3 (图3-A、B)。此外, 由于延
迟荧光诱导过程中荧光强度的变化与很多生理过
程紧密相关, 如跨类囊体膜电势和质子梯度的大小
(Wraight和Crofts 1971)、电子受体(Ruby 1976)、
电子供体(Mar等1975)及放氧复合体的状态(Zankel
1971; Van Gorkom和Donze 1973)等, 因此, 测定条
件及材料不同都会导致延迟荧光诱导曲线形状的
差异。
5 延迟荧光在光合作用研究中的应用
植物本身的生理变化如衰老或逆境胁迫等都
能够直接或间接地影响其光合机构的功能(Zhang
等2012)。通过分析延迟荧光衰减曲线或诱导曲线
能够获得大量的光合机构的信息, 如植物的光合
能力、跨类囊体膜电势及质子梯度的建立(Wraight
和Crofts 1971)、PSII供体侧(Mar等1975)、受体侧
(Ruby 1976)以及放氧复合体的状态(Zankel 1971;
Van Gorkom和Donze 1973)等, 从而使我们能够进
一步了解逆境胁迫对光合作用过程以及光合电子
传递链的影响。
延迟荧光和瞬时荧光都具有快速高效和无损
伤测定等特点, 而且都能够反映光合电子传递链
的状态。但是, 两者存在本质上的差异。瞬时荧
光是通过检测不同时间QA
–的积累所导致的荧光变
化来反映光合机构状态的改变, 而延迟荧光则是
直接检测不同状态的PSII基团发生电荷重组产生
的荧光, 由于不同特征延迟荧光代表不同的PSII复
合体状态, 因此它能更加直接的反映PSII的状态,
获得的信息也更丰富。
图3 烟草叶片暗适应30 min后, 用M-PEA (Hansatech, 英国)同时测定叶片的快速荧光(PF)和延迟荧光(DF), 获得快速荧光和
延迟荧光的诱导动力学曲线
Fig.3 Prompt fluorescence (PF) and delayed fluorescence (DF) were measured simultaneously by an M-PEA (Hansatech, UK) in
tobacco leaves after dark adaptation for 30 min.
A: 测定光强为3 000 μmol (photons)·m-2·s-1; B: 测定光强600 μmol (photons)·m-2·s-1。
植物生理学报1282
5.1 分析光合电子传递链的状态
延迟荧光诱导曲线中I1-I2-D2的变化伴随着PQ
逐渐还原导致的反应中心的关闭。如果用电子经
过PQ的速率来衡量PSII与PSI之间电子传递的活
性, 则该过程主要由两个因素即PSII捕获的电子传
递到PQ的速率和PQH2的电子传递到PSI的速率决
定。PQ的氧化与还原速率的改变会导致延迟荧光
诱导过程中I2的相对变化。因此I2/I1常用来反映两
个光系统间电子传递的活性。Goltsev等(2012)在
研究大豆叶片的脱水过程时发现, 在叶片相对含
水量从100%下降到60%的过程中, I2/I1随着大豆叶
片的相对含水量的降低而逐渐降低, 反映了PSII向
PSI电子传递的抑制程度逐渐增加。
5.2 分析类囊体膜跨膜质子梯度的变化
叶绿体中跨类囊体膜质子梯度的建立具有重
要的生理功能, 不仅为叶绿体内ATP合成提供动
力, 而且能够诱导依赖叶黄素循环的热耗散的形
成(Livingston等2010; 姜闯道等2000)。因此, 跨类
囊体膜质子梯度的测定对光合作用的研究具有重
要意义。目前检测跨类囊体膜质子梯度的方法主
要有两种, 一种是荧光探针法; 另一种为延迟荧光
法。荧光探针法需要使用离体的类囊体, 操作较
为复杂, 不适宜于批量测定, 而延迟荧光法不仅快
捷高效而且对植物材料没有破坏。
