全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (11): 1855~1860　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0189 1855
收稿 2015-05-08　　修定 2015-10-30
资助 国家高技术“863”研究发展计划(2011AA10A202-2)、
“十二五”国家科技支撑计划(2011BAE06B04)。
* 通讯作者(E-mail: tianli@fio.org.cn; Tel: 0532-88967423)。
海洋生境芽孢杆菌(Bacillus sp.) T28菌株对番茄生长的多功能促进作用
崔荣强1,2, 张久明1, 马湘君1, 李闯1, 田黎1,2,*
1青岛科技大学生物系, 山东青岛266042; 2国家海洋局第一海洋研究所, 山东青岛266061
摘要: 以来自海洋生境具有强抑菌作用的芽孢杆菌T28为试验菌株, 采用生物学与分子生物学方法研究其对番茄生长的多
种促进作用。结果表明, T28菌株具有固氮酶基因nifH和固氮作用, 可以分解磷和钾, 产生铁载体和促生长植物激素IAA。
标记的T28菌株可在番茄植株上定殖, 从而提高番茄苗的叶绿素含量, 定殖15 d后比对照的叶绿素含量高33.3%, 且差异显
著。从T28菌株中扩增到γ-谷氨酰胺激酶(GK)基因proB, 推测T28菌株可能通过对脯氨酸的调节来诱导植物抗盐。病害防
治试验证明, T28菌株对番茄灰霉病防效为68.8%, 防治效果明显。
关键词: 海洋生境芽孢杆菌T28菌株; 番茄; 多种功能
Multifunction of Marine Bacillus sp. Strain T28 on Tomato Growth-Promoting
CUI Rong-Qiang1,2, ZHANG Jiu-Ming1, MA Xiang-Jun1, LI Chuang1, TIAN Li1,2,*
1Biology Department, Qingdao University of Science & Technology, Qingdao, Shandong 266042, China; 2First Institute of Ocean-
ography, State Oceanic Administration, Qingdao, Shandong 266061, China
Abstract: In this study, the multifunction on tomato such as nifH gene and nitrogen fixation, phosphate- and
potassium-dissolving, siderophore and indole-3-acetic acid (IAA) production abilities, was investigated using
marine Bacillus sp. strain T28 in vitro and in vivo. With gene nifH, proB, siderophore and IAA production in-
ferred that the strain promoted tomato growth by nitrogen fixation, phosphate- and potassium-dissolving and
proline gathering to resist salt stress. The chlorophyll content in tomato seedlings was increased 33.3% after
marked strain colonization 15 d and control effects on Botrytis cinerea was 68.8%.
Key words: marine Bacillus sp. strain T28; tomato; multifunction
微生物对植物生长、营养吸收、抗病和抗逆
起着重要作用, 选择和促进微生物对植物的有益
功能, 可降低农药和化肥的使用, 更有利于环境和
