全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 4期, 2010年 4月 365
不同氮素水平下小黑麦旗叶蛋白质差异表达
李晶, 吉彪, 商文楠, 陈龙涛, 魏玲, 魏湜*
东北农业大学农学院, 哈尔滨 150030
提要: 在不同氮素水平下, 研究小黑麦叶片蛋白质差异表达, 进行MALDI-TOF-MS和生物信息学分析。找到 7个差异表
达蛋白, 即与蛋白质合成和信号传导相关的蛋白、与清除自由基有关的酶、与叶绿体的发育和代谢有关蛋白、与植物碳代
谢有关的酶、与氮素同化有关的酶。氮素对植物生长发育、物质代谢和信号传导影响全面, 从蛋白点的鉴定分析来看, 功
能蛋白是其影响的重点。
关键词: 小黑麦; 差异表达; 双向电泳; 氮素
Protein Differential Expression under Different Nitrogen Application Treat-
ment in Triticale
LI Jing, JI Biao, SHANG Wen-Nan, CHEN Long-Tao, WEI Ling, WEI Shi*
College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Abstract: Proteins differential expression under different nitrogen levels were analyzed in triticale. Seven differ-
entially expressed proteins were found by MALDI-TOF-MS and bioinformatics analysis, including proteins
related with protein synthesis and signal transduction, enzyme related with elimination of the free radical, pro-
teins related with chloroplast growth and metabolism, enzyme related with carbon metabolism, and enzyme
related with nitrogen assimilation. Nitrogen had overall effects on growth, substance metabolism and signal
conduction of plant. Identification and analysis on protein spots showed that the emphasis of its influence was
functional proteins.
Key words: triticale; differential expression; dimensional electrophoresis; nitrogen
收稿 2010-01-25 修定 　2010-02-08
资助 黑龙江省农业委员会项目(GC05B708)。
* 通讯作者(E-mail: weishi5608@163.com; Tel: 0451-55191599)。
蛋白双向电泳已成为蛋白质检测和分析的一
种强有力的生化手段(孙一丁等 2008)。双向电泳
技术在生物及非生物胁迫蛋白质组研究上应用较
多, 在栽培措施引起的蛋白差异表达上还未见报
道。氮素是植物营养中重要的不可缺少的营养元
素, 其存在于植物体蛋白质的结构中。氮也是叶绿
素的重要组分, 通过影响叶绿素的含量来影响作物
的光合物质生产。氮是一些酶的组成部分, 参与植
物的多种生化过程。增施氮肥能促进植株体内氮
代谢, 成为作物产量提高的重要措施。本文设计了
不同的氮素水平, 通过双向电泳技术, 旨在找出小
黑麦叶片中与氮素代谢相关的蛋白点, 并鉴定这些
蛋白点的生物功能, 以此探讨氮素对小黑麦叶片光
合作用影响的分子遗传机制。这对于小黑麦蛋白
质组学研究, 充分发挥小黑麦生产潜力具有理论和
实践指导意义。
材料与方法
试验选用小黑麦(triticale)品种 ‘东农 5305’和
‘东农 96026’ [小黑麦是由小麦属(Triticum)和黑麦
属(Secale)物种经属间有性杂交和杂种染色体加倍
而人工结合成的新物种, 其英文名称是由小麦属名
的字头和黑麦属名的字尾组合而成, 1935年起已成
为国际上的通用名称], 于2007~2008年在东北农业
大学香坊实验实习基地进行。4月 5日播种, 8月
3日收获。设 4个施氮水平: 0 (N0)、75 (N75)、
150 (N150)和 225 kg·hm-2 (N225), 3次重复, 8行区, 5
m行长。种肥磷酸二铵 247 kg·hm-2 (P2O5 113 kg)、
氯化钾 190 kg (K2O 121 kg)和尿素总量的 1/2与种
子分层施下, 其余 1/2尿素作为追肥于拔节期结合
浇水开沟追施于土壤。苗期镇压一次, 其他管理措
施同一般大田。
采用美国 Bio-Rad公司等点聚焦系统、垂直
板电泳系统; IPG胶条及载体两性电解质购自Bio-
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Rad公司, 分子试剂购自 Sigma公司。
样品制备及蛋白质浓度测定: 参照Damerval等
