全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (4): 409~414 409
收稿 2011-01-10　　修定 2011-02-17
资助 广西高等学校优秀人才资助计划项目(桂教人201065)、广
西大学博士后启动基金(20090042)、广西自然科学基金
(2011GXNSFA018115)和广西教育厅研究生创新计划项目
(105931001011)。
* 通讯作者(E-mail: honest66222@163.com; Tel: 0771-
3270184)。
一种高效获取基因5′末端的RACE方法
罗聪1, 何新华1,2,*, 陈虎1, 韦泳丽1, 李明娟1
1广西大学农学院, 南宁530004; 2广西作物遗传改良与生物技术重点实验室, 南宁530007
摘要: RACE技术是一种快速高效克隆基因5′末端和3′末端的方法, 是获取基因全长的主要手段之一, 但是RACE技术本身
也存在一些缺点。我们在前人改良的RACE技术基础上进一步优化RACE技术, 获得了一种操作简单、快速、高效、成本
低廉的改良RACE方法, 该方法适合于大量基因5′末端的获取, 可以在普通实验室推广应用。
关键词: RACE; TdT; 方法改良
A High-Efficient Method of RACE Technique for Obtaining the Gene 5′ End
LUO Cong1, HE Xin-Hua1,2,*, CHEN Hu1, WEI Yong-Li1, LI Ming-Juan1
1College of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotech-
nology Lab, Nanning 530007, China
Abstract: RACE technique is a rapid and effective method for cloning gene 5′ end and 3′ end, and one of main
methods to obtain full-length genes. However, RACE technique has its own shortcomings. We further improved
the previous RACE protocols and obtained a modified RACE technique which is simple, rapid, high-efficient
and low-cost. Our modified RACE technique is suitable for obtaining large number of genes 5′ end and can be
used in ordinary laboratories.
Key words: RACE; TdT; modified method
RACE (rapid amplification of cDNA ends)技术
是获得基因全长的有效方法, 广泛应用于全长基
因的克隆。在RACE技术中, 获得基因3′端比较容
易, 而获得基因5′末端则比较困难。基因5′末端的
获得, 需要购买5′RACE试剂盒, 但不同公司研发的
5′RACE试剂盒原理不尽相同, 而且购买试剂盒非常
昂贵(段静波等2008)。为了有效快速获得基因的5′
末端, 我们在前人改良的RACE技术基础上(唐慧
等2001; 李关荣等2003; 邓雪柯等2007; 夏瑞等
2008), 进一步优化基于TdT加尾的5′RACE技术, 简
化操作步骤, 获得了一种高效获取基因5′末端的方
法。目前本课题组应用该方法已经成功获得了芒
果几十个不同基因的5′末端序列, 证明了该方法的
高效性和实用性。
材料与方法
1 材料
采集广西大学农学院标本园中8年生的芒果品
种‘四季芒’ (Mangifera indica L. cv. ‘Chok Anand’)的
果实、叶片、花、茎段, 置于-40 ℃冰箱保存备用。
PrimeScript逆转录酶、TdT、RNase H和
pMD18-T vector为宝生物工程(大连)有限公司产品;