农产品的安全, 也可满足人们注重生活质量崇尚
有机农产品的需求。耕地盐渍化一直是我国可持
续农业发展面临的突出问题, 随着温室大棚等设
施生产的发展, 土壤次生盐渍化程度也不断加重
(石伟等2011), 在众多的提高植物抗盐和降低土壤
盐碱量的研究中, 有益微生物的作用得到重视。
有益微生物对植物起作用首先要在植株体内定殖,
其定殖能力决定对植物作用的大小(Kloepper和
Beauchamp 1992)。陆地微生物因生长条件限制,
较难在盐渍土壤中定殖, 而海洋微生物的原生境
使其具备在高盐、低温环境下生长的优势。有报
道认为, 表面活性素(surfactin)会加速生物膜的形
成(索雅丽等2010), 从而通过快速增加表面动力促
进有益菌在根部定殖, 其合成基因srfAA和srfAB受
到关注。在高渗环境中, 一些生物通过调节脯氨
酸含量, 应对外界渗透压变化, 这种调节受基因控
制, 通过基因测试能更准确获得具有此功能的菌
株, 已证明proB基因控制的γ-谷氨酰胺激酶(γ-
glutamyl kinase, GK)参与了脯氨酸调节, 成为人们
选择有益菌株的参考(刘瑞杰等2005)。
氮、磷、钾是植物生长必需的大量元素, 微
生物的固氮作用可增加土壤氮素含量, 通过较保
守的固氮酶(nitrogenase)基因nifH可以快速、准确
地选择固氮菌株(章秋艳等2013)。土壤存在有大
量无机磷和硅酸盐矿物形式的钾, 由于其溶解性
差, 难于被植物吸收, 一些细菌可借助生命活动过
程产生物质将难溶的磷、钾元素转变为可溶态以
供植物利用(蔡磊等2002)。铁载体(siderophores)是
一类具有很强特异螯合Fe3+的小分子化合物, 许多
植物根际微生物可通过合成这类物质来摄取环境
中的铁, 并将多余的铁提供给植物利用(Henkels和
植物生理学报1856
Loper 1999)。吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)
是一种植物体内的内源生长素, 参与细胞生长、
形成层分裂、维管组织分化等多种生理生化过程
的调节与控制, 具有分泌IAA活性的细菌能够促进
植物种子萌发和生长(潘丽晶等2014)。
芽孢杆菌具有以营养与空间竞争、分泌抗菌
物质、诱导植物抗性、对高等动物无毒害、不污
染环境等优点, 成为重要的植物生防菌, 如果在防
治病害的同时, 兼能促进植物生长和抗逆能力, 则
为生防菌株的首选。相比陆地生境芽孢杆菌, 海
洋生境的芽孢杆菌在农业应用的研究相对较少,
本文对来自潮间带红树植物芽孢杆菌T28菌株进
行了相关研究, 旨在为该菌株的进一步应用提供
科学基础。
材料与方法
1 供试菌株和植物材料
芽孢杆菌T28菌株由本课题组分离自广西山
口潮间带红树植物 , 根据生理生化特性及16S
rDNA基因序列分析及同源性比较, 鉴定为Bacillus
sp., 经抑菌谱测试, 其对本课题组保存的番茄灰霉
病菌(Botrytis cinerea)、番茄叶霉病菌(Cladospori-
um fulvum)、马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)、
油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotirum)、棉花枯萎
病菌(Fusarium oxysporum)、小麦赤霉病菌(Fusar-
ium graminearum)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora
capsici)等7种农药筛选靶标菌具有较强的抑菌作
用, 抑菌率为75.3%~88.9%。
番茄(Lycopersicon esculentum M.)品种‘T2-69’
的种子与土壤经消毒处理, 育种钵内番茄培养至
3~4片和6~7片叶备用。
2 培养基及菌悬液的制备
LB培养基和PDA培养基用于T28菌株培养和
发酵及对峙抑菌试验; PKO无机磷培养基和解钾
培养基(李显刚等2012; 闫华晓等2012)用于测试菌
株对磷、钾的降解作用; CAS培养基(赵翔等2006)
用于观察菌株铁载体的产生; L-色氨酸的R2A培养
基(刘琳等2010)用于测试菌株IAA产生; ACCC55