(1986)的方法提取旗叶总蛋白质并略有改动, 即
TCA/丙酮法: 于开花期取 3 g小黑麦旗叶, 洗净吸
干水分, 于冰浴的研钵中加入液氮研磨至细粉, 装
入 10 mL离心管中, 加入 5倍体积 10% TCA-丙酮
(–20 ℃预冷、含 20 mmol·L-1的DTT), –20 ℃沉淀
1 h, 4 ℃12 000 r·min-1离心20 min, 沉淀悬浮于5 mL
冷丙酮中, –20 ℃过夜, 离心去丙酮, 重复3次, 直到
蛋白呈纯白色。蛋白用裂解缓冲液溶解, 参考
Bradfofd (1976)的方法测定浓度。
第一向等电聚焦电泳(IEF): 等电聚焦在 20 ℃
下自动进行, 每胶条限流 50 μA, 参数为主动水化
50 V 14 h; 250 V 0.5 h; 1 000 V 1 h (快速); 8 000 V
4 h (线性); 72 000 V 1 h (快速); 500 V。
胶条平衡: 胶条先在平衡液I (0.375 mol·L-1 Tris-
HCl pH 8.8, 6 mol·L-1脲, 20%甘油, 2% SDS, 2%
DTT)中于摇床平衡 15 min, 再在平衡液 II (2.5%
碘乙酰胺替换 2% DTT, 其余组分同平衡液 I)中平
衡 15 min。
第二向SDS-PAGE: 封胶凝固后进行垂直电泳,
电流设定: 20 mA 40 min; 40 mA 6~7 h。
染色: 染色方法参考 Coomassie-G250考染法
(Candiano等 2004)。
统计分析与双向图谱的软件分析: 染色后凝胶
用UMAX Power Look 2100XL扫描仪获取图像, 扫
描参数设置为 256阶灰度、300 dpi透射扫描。扫
描后的图像用 Bio-Rad公司的 PDQuest 8.0.1软件
分析处理, 同一个处理的3张胶组成一个重复组, 选
择重复性好的差异表达蛋白质点进行质谱鉴定。
蛋白质点质谱分析及数据检索: 将切好的蛋白
点做好标记和记录, 送至上海卓康生物公司进行酶
解和MALDI-TOF-MS分析, 获得的蛋白质肽段质
量数据在 http://www.matrixscience.com中检索找
到相匹配的蛋白, 得到的蛋白数据在 http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.expasy.ch/sport/或
http://predictome.bu.edu/等数据库中进行检索, 找到
其相应功能及相关信息。
实验结果
1 小黑麦叶片蛋白质双向电泳 IPG胶条筛选
预先制备小黑麦‘东农5305’叶片蛋白质样品,
采用 pH 3~10和 pH 4~7、17 cm长的 IPG胶条进
行双向电泳。从图 1中可以看出, 小黑麦叶片蛋白
在 pH 3~10的双向电泳图谱上主要集中在酸性区
域, 右侧斑点较少, 中间斑点相对集中, pH值范围
分布为 3~7, 而碱性区域pH值7~10之间蛋白很少,
几乎没有明显可见的蛋白点, 说明小黑麦叶片蛋白
大部分属于酸性蛋白; pH 4~7、17 cm长的 IPG
胶条的双向电泳图谱清晰度高、蛋白点分布好。
故在试验中选择 pH 4~7、17 cm长的 IPG胶条进
行双向电泳。
2 小黑麦旗叶蛋白质的差异表达
如图2所示, 经对开花期小黑麦叶片氮含量测
定的研究基础上选择开花期氮含量差异显著的N0
和N150两处理, 每个处理制备 3次, 经软件分析两
图 1 不同 pH范围的小黑麦叶片蛋白双向电泳图谱
Fig.1 2-DE maps of different pH ranges of triticale leaves proteins
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图 2 不同处理旗叶蛋白质双向电泳图谱及表达量上调蛋白放大图片
Fig.2 2-DE maps and enlarged pictures which increased protein expression levels of flag leaf protein in different treatment
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品种处理及对照蛋白图谱, 并将蛋白表达量上调点
图谱放大。经电泳图谱比较分析可知, ‘东农5305’
在等电点 4~7、分子量 14.4~116.0 kDa范围内, 可
识别约846个蛋白点, 蛋白质大部分分布在分子量
24~63 kDa、等电点 4.3~6.2之间(图 2-a), 通过软
件自动匹配, 处理中出现了15个较对照表达量上调
的蛋白点(图 2-b)。‘东农 96026’在等电点 4~7、
分子量 20~95 kDa范围内, 可识别约843个蛋白点,
蛋白质大部分分布在分子量 28~62 kDa、等电点
4.5~6.4之间(图2-c), 通过软件自动匹配, 处理中出
现了12个较对照表达量上调的蛋白点, 蛋白质点在
2D胶上的重复性为: 沿等电聚焦方向偏差为(3.39±
0.24) mm (n=3), 沿 SDS-PAGE方向偏差为(3.61±
表 1 旗叶差异表达蛋白质点的质谱鉴定结果
Table 1 Identification of differential protein spots by ESI-Q MS/MS and database searching of flag leaf
蛋白点序号 待测蛋白的分子量 待测蛋白的等电点 鉴定的蛋白质