琼脂糖凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、
dCTP和dNTP购自上海生工生物工程技术服务有
限公司, 引物委托上海生工生物工程技术服务有限
公司合成; Dream Taq酶购于Fermentas公司; 感受态
为DH5α菌株, 购自北京全式金生物技术有限公司。
2 方法与步骤
逆转录引物为AUP1: GGCCACGCGTCGAC-
TAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT; 锚定引物AP
长: AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCG-
GGGGGGGGG, 通用上游接头引物AP短: AAG-
CAGTGGTATCAACGCAGAGT; UDP木糖合成酶
基因特异引物为5UDPd1: GAAAATCTGACCATT-
AGCCCTTG, 5UDPd2: AACATCAATCGTTG-
GCACCTCC; 甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH基因
植物生理学报410
的特异引物为5MGApd1: TTGCTGATAATG-
GGCTCATCCG, 5MGApd2: AGCATCAAGTAGC-
CTCTGGTC; CDK钙结合蛋白基因特异引物为
5CDPKd0: TTGTTGGGCAGTAAGCCGTTTCCT,
5CDPKd1: TCCTTATCTACATCACCAGCATCCA,
5CDPKd2: GGCTTCTCTTAGTTCCTCAATCTCT;
所有引物均采用Primer5.0软件设计。
参照肖洁凝等(2003)的方法并进行改良, 用改
良的SDS法提取‘四季芒’果实、老叶、嫩叶、
花、老茎和嫩茎的混合RNA, 利用紫外分光光度
计和电泳检测其浓度和完整性。
以1 μg总RNA为模版, 选用PrimeScript逆转录
酶, 以逆转录通用引物AUP1为引物, 按照Prime-
Script逆转录酶的使用说明书进行逆转录合成
cDNA第1链, 同时逆转录6管, 每管体系为20 μL。
逆转录完后, 用RNase H进行处理, 75 μL反应体系
为: 逆转录产物20 μL、5×Hybrid RNA Degenera-
tion Buffer 15 μL、RNase H (60 U·μL-1) 1 μL、
DEPC处理水39 μL, 30 ℃处理1 h, 然后用PCR产
物纯化试剂盒纯化RNase H酶解产物。产物纯化
时, 将2管经过酶解的cDNA合并为1管进行纯化,
然后每管用20 μL洗脱液进行洗脱。
纯化后的cDNA 10 μL、5×TdT Buffer 10
μL、0.1% BSA 5 μL、100 mmol·L-1 dCTP 0.5
μL、TdT 1.5 μL、双蒸水23 μL, 体系共50 μL, 37
℃ 5 h进行TdT末端加尾, 同时加尾2管。加尾完
后用PCR产物纯化试剂盒纯化处理产物, 2管加尾
产物合并为1管进行纯化, 用30 μL洗脱液进行洗
脱, 然后保存于-30 ℃冰箱备用。
应用巢式PCR和降落PCR技术 , 经过两轮
PCR即可获得结果。第1轮PCR用AP长引物和特
异引物d2。反应体系为: 加尾产物1 μL, dNTP (10
mmol·L-1) 0.5 μL, 上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,
Dream Taq酶0.15 μL, Buffer 2.5 μL, 加超纯水18.85
μL。反应程序为: 95 ℃变性3 min; 95 ℃ 40 s, 62 ℃
50 s, 72 ℃ 2 min, 共2个循环; 95 ℃40 s, 60 ℃ 50 s,
72 ℃ 2 min, 共2个循环; 95 ℃ 40 s, 58 ℃ 50 s, 72 ℃
2 min, 共2个循环; 95 ℃ 40 s, 56 ℃ 50 s, 72 ℃ 2 min,
共30循环; 每轮PCR共36个循环。第2轮PCR以第
1轮PCR为模板(第1轮产物稀释40倍, 用1 μL为第
2轮PCR模板), 反应体系跟反应程序同第1轮PCR。
用1.2%的琼脂糖电泳检测PCR结果, 第2轮