培养基(孙建光等2009)用于判断T28菌株固氮特
性; NA培养基(蔡学清等2003)用于抗Rif突变株的
筛选和定殖测试。
制备海洋芽孢杆菌悬液时, 将T28菌株置于
LB培养液中, 于30 ℃下150 r·min-1振荡培养4~5 d,
调节浓度至106 cfu·mL-1。
制备病原真菌孢子悬液时, 将番茄灰霉病菌
发酵7 d, 用4层纱布滤去菌丝, 调节孢子浓度至200
cfu·mL-1。
3 T28菌株耐盐定殖力的测试
T28菌株的利福平(300 µg·mL-1)标记及筛选参
考范晓静等(2013)的方法。
参照崔金香等(2010)的方法进行番茄苗定
殖。取三至四叶期的番茄苗, 浸入T28菌株悬浮液
30 min (以浸水为对照), 分别栽到灭菌的普通土与
盐渍土盆钵内, 于处理后2、4、7、10、15 d随机
各抽取3棵苗的根、茎、叶0.5 g, 无菌水冲洗并研
碎, 稀释后涂布在含有300 μg·mL-1 Rif的NA平板
上, 3次重复, 28 ℃下培养2~3 d后计数。
4 srfAA和srfAB基因的检测
参照文献(Joshi和McSpadden Gardener 2006)
设计srfAA和srfAB引物序列。50 µL反应体系中包
括双蒸水37.5 µL、10×Buffer 5 µL、200 µmol·L-1
dNTP 4 µL、引物2 µL、Taq酶0.5 µL、基因组
DNA 1 µL。srfAA的PCR扩增条件为: 94 ℃预变性
5 min; 94 ℃ 1 min, 62 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 30个循
环; 72 ℃延伸10 min。srfAB退火温度为58 ℃。扩
增产物送北京华大基因公司测序。
5 proB基因的扩增
参照文献(张小青等2002)设计的引物序列为:
5′-CACAAGCGCGTTCAATCAATCAAGGTGG-3′;
5′-CAGTTCTTTGCGGAGTCCGTTTGC-3′。反应体
系同第4节。扩增条件为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃
1 min, 54 ℃ 70 s, 72 ℃ 2 min, 30个循环; 72 ℃延伸
10 min。
6 叶绿素含量测定
参照崔金香等(2010)的方法测定叶绿素含
量。取种植在普通土和盐渍土的番茄苗新鲜叶片
各0.1 g, 加入少量碳酸镁和石英砂及4 mL丙酮, 研
成匀浆, 过滤后转入10 mL容量瓶, 用80%丙酮定容
至10 mL。调分光光度计波长为663、645 nm, 分
别测定样品液的A663、A645。
7 nifH基因的检测
参考Mehta等(2003)的方法检测nifH基因。设
崔荣强等: 海洋生境芽孢杆菌(Bacillus sp.) T28菌株对番茄生长的多功能促进作用 1857
计的PCR引物序列为: 5′-GGCTGCGATCCAAGG-
CCGATCACCCG-3′; 5′-CTGGCCTTGTTTCGCG-
GATGGCATGGC-3′。反应体系同第4节。PCR条
件为: 94 ℃ 2 min; 94 ℃10 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min,
35个循环; 72 ℃延伸10 min。扩增产物送北京华
大基因测序。
8 菌株固氮、降解磷和钾及产铁载体的检测
将在LB平板上培养48 h的T28菌株分别接在
ACCC55培养基、PKO无机磷培养基、解钾培养
基、CAS培养基上, 3个重复, 29 ℃培养72 h, 观察
菌株生长及产生透明圈直径。参照Machuca和Mi-
lagres (2003)的方法, 将发酵液在离心力560×g下离
心15 min, 取上清与CAS染液以1:1 (V/V)混匀, 静置
1 h, 用分光光度计测定波长为630 nm的吸光值(As),
未接种的培养基在波长630 nm的吸光值为参比值
(Ar), 根据公式: [(Ar−As)/Ar]×100计算铁载体活性。
9 IAA的检测
将T28菌株接种于含有100 mg·L-1 L-色氨酸的
R2A培养基(Glickmann和Dessaux 1995)中, 30