早在上世纪70年代, Wraight和Croft (1971)在
研究叶绿体光合磷酸化与类囊体膜高能态的关系
时发现, 当只用尼日利亚菌素处理消除跨膜质子
梯度但不破坏膜电位时, 毫秒级延迟荧光慢相阶
段被抑制而快相阶段不受影响; 只用缬氨霉素破
坏膜电位时, 只有毫秒级延迟荧光的快相阶段受
到抑制而慢相部分不受影响, 从而证明毫秒级延
迟荧光的快相阶段与膜电位有关, 而慢相阶段和
跨类囊体膜质子梯度有关。至此以后, 人们长期
使用毫秒级延迟荧光的强度作为膜电位以及跨膜
质子梯度的衡量指标。Zhang等(2012)近期发现,
当用水杨基氧肟酸(SHAM)抑制Rumex K-1叶片的
交替氧化酶呼吸途径(AOX)后, 叶片的毫秒级延迟
荧光强度(2.8~4 ms)显著下降, NPQ快组分qE被抑
制, 证明了AOX通过促进跨膜质子梯度的建立从
而上调qE。Wang等(2006)通过分析高温强光胁迫
下烟草NAD(P)H脱氢酶突变体的延迟荧光诱导动
力学曲线, 发现突变体植株的2.8~3.8 ms延迟荧光
明显下降, 同时qE受到严重抑制, 证明了突变体跨
膜质子梯度的下降抑制了NPQ快组分qE的形成。
此外, Wraight和Crofts (1971)发现延迟荧光诱
导动力学中I4的形成与跨膜质子梯度的形成具有
密切关系, 因为跨膜质子梯度的建立需要PSI的活
化, 而I4出现的时间也与PSI活化的时间有关。因
此, I4的相对变化也可以用来反映叶绿体跨类囊体
膜质子梯度。Pooja等(2011)在研究小麦盐胁迫下
的生理变化时, 发现随着NaCl浓度的增加延迟荧
光的(I4-D2)/D2逐渐下降, 证明了盐胁迫显著抑制了
小麦跨类囊体膜质子梯度的建立, 并且随着盐浓
度的升高, 抑制程度逐渐增大。Zaharieva等(2001)
发现拟南芥膜脂去氧化基因缺失株系与野生型的
I4/D2都在15~20 °C达到最大, 而且突变体与野生型
相比没有显著差异, 证明膜脂去氧化基因并不影
响跨类囊体膜质子梯度的建立。
5.3 延迟荧光与瞬时荧光以及820 nm光反射的结
合应用
植物材料对820 nm光反射的变化能够反映叶
绿体PSI 反应中心色素P700及质体蓝素(PC)的氧化
还原状态(Strasser等2010)。延迟荧光不仅可以独
立用于植物生理学的研究, 而且可以与瞬时荧光
以及820 nm光反射同步测定(图4), 三者互相补充,
互相印证, 从而更准确地反映植物光合机构的变
化。I1对应于瞬时荧光中J-I的上升阶段, 820 nm光
反射的下降阶段。在这个过程中PSII向受体侧的
电子传递导致QA
–QB
–和QA
–QB
2–逐渐积累, PQ库也
开始还原, 而P700和PC由于还未接受PSII传来的电
子因此处于快速氧化阶段。I2对应于瞬时荧光的
I-P段, 820 nm光反射的上升阶段, 此时, P700和PC由
于接受PQ侧传来的电子而逐渐还原, PQ受体侧的
还原进一步促进PQ的还原, 从而加速了PSII反应
中心的关闭。在瞬时荧光的P点, 反应中心完全关
闭, 电子传递链完全还原, 延迟荧光降到最低点D2,
P700和PC也处于最大还原状态。
Strasser等(2010)的研究发现, 当巴尔干苣苔
的相对含水量从100%下降到40%的过程中, 瞬时
荧光强度及Fv/Fm都逐渐下降, 延迟荧光的I1和I2逐
渐降低, 820 nm光反射的氧化阶段不受影响而还
原阶段受到抑制, 表明脱水过程中巴尔干苣苔PSII
杨程等: 叶绿素延迟荧光的发生及其在光合作用研究中的应用 1283
逐渐失活且PSII和PSI的解偶联程度增加。张菂等
(2013)利用瞬时荧光、延迟荧光和820 nm光反射
