全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (1): 85~90 8 5
收稿 2010-09-15 修定 　2010-09-27
资助 国家自然科学基金( 3 0 4 6 0 0 1 6 )和云南省教育厅基金
(07Z11860, 09Y0145)。
* 通讯作者(E-mail: gongming63@163.com; Tel: 0871-
5 5 1 6 5 1 6 )。
机械刺激诱导的烟草悬浮细胞一氧化氮产生途径及其与Ca2+和钙调素的关系
柯学 1,2, 李忠光 2,3,4, 刘娴 2,3,4, 龚明 2,3,4,*
1中国农业大学水利与土木工程学院, 北京 100083; 云南师范大学 2生命科学学院, 3生物能源持续开发利用教育部工程研
究中心, 4云南省生物质能与环境生物技术重点实验室, 昆明 650092
摘要: 通过提高摇床转速对烟草细胞施加机械刺激(MS)可诱导其胞内一氧化氮(NO)的快速产生和一氧化氮合酶(NOS)活性
的提高, 这种MS诱导的NO产生可被NO清除剂 cPTIO和NOS抑制剂 L-NMMA显著抑制。此外, Ca2+螯合剂 EGTA、质
膜Ca2+通道阻断剂 La3+、胞内Ca2+通道拮抗剂钌红, 以及钙调素抑制剂CPZ和TFP预处理均不同程度地抑制了机械刺激
诱导的烟草细胞NO的产生, 而机械刺激过程中钙调素活性显著上升并与NOS活性和NO含量的变化相一致。这些结果暗
示着(类)NOS酶催化的精氨酸依赖途径可能是机械刺激诱发烟草细胞NO产生的主要途径, Ca2+/CaM可能通过调节(类)NOS
活性来调控NO的产生。
关键词: 机械刺激; 一氧化氮; 一氧化氮合酶; 钙; 钙调素; 烟草细胞
Pathways of Mechanical Stimulation-Induced Nitric Oxide Production and Their
Relationship with Ca2+ and Calmodulin in Tobacco (Nicotiana tobacum L.) Sus-
pension Culture Cells
KE Xue1,2, LI Zhong-Guang2,3,4, LIU Xian2,3,4, GONG Ming2,3,4,*
1College of Water Conservancy & Civil Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2School of Life Sciences,
3Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy, Ministry of Education, 4Key Labo-
ratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology, Yunnan Province, Yunnan Normal University, Kunming 650092,
China
Abstract: Application of mechanical stimulation (MS) on tobacco (Nicotiana tobacum) suspension culture cells
led to rapid production of intracellular nitric oxide (NO) and increased activity of nitric oxide synthase (NOS),
but this MS-induced NO production could be significantly inhibited by the NO scavenger cPTIO and NOS
inhibitor L-NMMA. In addition, the Ca2+ specific chelator EGTA, plasma membrane Ca2+ channel blocker La3+,
intracellular Ca2+ channel antagonist ruthenium red, and the calmodulin inhibitors chlorpromazine and trifluop-
erazine pretreatments all led to the inhibition of the MS-induced NO production to some extent; on the other
hand, the MS treatment raised calmodulin activity in the tobacco cells, being consistent with the change of NO
content and NOS activity. All this results suggested that the arginine-dependent pathway catalyzed by NOS-like
enzyme could be main source for this MS-induced NO production and Ca2+/calmodulin was involved in the
regulation of the NO production by control of NOS activity.
