全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (9): 869~873 869
收稿 2012-05-21　　修定 2012-07-09
资助 国家自然科学基金(30670126和31170289)和公益性行业(农
业)科研专项经费(200903016)。
* 通讯作者(E-mail: hqtian@xmu.edu.cn; Tel: 0592-2186486)。
枸杞雌、雄配子DNA含量与细胞周期变化的初步研究
邓桦1, 宋玉霞2, 秦肯2, 田惠桥1,*
1厦门大学生命科学学院, 福建厦门361005; 2宁夏农林科学院, 银川750021
摘要: 枸杞是二胞花粉植物。花粉在柱头上萌发后生殖细胞在花粉管中分裂形成精细胞。在花粉管中, 精细胞开始合成
DNA, 随着花粉管生长, 精细胞DNA含量持续增加。当花粉管在退化助细胞中破裂, 释放出的2个精细胞DNA含量达到1.92
倍(1.92C)。在开花当天, 卵细胞已合成了约1/3 DNA, 并持续增加。开花后30 h, 卵细胞中的DNA含量达到1.63C。在受精
前, 卵细胞中的DNA含量达到1.83C。精、卵细胞融合后, 合子DNA含量为3.53C。去雄排除花粉管影响后, 已合成1/5
DNA的过熟卵细胞停止合成, 表明卵细胞持续合成DNA需要花粉管的刺激。枸杞雌、雄配子在融合前合成DNA, 在细胞
周期的G2期发生融合, 属于G2类型。
关键词: 枸杞; 精细胞; 卵细胞; DNA含量
DNA Content and Cell Cycle Changes of Male and Female Gametes of Lycium
barbarum L.
DENG Hua1, SONG Yu-Xia2, QIN Ken2, TIAN Hui-Qiao1,*
1School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen, Fujian 361005, China; 2Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sci-
ences, Yinchuan 750021, China
Abstract: The pollen of Lycium barbarum is bicellular and the generative cell divides to form two sperms in
pollen tube after a pollen grain lands on a stigma and germinates a pollen tube. In pollen tubes, two sperms be-
gin to synthesize DNA, and the content of DNA continues to increase. After pollen tubes reach degenerative
synergid and break, the DNA content in two released sperms reaches 1.92 DNA (1.92C). On the day of anthesis,
eggs have synthesized 1/3 DNA. At 30 h after anthesis, the DNA content in eggs reaches 1.63C. Before fertil-
ization, eggs contain 1.83C. After fertilization, zygotes contain 3.53C. In emasculated flowers, the eggs also
synthesize 1/5 DNA, however, the synthesis stops without the stimulation of pollen tube. Before the fusion of
male and female gametes of L. barbarum, both synthesize DNA and pass S phase of cell cycle, and fuse in G2
phase of cell cycle. Therefore, the fertilization of L. barbarum belongs to G2 type.
Key words: Lycium barbarum; sperm; egg; DNA content
传统观点认为植物的世代交替伴随着核相交
替, 减数分裂启动单倍体的配子体世代, 而受精则