PCR一般会得到一条或者多条明显的条带, 选择较
长、并且明亮的条带为目的条带, 用琼脂糖回收试
剂盒回收目的条带, 将目的条带连接到pMD18-T
vector载体、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 经
过PCR验证正确的阳性克隆送上海生工测序。
实验结果
1 RNA提取及其逆转录
采用改良SDS法提取的芒果总RNA如图1-A,
28S和18S条带完整并且边缘清晰 , 说明提取的
RNA完整性很好 ; OD 260/OD 280=1.95 , OD 260/
OD230=2.20, 浓度为0.8 μg·μL-1, 说明提取的RNA
质量非常好。采用PrimeScript逆转录酶对芒果总
RNA进行逆转录的效果如图1-B, 逆转录产物在200
bp到2 000 bp均匀弥散, 说明逆转录效果良好。
图1 RNA (A)和逆转录产物(B)
Fig.1 RNA (A) and reverse transcription product (B)
M: DL2000 marker; 1: RNA ; 2: 逆转录产物。
2 PCR扩增结果检测
通过TdT加多聚dC尾巴 , 用包含dG序列的
AP长引物和基因特异引物d2进行第1轮PCR扩增,
把包含d2引物序列信息的基因特异扩增; 然后以
稀释40倍的第1轮PCR产物为模板, 应用巢式基因
特异引物d1和AP短引物继续特异扩增, 经过两轮
PCR扩增, 使目的片段得以特异扩增。第2轮扩增
电泳结果见图2, 木糖合成酶基因UDP经过5UD-
Pd1特异引物向5′末端扩增了约1 000 bp的条带, 甘
油醛 - 3 -磷酸脱氢酶基因G A P D H由特异引物
5MGApd1向5′末端扩增了约700 bp的条带, 钙结合
罗聪等: 一种高效获取基因5′末端的RACE方法 411
蛋白基因CDK由特异引物5CDPKd1扩增获得了长
度约为500 bp的条带, 但经过序列比对发现特异
引物5CDPKd1扩增长度应该达到1 250 bp的条带
才可能获得完整的5′末端, 因此回收500 bp的条带
测序, 然后在获得5′末端序列上继续设计特异引物
5CDPKd0, 利用第1轮稀释产物为模板继续扩增,
获得了长度约为1 400 bp的条带, 钙结合蛋白基因
CDK第2轮和第3轮电泳图谱见图3。
3 5′末端序列分析
经过克隆测序, 获得UDP基因5′末端序列长为
1 016 bp, 其中未知序列长度为842 bp (图4); 获得
GAPDH基因5′末端序列长度为697 bp, 其中未知序
列长度为560 bp (图5)。CDK基因经过第2轮PCR
扩增获得了长度为480 bp序列, 其中未知序列长度
为400 bp, 在获得的未知序列上继续设计特异引物
5CDPKd0, 经过第3轮PCR, 又成功获得了长度为
1 395 bp的序列, 其中未知序列长度为1 260 bp (图6)。
讨　　论
目前获得基因5′末端的方法有全长cDNA文
库构建法、染色体步移法和5′RACE试剂盒等。全
长cDNA文库构建法可以直接获得大量的基因全
长序列, 而不需获取基因的5′末端, 但该方法对技
术要求高、过程复杂且费用较高(朱利军等2009)。
染色体步移法是获得与已知序列相邻未知序列的
方法, 该方法经济, 原理简单; 染色体步移法又包
括几种方法, 如反向PCR技术、连接介导PCR技
术、特异引物PCR技术等, 这些方法各有优缺点
(刘博等2006; 洪登峰等2006; 梁成真等2009), 但选
择合适的方法才可以获得基因的5′末端, 并且操作
步骤比较繁琐。5′RACE技术因其技术成熟, 操作
方便, 成功率高, 是目前应用最多的获得基因5′末
端的方法, 但是购买5′RACE试剂盒需要大量的资
金。目前应用较多的5′RACE试剂盒包括: Clon-
tech公司开发的基于“模板跳转反转录”的SMART
RACE技术; Invitrogen公司开发的基于“末端脱氧
核苷酸转移酶(TdT)加尾”的锚定RACE技术; Ta-
KaRa公司开发的基于“去帽法”原理的环化RACE
技术等, 这些5′RACE试剂盒方法又各有优缺点
(王少丽等2004; 王燕等2005; 郝敏等2006; 郑阳霞
等2008)。