Key words: mechanical stimulation; nitric oxide; nitric oxide synthase; calcium; calmodulin; tobacco suspen-
sion cells
机械刺激(mechanical stimulation, MS)作为一
种普遍存在而又易被忽视的环境因子, 其形式包括
风吹、雨淋、触摸、创伤、重力、土壤阻力
等。植物对机械刺激的反应包括感触性反应
(thigmonastic response), 向触性反应(thigmotropic
response)和接触形态建成(thigmomorphogenesis)等
(Braam 2005; Telewski 2006; Chehab等 2009; 张斐
斐等2010)。在植物对机械刺激的感受和响应过程
中, Ca2+、活性氧和一氧化氮(nitric oxide, NO)等信
号分子都参与了机械刺激过程的信号转导, 而且各
条信号转导途径可能通过相互作用或交谈(crosstalk)
植物生理学报8 6
形成一个信号转导网络, 但具体机制仍不清楚(Braam
2005; Scippa等2008; Chehab等2009; 李忠光和龚明
2008, 2009, 2010; 李忠光等 2009; 张斐斐等 2010)。
NO作为信号分子广泛参与植物生长发育的调
控和对逆境胁迫的响应。目前的研究认为植物细
胞内NO的产生途径主要有两条: 硝酸/亚硝酸还原
酶(nitrate/nitrite reductase, NR/NiR)途径和类一氧化
氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)途径(Crawford
2006; Arasimowicz和 Floryszak-Wieczorek 2007;
Besson-Bart等 2008a, b)。此外, Ca2+也是植物细
胞在各种环境刺激下引发的一个重要第二信使
(McAinsh和Pittman 2009), 而NO的产生和NOS活
性可能受Ca2+/CaM调控(Besson-Bart等 2008a, b)。
各种机械刺激如风吹、触摸、离心处理都能引起
植物细胞内 Ca2+浓度的迅速升高(Knight等 1991;
Trewavas和Knight 1994; Haley等1995; Xiong等2004)
和NO含量的增加(Garces等 2001)。NO被认为是
控制细胞 Ca 2+稳态的重要信号分子(Lamotte等
2006; Wang等 2009)。而Ca2+对植物细胞内NO的
积累也具有调控作用, 拟南芥在病原菌侵染中钙调
素类似蛋白(camodulin-like proteins)参与了钙信号
对NO累积的调控(Tsai等 2007; Ma等 2008), 表明
植物细胞中存在 Ca2+和NO的信号交谈。
有关机械刺激能否诱发植物细胞内NO的积
累也存在争议。一些实验表明NO参与了细胞对
机械刺激的信号转导(Pedroso等 2000; Garces等
2001; Jih等2003), 但不清楚其产生途径; 也有实验
表明机械刺激不能诱导 N O 的产生( O r o z c o -
Cardenas和 Ryan 2002; Gould等 2003)。而机械刺
激过程中NO的产生与Ca2+/CaM的相互作用及其关
系也未见报道。针对上述问题, 本试验利用我们实
验室建立的机械刺激实验体系(李忠光和龚明2008,
2009, 2010), 研究了机械刺激诱导的烟草悬浮细胞
NO的产生途径及其与 Ca2+/CaM的关系。
材料与方法
烟草(Nicotiana tobacam L.)细胞的培养和继代
参见李忠光等(2005)的方法。继代 4 d的悬浮细胞
用于下列实验。
培养 4 d的烟草悬浮细胞从转速为110 r·min-1、
26 ℃的摇床中转到转速分别为 130、150、170、
200 r·min-1、26 ℃的另一组摇床中进行机械刺激
处理 30 min或者 60 min (NO动态曲线、CaM和
NOS活性测定实验)。对照组始终培养在转速为
110 r·min-1、26 ℃的摇床中。
在机械刺激处理前10 min, 分别用400 μmol·L-1
cPTIO [2- (4-ca rboxyphenyl) -4,4,5 ,5 - te t ra -
methylimidazoline-1-oxyl-3-oxide]、500 μmol·L-1 L-
NMMA (NG-methyl-L-arginine)、100 μmol·L-1 NaN3
及不同浓度的CaCl2、EGTA [ethylene glycol-bis(2-
aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid]、
LaCl3、RR (ruthenium red, 钌红)、CPZ (chlorprom-
azine)和TFP (trifluoperazine)预处理烟草悬浮细胞,
然后按下述方法测定 NO 含量。
在生理指标测定中, 用Archer (1993)的方法测
定NO含量, 用王成彬等(1996)和Chandok等(2003)
的方法测定NOS活性, 用我们实验室以前的方法
(黄号栋等 2003)测定CaM活性, 用Bradford (1976)
的方法测定蛋白质含量。
所有实验重复不少于3次, 每次实验的测定重复
2次, 数据均为平均值 ±标准误。利用 SPSS (13.0)