开始二倍体的孢子体世代。受精后 , 单倍体的
精、卵细胞融合, 二倍体的合子合成DNA, 然后分
裂, 开始胚胎发生过程。有性生殖过程中, 配子细
胞DNA含量的变化规律是有性生殖的基本特点,
吸引了很多学者的兴趣。早在上世纪五六十年代
就有人利用细胞化学的方法观察雌、雄配子在融
合前后核DNA的含量(田国伟等2002)。然而利用
孚尔根反应对DNA进行组织化学定位受多种因
素的影响, 尤其是很多植物的成熟卵细胞不能被
染色, 无法检测其核DNA含量。另外, 不同作者
报道的大麦精细胞DNA含量有很大差异, 有单倍
(1C)、1~2C和2C (田国伟等2002)。技术上的限制
和不同实验结果的差异使这方面的研究在上世纪
80年代后很少再有报道。1991年, 麻黄双受精的
发现者Friedman报道了裸子植物长叶麻黄(Ephed-
ra trifurca)的精、卵细胞是在1C的DNA水平融合
(Friedman 1991)。但在显轴买麻藤(Gnetum gnemon)
中, 精、卵细胞在融合前既开始合成DNA, 二者是
在2C的DNA水平融合(Carmichael和Friedman
植物生理学报870
1995)。后来, 在被子植物拟南芥(Arabidopsis thali-
ana)中发现, 精细胞在花药内的花粉粒中就开始合
成DNA, 进入细胞周期的DNA合成期(S期), 临近
受精时, 在胚囊中的精细胞DNA含量达到2C, 但因
卵细胞不能染色, 无法检测卵细胞核DNA的变化
(Friedman 1999)。随着植物性细胞分离技术的发
展以及新的DNA荧光染料的发现, 测量整体细胞
DNA含量成为可能, 有关配子及合子核中DNA含
量的研究又开始有报道(Sherwood 1995; Mogensen
和Holm 1995; Mogensen等1995; Pónya等1999)。
特别值得一提的是, Friedman (1991)将雌、雄配子
发育中DNA含量变化与细胞周期的概念结合起来
研究精细胞发育与细胞周期之间的关系, 提出了
雌雄配子核融合时不同细胞周期的模式(G1和G2
型)。Tian等(2005)证实了烟草(Nicotiana tabacum)
精、卵细胞在融合前分别合成DNA的现象。目前,
仅此一例被子植物雌雄配子在G2期融合(G2型)的
报道。这种G2型的受精现象在被子植物中是否具
有普遍性, 还需要在更多植物中进行探索。枸杞
为茄科植物, 其花器官与烟草有一定共性, 但枸杞
的有性生殖过程与烟草也有差别。我们对枸杞受
精前后的雌雄配子和合子的核DNA进行测量, 以
证明其受精类型。
材料与方法
供试材料为栽种于宁夏农科院枸杞种植地的
‘宁杞一号’ (Lycium barbarum L.)。枸杞为茄科枸
杞属落叶小灌木, 二胞花粉, 粘性柱头, 花柱长约1
cm, 无限花序, 每个子房中有胚珠约60个。枸杞每
年盛花期在六七月。通常枸杞花在早上8:00左右
花冠松弛, 10:00左右花冠张开, 12:00左右第一个
花药开裂。开花后72 h花冠凋谢。在开花后的36 h
内, 柱头都可使花粉萌发。在自花授粉、同株异
花、异株异花授粉测试中, 均可结实。为了确保
在相对集中的时间中有较多的花粉管, 本实验采
用了异株异花人工授粉技术。在早上9:00左右对
即将开花的小花去雄、授粉。
选择授粉16、20、24、28、32 h的花柱(测量
花粉管精细胞), 授粉28~30 h的胚珠(对照, 测量有
花粉管刺激但没有发生受精的卵细胞), 授粉36、
42、48、55 h的胚珠(测量受精卵细胞)和去雄不授
粉42、55、72 h的胚珠(测量没有花粉管刺激的
过成熟卵细胞)进行实验。所有样品用卡诺固定液
固定24 h后, 石蜡包埋、切片。切片厚度8~10 µm。
切片脱蜡后经梯度酒精至0.25 µg·mL-1 DAPI
(4,6-diamidino-2-phenylindole)水溶液中静置染色
30 min, 封片后用Leica DMR荧光显微镜观察、拍
照。拍照的图像用美国Simple-PCI专业图像分析
处理软件进行分析。以花柱体细胞和胚囊珠心细
胞的相对荧光单位(RFU)为2C作为测量的对照标
准, 计算不同时期精细胞、卵细胞、中央细胞及
最终合子的DNA相对含量。对所用载玻片的荧光
值进行20组测量, 所有样品的测试值均减去载玻
片荧光值。载玻片统一采用同一厂家、同一批
次。数据最终经SPSS软件进行T检验。
实验结果
1 精细胞核DNA含量变化
枸杞花粉为二胞型, 生殖细胞在生长的花粉
管中分裂形成2个精细胞。枸杞花柱长约1 cm, 授
粉后34 h在子房中可看到有花粉管, 推测在授粉后
32 h花粉管将结束在花柱中的生长, 进入子房中。