1 37.02 5.73 生长调节蛋白
2 49.84 5.72 锰过氧化物岐化酶
3 33.41 6.10 叶绿体 30S核糖体蛋白
4 32.82 5.27 细胞质动力蛋白
5 31.34 5.66 抗坏血酸过氧化物酶
6 33.26 5.03 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶
7 47.10 6.87 谷氨酰胺合成酶
序号中 1、2、3 分别来自 ‘ 东农 5 3 0 5 ’ 差异点中的 5、9、1 0; 序号中 4、5、6、7 分别来自 ‘ 东农 9 6 0 2 6 ’ 差异点中的 4、
5 、 6 、 1 1 。
0.36) mm (n=3) (图 2-d)。
3 差异表达蛋白质的质谱鉴定
选择显著上调表达(3倍以上)的 7个差异蛋白
质点进行MALDI-TOF-MS鉴定, 旗叶差异表达蛋
白质点的质谱鉴定结果见表１。基于质谱鉴定结
果, 可将鉴定出的 7个叶片蛋白归为以下几类: (1)
与蛋白质合成和信号传导相关的蛋白: 生长调节蛋
白和细胞质动力蛋白; (2)与清除自由基有关的酶: 锰
过氧化物岐化酶和抗坏血酸过氧化物酶; (3)与叶绿
体的发育和代谢有关蛋白: 叶绿体30S核糖体蛋白;
(4)与植物碳代谢有关的酶: 1,5-二磷酸核酮糖羧化
酶 /加氧酶大亚基; (5)与氮素同化有关的酶: 谷氨
酰胺合成酶。
讨　　论
生长调节蛋白可以刺激细胞的生物活性, 调节
植物生长发育, 高表达的生长调节蛋白与烟草的生
长发育相关(崔红等 2008); 细胞质动力蛋白, 是信
号传递过程中重要的酶, 在植物生长发育和抗逆反
应中起重要作用。本研究中生长调节蛋白和细胞
质动力蛋白在施氮处理后, 表达量上调, 表明适当
增加氮肥供应, 促进了植物生长, 同时植物叶片传
递信号的动力来源充足, 信号传递畅通, 使植物抗
逆性得到提高。
超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的金属抗氧
化酶。根据辅基部位结合的不同分为四类: 锰超氧
化物歧化酶(Mn-SOD), 铁超氧化物歧化酶(Fe-
SOD), 铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)和镍超氧
化物歧化酶(Ni-SOD)。锰过氧化物岐化酶催化过
氧化物自由基歧化, 使细胞免于被过氧化物自由基
所破坏, 具有抗衰老作用。小麦的氮素营养与其后
期旗叶衰老密切相关, 增施氮肥能够改善活性氧清
除酶的代谢合成, 维持较高的生理活性(李春喜等
2002); 对于易衰型棉花品种, 适期适量增施氮肥,
通过减轻细胞的膜质过氧化程度, 在延缓衰老、改
善叶片的光合特性中具有较重要的作用(张海娜等
2008)。
抗坏血酸过氧化物酶是利用抗坏血酸为电子
供体的H2O2的清除剂, 提高植物体内抗氧化酶活性
和增强抗氧化代谢的水平是提高植物抗逆性的有效
途径之一(孙卫红等 2005)。APX能提高氧化耐受
性的作用已在许多植物中有报道(Wang等 2002)。
大豆 cAPXs研究中观察到, APX的转录、翻译和
翻译后调控可能增强农作物抵抗环境胁迫的能力
(Caldwell等1998)。本研究中N150处理小黑麦旗叶
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清除自由基有关酶的高量表达表明适当增施氮肥有
缓解叶片衰老, 延长光合功能的重要生理作用。
就高等植物而言, 叶绿体蛋白质数目占其蛋白
总数的 10%~25% (Van Wijk 2000), 叶绿体的核糖
体蛋白与叶绿体内的蛋白质合成有关, 叶绿体基质
是光合碳同化和叶绿体内多种物质合成代谢的关键
场所。利用 2-DE结合质谱和 Edman测序等技术
鉴定出了菠菜叶绿体基质核糖体30S和50S亚基蛋
白(Yamaguchi和Subramanlan 2000); 在河南与福建
生态区烟叶中所鉴定出的差异蛋白中也发现30S核
糖体蛋白(崔红等 2008)。本研究中叶绿体核糖体
蛋白的高表达, 也表明适当增施氮肥促进了蛋白质
的合成和运转, 利于蛋白质含量提高, 这与施氮处
理蛋白质含量高的结果相一致。
1,5-二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶是光合作用
中决定碳同化速率的关键酶(Wang和Xun 2005)。
施氮量增加, 植株将更多的叶氮投入到电子传递体
和羧化系统中, 进一步优化了叶氮分配, 增加了电
子传递和羧化能力, 与其具有较高的光合能力是一
致的(雷鸣等 2009)。本研究中施氮 150 kg·hm-2较
0 kg·hm-2的 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶表达
量上调, 活性的能力增强, 这说明适当增施氮小黑
麦的碳同化效率增加, 光合作用加强。这也与旗叶
光合速率和叶绿素荧光参数的变化趋势一致。
GS是处于氮代谢中心的多功能酶, GS活性增
强可提高细胞内多种氮代谢酶和部分糖代谢酶效应
(Kleinhofs和Warmer 1991; 黄勤妮等 1995)。本
试验中中氮水平(N150)下谷氨酞胺合成酶活性增加,
表达量上调, GS活性的提高, 可带动氮代谢途径运
转增强, 促进氨基酸的合成和转化, 进一步验证了
适当施氮可提高氮代谢运转能力。
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