本研究是在基于“末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)
加尾”的锚定RACE技术上进行优化改良, 结合巢
式PCR技术和降落PCR技术而获得的一种可高效
获得基因5′末端的方法。本方法操作简单, 成本非
图3 CDK基因PCR电泳图谱
Fig.3 PCR electrophoresis pattern of CDK gene
M: DL2000 marker; 1: 第2轮PCR扩增产物(480 bp); 2: 第3轮
PCR扩增产物(1 395 bp)。箭头所指为目的条带。
图2 UDP基因和GAPDH基因5′端第2轮PCR电泳图谱
Fig.2 Electrophoresis pattern for 5′ end products of genes
UDP and GAPDH by the second PCR
M: DL2000 marker; 1: UDP基因第2轮PCR产物(1 016 bp); 2:
GAPDH第2轮PCR产物(697 bp)。箭头所指为目的条带。
植物生理学报412
常低廉, 对实验室条件要求不高, 而且能够满足获
得大量基因5′末端的要求。
本实验方案的改良之处及其细节如下。
(1)引物设计部分。引物设计的合理是PCR扩
增成功的关键。在本方案中, 获得一个基因的5′末
端只需要两对特异引物即可。特异引物设计的最
佳参数为: 引物长度在22~25 bp之间, GC含量在
45%~60%之间, 引物Tm值控制在59~65 ℃之间。
(2)逆转录部分。由mRNA反转录合成完整
的第1链cDNA是RACE技术中最关键的一步, 尤
其对于基因5′末端的获取。因此, 对RNA要求较
高, 要求没有明显降解, 电泳条带清晰。本方法采
图4 UDP基因5′端序列
Fig.4 The 5′ end sequence of UDP gene
下划线为引物序列; 方框为已知序列; 方框内的ATG为起始密码子。
图5 GAPDH基因5′端序列
Fig.5 The 5′ end sequence of GAPDH gene
下划线为引物序列; 方框为已知序列; 方框内的ATG为起始密码子。
罗聪等: 一种高效获取基因5′末端的RACE方法 413
用通用引物进行逆转录获得的逆转录产物既可以
用于基因3′末端的克隆又可以进行基因5′末端的
克隆; 逆转录用的RNA是各个组织的混合RNA,
避免了某些基因由于表达差异而无法克隆的缺
图6 CDK基因 cDNA 全长序列
Fig.6 The full-length cDNA sequence of CDK gene
下划线为引物序列; 斜体为已知序列; 方框为第2轮5′PCR获得序列; 其余为第3轮5′PCR获得序列; 方框内的ATG为起始密码子, TGA
为终止密码子。
点。逆转录酶采用TaKaRa公司生产的PrimeScript
逆转录酶, 该酶具有极强的延伸能力, 可以获得更
多的全长cDNA。逆转录后用RNase H对逆转录
产物中剩余RNA进行消化, 然后用PCR产物纯化
植物生理学报414
试剂盒进行纯化, 去除逆转录产物中多余的逆转
录引物和dNTP, 防止其对TdT加尾效率的影响。
(3) TdT加尾。末端脱氧核糖核酸转移酶法
(TdT)是在基因的3′末端加上一个多聚尾巴, 然后
用接头引物跟基因特异引物进行PCR扩增获得目
的条带的方法。但是TdT加尾的效率却比较低,
非常容易导致实验的失败(唐慧等2001; 王燕等
2005; 郝敏等2006)。本实验采用纯化后的具有较
高浓度的cDNA进行加尾, 浓度为100 mmol·L-1的
dCTP 0.5 μL, 加尾时间由试剂说明书上的30 min
延长到5 h; 通过增加cDNA浓度、dCTP浓度和延
长加尾时间, 从而提高加尾的效率。本实验采用
PCR产物纯化试剂盒纯化TdT加尾产物, 10 min即
可完成纯化, 这样既减少了操作步骤, 又节约了实
验时间。2管加尾产物合并为1管进行纯化, 增加
加尾产物的浓度。因此, 第1轮PCR仅需要1 μL模
板就可以完成。
(4) PCR扩增。采用巢式PCR和降落PCR相结
合的方法来获得基因的5′末端。第1轮PCR使基因
特异产物得以初步积累, 第2轮PCR使基因的产物