在花柱中, 花粉管沿着花柱引导组织向下生长, 较
易获得精细胞对切片。花粉管进入子房后, 其生
长方向变化很大, 难以切到花粉管中的一对精细
胞。为此, 我们对授粉后16、24、28 h的花柱取样
镜检。在花柱中花粉管较直, 花粉管中的2个精细
胞通常相连在一起。另外, 花柱体细胞核常呈细
棒状, 而2个精细胞核则呈椭圆形(图1-A~D)。根
据这两个特征, 确保测量的细胞核为精细胞核。
结果显示: 随着花粉管的生长, 其中的精细胞DNA
含量增加。当花粉管在退化助细胞中释放出2个
精细胞时(图1-E和F), 2个精细胞的DNA含量已达
到1.92C, 接近2C水平(表1)。
2 发育卵细胞及合子DNA含量变化
枸杞授粉后最早34 h花粉管进入子房。对开
花当天、授粉后30 h左右、即将授精的卵细胞及
受精后的合子DNA含量进行检测。结果显示: 开
花当天的卵细胞已合成了约1/3的DNA, 达到1.36C
的水平。开花后30 h, 卵细胞中的DNA含量达到
1.63C。在受精前(约开花后36 h), 卵细胞中的
DNA含量达到1.83C, 接近2倍DNA水平(图1-E和
F)。受精后, 形成的合子DNA含量达到3.53C, 接
近四倍体的水平。卵细胞随着发育成熟, 其DNA
邓桦等: 枸杞雌、雄配子DNA含量与细胞周期变化的初步研究 871
图1 枸杞精细胞和卵细胞的DNA含量
Fig.1 DNA content of sperm and egg cells of L. barbarum
A~D放大1 500倍, E~J放大400倍。标尺=10 µm。A: 枸杞授粉后16 h花柱切片明视野图; B: 花柱的荧光图像, 示花粉管中的2个精细胞
(箭头); C: 授粉后28 h花柱切片明视野图; D: 花柱的荧光图像, 示花粉管中的2个精细胞(箭头); E和F: 花粉管进入胚囊后释放出的2个精细
胞(箭头)和卵细胞(三角箭头); G: 花粉管释放精细胞(箭头)后中央细胞的2个极核(星号)融合, 三角箭头为卵细胞; H: 去雄后55 h的卵细胞
核(三角箭头); I: 中央细胞的极核融合为次生核(星号), 三角箭头示合子; J: 2个胚乳核(星号)。
植物生理学报872
含量呈递增趋势(表2)。
在精细胞进入胚囊后, 中央细胞的2个极核也
开始融合形成次生核(图1-G)。由于融合的次生核
体积很大, 测量出的DNA数据很不稳定, 没有规律
性。
3 去雄花的卵细胞核DNA含量变化
为了探究花粉管对卵细胞DNA合成的影响,
对枸杞去雄不授粉花的卵细胞DNA含量变化进行
了测量。为确保排除花粉管的影响, 在前一天下
午就对将在第二天开花的小花去雄、套袋。枸杞
通常是上午开花, 下午去雄可减少人工传粉的机
会。即使在镊子上沾有花粉, 因柱头还未成熟, 也
减少了花粉萌发的机会。结果显示: 去雄小花在
42~72 h内, 已合成1/5 DNA的卵细胞停止合成(图
1-H), 一直保持在1.2C左右(表3), 没有呈现出一个
持续递增的趋势。
中央细胞受精后, 次生核与1个精细胞融合形
成胚乳核。有时胚乳核的体积很大(图1-I), 有时2
个胚乳核又很靠近(图1-J), 2个核之间的荧光相互
影响, 测量的DNA数值变化很大, 无规律性。
讨　　论
被子植物雌雄配子DNA含量的研究是植物胚
胎学的一个老课题, 但引入细胞周期概念后, 这一
研究课题呈现出很多有趣的问题, 展示出很大的
研究潜力。由于被子植物的雌雄配子深藏在体细
胞组织中, 目前这方面的研究内容还很有限, 应用
荧光技术仅测量过拟南芥精细胞和烟草精、卵细
胞中的DNA含量, 因此, 还需要在其他植物中探索
配子的细胞周期类型。
被子植物的花粉有三胞和二胞两种类型, 前
者的生殖细胞在花粉粒中分裂形成2个精细胞, 后
表1 发育精细胞的DNA含量变化
Table 1 The change of DNA content in developing sperm cells
精细胞类型 测试总数 DNA相对量/RFU DNA水平/C
花柱体细胞(对照) 240 130.50±18.62 2.00±0.00
授粉后16 h的精细胞 29 98.15±10.51 1.50±0.16
授粉后24 h的精细胞 52 113.38±9.30 1.74±0.14
授粉后28 h的精细胞 60 119.64±11.62 1.83±0.18
进入胚囊中的精细胞 68 102.23±12.90 1.92±0.24
　　20个载玻片的荧光值为1.42±0.69。
表2 发育卵细胞及合子的DNA含量变化
Table 2 The change of DNA content in developing egg cells and zygotes