℃、
150 r·min-1培养5 d, 取50 µL菌悬液滴于白色陶瓷
板上, 加50 µL Salkowski比色液, 以50 µL IAA (50
mg·L-1)的比色液作为阳性对照。颜色变红表示能
产生IAA。
10 番茄灰霉病防治试验
将番茄灰霉病菌孢子悬液喷施番茄苗, 叶片
开始表现症状后喷施T28菌悬液, 每个处理15株共
60片叶, 以无菌水为对照, 重复3次。喷施T28菌悬
液6 d后调查发病情况, 计算病情指数和防治效果
(Wallwork等1996)。
11 数据分析方法
采用SPSS 19.0进行数据统计分析。
实验结果
1 T28菌株的固氮及降解磷和钾的能力
以T28菌株DNA为模板, 扩增到710 bp的特征
性条带, 将测序结果在NCBI中与己知序列进行
BLAST, T28菌株的nifH基因与Bacillus amylolique-
faciens BA-1 (AWQY01000002)的nifH基因同源性
为91%。
培养观察显示, T28菌株在ACCC55培养基长
势良好, 培养4 d后菌落直径为15 mm, 菌落为乳白
表1 T28菌株分解磷和钾并产铁载体
Table 1 The strain T28 dissolves phosphate and potassium,
and produces siderophore
培养基 晕圈平均直径/mm 菌落平均直径/mm
PKO无机磷培养基 14.0±0.75a 6.2±0.25b
解钾培养基 17.1±0.85a 9.2±0.35b
CAS培养基 17.6±1.23a 8.3±0.49b
　　同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05), 图2、表2同此。
色, 光滑湿润。在PKO无机磷培养基和解钾培养
基上均产生晕圈(表1)。证明T28菌株具有固氮及
分解磷和钾的能力。
2 T28菌株能产生铁载体及合成IAA
T28菌株在CAS培养基产生较明显橙黄色晕
圈(表1), 随培养时间的延长, 橙黄色晕圈会逐渐变
大, 培养4 d时, 分光光度计测得的As和Ar值分别为
0.202和0.552, 计算出铁载体活性为63.4%, 证明菌
株具有产生铁载体的能力且活性较强 (孙磊等
2011)。菌悬液与Salkowski比色液混合后呈现阳性
的红色, 同时在进行其他试验中也观察到, 喷T28
菌株的盆栽番茄苗生长较快, 说明T28菌株能产生
IAA, 对番茄生长具有促进作用。
3 T28菌株在番茄定殖及促进耐盐作用
从T28菌株扩增到srfAA与srfAB基因簇片段大
小为737和197 bp的特征性条带, 将测序结果在
NCBI中与己知序列BLAST的结果表明, srfAA基因
与Bacillus subtilis BEST195 (AP011541)和B. subti-
lis XF-1 (CP004019)的srfAA基因同源性为95%;
s r fAB基因与B. amy lo l ique fac iens LFB112
(CP006952)和B. subtilis F229u (AF520861)的srfAB
基因同源性为90%以上, 表明T28菌株可能产生表
面活性素, 促进T28菌株在植物体内定殖。
标记的T28菌株在2种土壤上生长的番茄苗中
均可正常定殖, 普通土和盐渍土中番茄根部的定
殖菌量在测定的第4天达到最高 , 分别是1.39×
105、1.56×105 cfu·g-1 (FW), 随着时间延长有所下
降, 15 d后分别为2.4×104、3.9×104 cfu·g-1 (FW), 后
者比前者定殖量高40%。T28菌株定殖普通土的
茎、叶的最高值分别出现在第7天和第4天, 含量
为2.13×104和9.3×103 cfu·g-1 (FW), T28菌株定殖盐
植物生理学报1858
渍土茎、叶的最高点均出现在第4天 , 含量为
2.7×104和1.2×104 cfu·g-1 (FW), 即T28菌株在盐渍
土茎、叶定殖量分别比普通土定殖量高27%和
29%, 15 d后, 后者茎叶仍可检测到T28菌株, 前者
则检测不到(图1)。
4 GK基因及番茄苗中叶绿素含量的变化
从T28菌株扩增到1 325 bp的特征性条带, 将