得以特异扩增, 但获得的第2轮PCR产物通常不是
单一条带, 这是由于同聚物加尾反应过程中, TdT
加尾时不能区分cDNA是否是全长 , 非全长的
cDNA 分子也被加尾, 在后续的PCR中同样被扩增,
从而产生一些长短不一的条带。因此在选择条带
进行克隆时, 需要选择条带较长、清晰、明亮的
条带进行回收测序。两轮PCR扩增程序均一样, 经
过3个循环的降落PCR, 每次退火温度降低2 ℃, 每
次2个循环, 退火温度从62 ℃降到56 ℃, 然后恒定
在56 ℃下30个循环, 较高的退火温度可以减少非
特异条带的扩增。
( 5 )较长基因5 ′末端的克隆。通常情况下
RACE技术获得的5′末端长度小于1 000 bp, 小于
500 bp的5′末端比较容易获取。如果一个基因的
5′末端长度大于1 000 bp, 就需要进行3轮或者4轮
5′RACE实验来获得其完整的5′末端。步骤如下:
首先按照本实验方法进行两轮PCR扩增, 在第2轮
PCR电泳时回收最大的条带进行测序, 在测序正
确后进行序列拼接, 然后继续在其5′末端设计一
个特异引物, 以第1轮PCR的稀释产物为模板继续
PCR, 回收目的条带测序。这样通过3轮或者4轮
5′RACE实验即可获得较长基因的5′末端, 本实验
中我们以芒果钙结合蛋白基因CDK为例, 经过3轮
5′RACE PCR成功获得了其5′末端序列。
本实验方法不仅适用于普通基因5′末端的获
取, 并且对于5′末端比较长的基因也适用, 一次
TdT加尾, 就可以获得大量基因的5′末端。本方法
不需要购买昂贵的5′RACE试剂盒, 一次实验只需
要近百元, 同时本实验方法简单, 步骤简略, 在
TdT加尾纯化后, 1 d内就可以获得实验结果。因
此, 本方法是一种高效、简便、廉价、快速、适用
于不同丰度、不同长度基因5′末端的快速获取方
法, 具有广阔的应用前景。目前本课题组成功应
用该技术从芒果的cDNA加尾产物中获取了几十个
不同基因的5′末端序列, 并且最近本课题组又从龙
眼的cDNA加尾产物中也成功获得了几十个不同
基因的5′末端, 证明了该方法的高效性和实用性。
参考文献
邓雪柯, 殷建华, 曹毅(2007). 3种5′RACE技术的比较与优化. 成都
医学院学报, 2 (1): 20~25
段静波, 白方文, 白林含(2008). cDNA末端快速扩增试剂盒研发进
展. 生命的化学, 28 (5): 641~645
郝敏, 谷守芹, 韩建民, 董金皋(2006). cDNA末端扩增技术的研究
进展. 河北林果研究, 21 (2): 157~161
洪登峰, 万丽丽, 杨光圣(2006). 侧翼序列克隆方法评价. 分子植物
育种, 4 (2): 280~288
李关荣, 鲁成, 夏庆友, 向仲怀(2003). cDNA末端快速扩增技术
(RACE)的优化与改良. 生命科学研究, 7 (3): 189~197
梁成真, 张锐, 郭三堆(2009). 染色体步移技术研究进展. 生物技术
通报, 10: 75~87
刘博, 苏乔, 汤敏谦, 袁晓东, 安利佳(2006). 应用于染色体步移的
PCR扩增技术的研究进展. 遗传, 28 (5): 587~595
唐慧, 陈善娜, 鄢波, 马志刚, 黄兴奇(2001). 一种cDNA 5′末端的克
隆方法. 云南大学学报, 23 (3): 238~240
王少丽, 盛承发, 乔传令(2004). cDNA末端快速扩增技术及其应用.
遗传, 26 (3): 419~423
王燕, 刘艳艳, 杨永清, 崔建美(2005). cDNA末端快速扩增技术研
究进展. 生命科学研究, 9 (4): 31~36
夏瑞, 陆旺金, 李建国(2008). 一种改良的扩增 cDNA 5′末端的方法.
园艺学报, 35 (10): 1533~1538
肖洁凝, 黄学林, 黎茵, 黄霞, 李筱菊(2003). 富含多糖和次生物质的
芒果子叶总RNA的提取. 中国生物工程杂志, 23 (11): 83~86
郑阳霞, 李焕秀, 严泽生(2008). RACE技术及其在植物基因研究中
的应用. 安徽农业科学, 36 (7): 2674~2676
朱利军, 长孙东亭, 罗素兰(2009). 全长cDNA文库构建方法及应用
研究. 海南大学学报(自然科学版), 27 (2): 185~189