细胞类型 测试总数 DNA相对量/RFU DNA水平/C
珠心细胞(对照) 1 750 106.51±12.39 2.00±0.00
开花当天卵细胞 28 72.59±12.20 1.36±0.23
开花后30 h卵细胞 36 86.70±11.31 1.63±0.21
受精前卵细胞 42 97.26±12.90 1.83±0.24
合子 23 187.36±7.94 3.53±0.17
　　20个载玻片的荧光值为1.42±0.69。
表3 过成熟卵细胞的DNA含量变化
Table 3 The change of DNA content in over mature egg cells
细胞类型 测试总数 DNA相对量/RFU DNA水平/C
珠心细胞(对照) 1 750 106.51±12.39 2.00±0.00
去雄后42 h卵细胞 21 63.19±8.88 1.19±0.17
去雄后55 h卵细胞 22 64.30±7.53 1.21±0.14
去雄后72 h卵细胞 27 65.13±10.74 1.22±0.20
　　20个载玻片的荧光值为1.42±0.69。
邓桦等: 枸杞雌、雄配子DNA含量与细胞周期变化的初步研究 873
者的精细胞是在花粉管中形成。两种植物的精细
胞都需要经历花粉管的过程才能与卵细胞相遇。
在此过程中, 精细胞开始合成DNA的时间是一个
有趣的问题 , 关系到精细胞的细胞周期启动机
制。拟南芥为三胞花粉, 花粉生殖细胞分裂后形
成的2个精细胞即开始合成DNA, 进入细胞周期的
S期。在开花时的成熟花粉中精核DNA含量约为
1.5C的水平。当花粉管到达子房时, 精核DNA水
平达到1.75C, 至融合前胚囊中精核DNA含量达到
1.98C。因此, 拟南芥的精细胞在融合前已通过其
细胞周期的S期, 处于G2期, 推测可能是在细胞周
期的G2期与卵细胞融合, 为G2受精类型(Friedman
1999)。烟草是二胞花粉植物, 生殖细胞在花粉管
中分裂形成2个精细胞。烟草花柱长约4 cm, 花
粉管需生长45 h才抵达子房。在花粉管中, 精细胞
一直没有合成DNA, 处于1C水平。然而, 当花粉管
进入退化助细胞后, 释放出的一对精细胞开始合
成DNA, 通过其细胞周期的S期, 在与卵细胞融合
前达约2C水平, 是在G2期与卵细胞融合, 也是G2受
精类型(Tian等2005)。在本实验中, 枸杞花柱只有
1 cm, 但从授粉到进入子房的时间约需34 h, 表明
枸杞花粉管的生长速度比烟草要慢。枸杞授粉后
16 h, 精细胞在花粉管中已合成1/2 DNA, 达到
1.5C。精细胞进入胚囊退化助细胞后, 其DNA含
量已达1.92C, 也基本通过了细胞周期的S期, 属于
G2受精类型。拟南芥和烟草精细胞分别在花粉和
助细胞中开始合成DNA, 而本试验枸杞中的精细
胞是在花粉管中开始合成DNA, 3种植物精细胞合
成DNA的开始时间有很大差异, 这可能也是被子
植物有性生殖的一种多样性表现。但究其规律性,
还需要在更多植物中进行研究。
拟南芥成熟卵细胞不能被染色, 无法检测卵
细胞受精前的DNA变化特征(Friedman 1999)。在
烟草中, 成熟卵细胞可被DAPI染色, 对其DNA含
量变化做了检测, 揭示了被子植物卵细胞的细胞
周期变化特征。烟草花粉管进入胚囊、释放的精
细胞开始合成DNA后, 卵细胞也开始合成DNA。
在与精细胞融合前, 卵细胞中的DNA含量达到2C
水平, 证实了烟草雌、雄配子是在G2期融合的特
征。在去雄花中, 没有花粉管的刺激, 卵细胞仍可
合成DNA, 但合成时间明显推迟(Tian等2005)。这
一方面说明花粉管或精细胞对卵细胞启动细胞周
期具有刺激作用, 另一方面也说明卵细胞本身具
有合成DNA的潜力, 在没有雄性细胞的刺激时也
可合成DNA。烟草精细胞对中央细胞的2个极核
融合具有刺激作用(林美珍等2009)。在本试验中,
枸杞开花当天的卵细胞已合成了约1/3的DNA, 达
到1.36C。受精前, 卵细胞的DNA含量已达1.83C,
基本上已通过细胞周期的S期, 进入G2期, 为与处
于G2期的精细胞融合做好了准备。但与烟草不同
的是, 枸杞卵细胞在开花时就已开始合成DNA了,
在卵细胞发育中缓慢而持续地合成DNA。另外,
烟草卵细胞在即将到达的花粉管的刺激下可提前
开始DNA的合成。但在枸杞去雄花中, 没有花粉
管的刺激卵细胞也可合成DNA, 不过仅合成约1/5
就明显减缓, 暗示枸杞卵细胞合成DNA的过程需
要花粉管的刺激才可继续进行。两种植物都表现
出花粉管刺激其卵细胞合成DNA, 但在烟草中是
刺激开始, 而枸杞中是刺激过程。
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