对实验数据进行统计分析和 t检验。
实验结果
1 机械刺激可诱导烟草悬浮细胞迅速产生NO
在 110 r·min-1下正常培养的烟草悬浮细胞中,
NO含量为 1 506.7 nmol·g-1(FW), 当转入 130、
150、170和200 r·min-1下进行机械刺激处理30 min
后, 其NO含量与对照相比分别增加 21.9%、85.4%、
111.2%和 134.2% (图 1)。
此外, 在150 r·min-1的机械刺激处理过程中, 细
胞中的NO产生量迅速上升, 30 min时到达峰值, 为
2 865.5 nmol·g-1 (FW), 比对照增加 112.3%, 20~60
min内细胞NO的含量极显著高于对照(图 2)。而
用 400 μmol·L-1的NO清除剂 cPTIO在机械刺激处
理前预处理烟草细胞10 min, 显著抑制机械刺激诱
导的NO的产生(图2), 表明机械刺激能诱导烟草细
胞中NO的产生, 且NO产生的幅度与机械刺激强
度成正比(图 1)。
2 一氧化氮合酶(NOS)在机械刺激诱导的NO产生
中起重要作用
对NOS活性测定的结果表明, 烟草细胞NOS活
柯学等: 机械刺激诱导的烟草悬浮细胞一氧化氮产生途径及其与Ca2+和钙调素的关系 8 7
NMMA (Wendy等 2001)预处理的结果表明, 500
μmol·L-1的L-NMMA可极显著抑制经150 r·min-1的
机械刺激诱导的细胞NO的产生。此时细胞NO含
量为1 465.3 nmol·g-1 (FW), 即细胞中由机械刺激诱
导产生的NO近90%可被L-NMMA抑制(图4)。另
一方面, 100 μmol·L-1 NR抑制剂NaN3 (Yamasaki和
Sakihama 2000)预处理烟草细胞对机械刺激诱导的
NO产生无显著影响(图4), 表明NOS是机械刺激诱
导的烟草细胞中 NO产生的主要酶源。
图 1 不同强度机械刺激处理 30 min对烟草悬浮细胞
NO积累的影响
Fig.1 Effects of different strength of mechanical stimulation
(MS) for 30 min on NO production in tobacco
suspension culture cells
**P<0.01, 与未经MS 处理的对照相比。
图 2 150 r·min-1机械刺激下烟草悬浮细胞NO含量动态
变化及其 cPTIO预处理的效应
Fig.2 Time course of NO production in tobacco suspension
culture cells during mechanical stimulation (MS) at 150
r·min-1 and effect of cPTIO pretreatment
图 3 150 r·min-1机械刺激下烟草悬浮细胞NOS活性
动态变化
Fig.3 Change of NOS activity in tobacco suspension cells
during mechanical stimulation (MS) at 150 r·min-1
性随机械刺激处理时间延长而迅速增加, 由0 min的
10.2 nmol·mg-1 (蛋白)·min-1的基础活性上升到30 min
时的 23.0 nmol·mg-1 (蛋白)·min-1, 增加了 125.5%。
30 min后NOS活性有小幅回落, 但仍极显著高于
对照(图3), 这与机械刺激诱导的NO产生的动态变
化相吻合(图 2)。
NOS和NR/NiR是植物细胞内NO产生的两条
主要酶学途径(Arasimowicz和Floryszak-Wieczorek
2007; Besson-Bart等 2008a, b)。用NOS抑制剂 L-
图 4 L-NMMA (500 μmol·L-1)和NaN3 (100 μmol·L-1)预处
理对机械刺激(MS, 150 r·min-1, 30 min; 未MS的为对照)
诱导的烟草悬浮细胞NO产生的影响
Fig.4 Effects of L-NMMA (500 μmol·L-1) and NaN3 (100
μmol·L-1) pretreatment on MS-induced NO production in
tobacco suspension cells under 150 r·min-1 for 30 min
**P<0.01, 与未经MS 处理的对照相比。
植物生理学报8 8
3 Ca2+/CaM参与机械刺激诱导的烟草细胞NO产
生的调控
用不同浓度的Ca2+专一螯合剂EGTA (Gong等
1998)预处理烟草细胞10 min, 发现2 mmol·L-1 EGTA
对机械刺激诱导的NO的产生量无显著影响; 随着
EGTA浓度增加, NO产生量迅速减少, 4~10 mmol·L-1
EGTA处理能显著抑制MS诱导的细胞NO的产生
(图 5-A)。0.5~10 mmol·L-1的外源Ca2+预处理对机
械刺激诱导的细胞 NO的产生量无显著影响, 而
50~100 mmol·L-1的 Ca2+显著抑制机械刺激诱导的
细胞NO的产生(图5-B), 这种情况可能是高浓度的
Ca 2+对细胞的毒害作用所致(White和 Broadley
2003)。
质膜Ca2+通道阻断剂La3+和胞内Ca2+通道拮
抗剂RR(钌红)能分别抑制胞外Ca2+流入胞内及胞
内 Ca2+库的 Ca2+进入细胞质(Gong等 1998)。La3+