同步测量技术, 研究了干旱对平邑甜茶叶片光合
机构的伤害 , 发现在严重干旱胁迫下 , 微秒级
(20~40 μs)和亚毫秒级(100~300 μs)延迟荧光的I1都
降低, 而将延迟荧光曲线标准化后发现, 微秒级延
迟荧光的I2相对升高而亚毫秒级延迟荧光的I2却相
对降低, 这表明, 严重干旱胁迫下, 平邑甜茶叶片
光合机构从PSII到PSI的光合电子传递能力逐渐下
降。同步测量的瞬时荧光和820 nm光反射的结果
也都证明了上述结论。
5.4 延迟荧光在其它方面的应用
Wang等(2005)在研究模拟酸雨以及SO2处理
对紫荆花和栽培大豆延迟荧光的影响时发现, 延
迟荧光的强度与叶绿体的完整程度呈线性关系,
提出延迟荧光可以用来反映叶绿体的完整程度并
能够作为评估环境污染对生态系统影响的指标。
Maja等(2008)在研究不同营养状态下的单细胞海
洋藻类时发现, 通过计算两种光照(<600 nm和>650
nm)诱导下的延迟荧光衰减曲线的比值可以得到
一条新的曲线, 这条曲线的峰值的变化可以用来
区分不同营养状态下的藻类。王俊生等(2007)对
不同衰减时间内的延迟荧光进行积分后和光合速
率进行相关性分析发现, 玉米和紫薇的光合速率
与延迟荧光的强度呈显著相关, 因此, 他们提出可
以用延迟荧光的强度来反映植物的光合速率。
6 延迟荧光的研究展望
延迟荧光理论的发展以及测定技术的逐渐完
善为其在植物生理研究中的广泛应用奠定了基础,
并且丰富了无损监测植物光合机构功能的手段。
然而, 关于延迟荧光诱导曲线中蕴含的丰富信息
还尚未被充分开发和利用。这主要是因为光合作
用是由多个化学反应共同完成, 是一个复杂的生
理过程, 延迟荧光的产生不是由单一反应决定的,
而是受多个反应共同影响的结果; 其次, 延迟荧光
在波长上和瞬时荧光相重叠, 而在强度上是瞬时
荧光的百分之一甚至更低 , 因此检测比较困难
(Goltsev等2009); 再次, 以前对于延迟荧光的测定
多是不同研究室利用自制或组装的仪器完成, 而
不同研究室间测定仪器的差异阻碍了不同研究者
之间研究信息的交流。目前, 随着延迟荧光检测
技术的不断完善和测定仪器的商品化, 上述问题
将会逐渐被解决, 延迟荧光在植物科学研究中将
扮演更加重要的角色。
未来应该强化延迟荧光在以下几个方面的研
究和应用: (1)更多地发掘延迟荧光信息与植物体
内生理生化过程的关系, 从而扩大延迟荧光在植
物科学研究中的应用范围; (2)研究逆境胁迫对植
物延迟荧光信号影响, 筛选出能够准确、快捷判
断环境对植物伤害的延迟荧光指标; (3)加强延迟
荧光与作物光合功能之间联系的研究, 促进延迟
荧光在作物品种的选育以及农业生产中的应用。
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图4 烟草叶片暗适应30 min后, 用M-PEA (Hansatech, 英国)
同时测定叶片的瞬时荧光(PF)、延迟荧光(DF)和820 nm光
反射(MR)
Fig.4 Prompt fluorescence (PF), delayed fluorescence (DF)
and modulated 820 nm reflection (MR) were measured simul-
taneously by a M-PEA (Hansatech, UK) in tobacco leaves
after dark adaptation for 30 min
测定光强为3 000 μmol (photons)·m-2·s-1。
植物生理学报1284
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