测序结果在NCBI中与己知序列进行BLAST比对
的结果表明 , 其proB基因与B. subt i l i s GK-2
( AY 6 0 1 6 6 8 )和B . a m y l o l i q u e f a c i e n s A C - 1
(NC020410)的proB基因同源性在91%以上。推测
T28菌株可能通过GK对脯氨酸含量进行调节, 从
而达到抗高渗和抗盐作用(蒋雪梅等2013)。
图2显示, 经T28菌株处理15 d的普通土中番
茄苗的叶绿素含量为2.31 mg·g-1 (FW), 比对照增
加10%, 达到显著效果(P<0.05); 而盐渍土中番茄苗
的叶绿素含量为2.07 mg·g -1 (FW), 比对照增加
33.3%, 有显著提高(P<0.01)。盐胁迫下T28菌株能
显著提高番茄苗的叶绿素含量, 经T28菌株处理的
番茄苗明显比对照叶色浓绿, 表明T28菌株能够促
表2 T28菌株对番茄灰霉病的防治效果
Table 2 The control efficiency of strain T28 to
gray mold of tomato
喷施菌悬 病情指数/% 防治效果/%
液时间/d 对照 T28菌株处理
6 68.8±0.59a 29.6±1.24b 57.0

图1 标记的T28菌株在番茄苗的定殖情况
Fig.1 Colonization of tomato by marked strain T28
图2 番茄苗在普通土和盐渍土中叶绿素含量的变化
Fig.2 The changes of tomato chlorophyll content in both soil and saline soil
进盐胁迫下植物的生长。
5 番茄灰霉病的防治效果
从表2看出, 喷施T28菌悬液后第6天, 对照的
发病指数为68.8%, T28菌株处理的发病指数为
29.6%, 防效达到57.0%, 防治效果显著(P<0.05), 表
明T28对番茄灰霉病具有良好的防治效果。
崔荣强等: 海洋生境芽孢杆菌(Bacillus sp.) T28菌株对番茄生长的多功能促进作用 1859
讨 　　论
提高栽培植物产量是农业生产永恒的目标,
我国人多地少的特点对此要求更加迫切, 化学农
药和化肥在快速控制病虫害和提高产量的同时,
对农产品和环境的污染不容忽视, 生物农药与肥
料以其与环境良好的兼容性日益受到重视, 芽胞
杆菌是目前生物农药中应用最多的活菌制剂, 但
实际应用时往往因为生物产品作用缓慢而受到限
制, 如果生防菌对植物有利的促进作用较多, 无疑
会增加其利用价值。
我国是土壤盐渍化较严重的国家之一, 盐渍
化土壤总面积达3 460万ha, 相当于耕地的1/3, 同时
土壤次生盐渍化程度也不断加重, 为了利用这些
土地, 多采用培育耐盐植物品种和使用物理和化
学方法降低盐害。土传病害一般使用微生物农药
效果较好, 但由于目前农药产品的生防菌都来源
于陆地, 耐盐性能较差, 在含盐量较高的土壤中难
以存活、定殖和繁殖, 影响了其在盐渍地对土传
病害的防治。日益受到重视的海洋微生物因原生
境的高盐恰好解决了此问题, 本课题组曾首次报
道了海洋微生物具有良好的诱导植物抗盐的作用
(崔金香等2010), 如果在此基础上对植物还有其他
它有利的作用, 开发的潜力将更大, 本文初步证明
T28菌株还具有固氮、分解磷和钾、产生铁载体
和分泌植物生长激素的优良特性。
叶绿素是绿色植物进行光合作用的必需物质,
是研究植物生长和生理变化的重要指标, 不仅植
物病原菌侵染植株会造成叶片光合能力下降(杜国
栋等2013), 在高盐胁迫下, 盐生植物藜苗期叶绿素
含量显著下降(吕秀云等2012)。本文结果显示,
T28显著提高了盐胁迫番茄叶片中叶绿素的含量
(图2), 可能与T28菌株诱导番茄抗盐有关。随着对
固氮菌研究的深入, 固氮菌发现的种类日益增多,
但能够产生芽孢的相对较少(Ding等2005), 而海洋
生境芽孢杆菌作为益生菌对植物氮、磷、钾的促
进作用更少有报道, 本文初步探讨了海洋生境芽
孢杆菌T28菌株对固氮及分解磷和钾的作用, 显示
海洋生境微生物具有潜在的农用价值。
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