和RR预处理能抑制机械刺激诱导的烟草细胞NO
的产生, 且在 0~1 mmol·L-1范围内, 随着La3+和RR
浓度增加, 抑制程度逐渐加剧(图 6)。
CPZ和TFP是2种常用的CaM拮抗剂(李忠光
图 5 外源 EGTA (A)和Ca2+ (B)预处理对机械刺激(150 r·min-1, 30 min)诱导的烟草细胞NO产生的效应
Fig.5 Effects of exogenous EGTA (A) and Ca2+ (B) pretreatment on the MS-induced NO production in
tobacco suspension cells under 150 r·min-1 for 30 min
*P<0.05, **P<0.01, 与未经MS处理的对照相比。
图 6 La3+和RR预处理对机械刺激(150 r·min-1, 30 min)
诱导的烟草细胞NO产生的效应
Fig.6 Effects of La3+ and ruthenium red (RR) on the MS-
induced NO production in tobacco cells under
150 r·min-1 for 30 min
和龚明 2009, 2010)。用 CPZ和TFP预处理烟草细
胞, 结果显示 10 μmol·L-1的 CPZ和 TFP对机械刺
激诱导的细胞NO的产生量有显著抑制, 分别减少
39.5%和 41.1%。而70~100 μmol·L-1的CPZ和TFP
能减少机械刺激诱导的细胞NO产生量的91.4%和
90.6% (图 7)。
同时, 对CaM活性动态变化的测定也表明, 烟
草细胞在机械刺激过程中 CaM活性迅速上升, 30
min至峰值, 比对照高出 26.1% (图 8)。
讨　　论
1 机械刺激诱导烟草悬浮细胞NO的快速产生及
其可能的途径
机械刺激能否诱导植物细胞产生NO尚存在
争议(Garces等 2001; Orozco-Cardenas和 Ryan
柯学等: 机械刺激诱导的烟草悬浮细胞一氧化氮产生途径及其与Ca2+和钙调素的关系 8 9
图 8 150 r·min-1机械刺激下烟草悬浮细胞CaM活性
动态变化
Fig.8 Change of calmodulin activity in tobacco suspension
cells under mechanical stimulation at 150 r·min-1
2002; Gould等 2003), 这可能是由于刺激方式及实
验材料不同而导致的差异。本实验中, 150、170
和200 r·min-1的机械刺激显著提高烟草悬浮细胞的
NO产生量, 并且NO的量与机械刺激强度呈正相
关(图 1)。而NO的清除剂 cPTIO (Tun等 2001)能
显著抑制150 r·min-1机械刺激处理对NO产生的诱
导作用(图2), 这表明机械刺激的确能诱导烟草悬浮
细胞快速产生 NO。
精氨酸依赖途径和亚硝酸依赖途径是细胞NO
产生的两个主要来源, 但植物中精氨酸依赖性的
NO产生机制仍然不清楚, 原因在于没有分离到真
正的 NOS酶, 在植物中可能只存在(类)NOS酶
(Crawford等 2006; Besson-Bard等 2008a, b)。在
本实验中, 机械刺激处理可显著诱导细胞(类)NOS
活性的快速上升(图3), 而NOS抑制剂L-NMMA预
处理则能显著减少烟草细胞由机械刺激诱导的NO
产生量, 但NR抑制剂NaN3对此影响不显著(图4),
暗示机械刺激诱导烟草悬浮细胞产生NO的主要途
径是(类)NOS酶催化的精氨酸依赖途径。
2 Ca2+/CaM对机械刺激诱导烟草悬浮细胞产生NO
的调控作用
Ca2+在植物细胞对机械刺激信号的感受与转
导中有重要作用(Braam 2005; Scippa等 2008;
McAinsh和Pittman 2009)。机械刺激能使胞质Ca2+
浓度迅速升高(Knight等 1991), 能使触摸诱导基因
在 10~30 min内表达量增加上百倍, 而这些触摸诱
导基因有CaM和CaM相关蛋白基因(Braam和Davis
1990), 由此机械刺激信号将转化为Ca2+信号并引发
下游信号事件和生理生化响应(Braam 2005; Scippa
等2008)。也有报道植物中NOS活性受Ca2+和CaM
调控(Crawford 2006; Besson-Bart等 2008a)。本实
验中, 调控细胞内的Ca2+含量和CaM活性能够影响
机械刺激诱导的NO的产生量(图 5、6), 机械刺激
处理过程中细胞CaM活性变化与NO含量及NOS
活性变化有类似性(图 8、2、3), 暗示着机械刺激
可能通过Ca2+/CaM调控细胞内的(类)NOS酶, 来实
现对 NO产生量的调控。
综上所述, (类)NOS酶催化的精氨酸依赖途径
可能是机械刺激诱发烟草细胞NO产生的主要途
径, Ca2+/CaM可能通过调节(类)NOS活性来调控
N O 的产生。
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诱导的烟草细胞NO产生的效应
Fig.7 Effects of TFP and CPZ pretreatment on MS-induced
NO production in tobacco cells under 150 r·min-1 for 30 min
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