全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 11期, 2010年 11月1164
收稿 2010-06-04 修定 2010-08-18
资助 国家林业局 “94 8” 项目(2 007 -4 -07 )。
* 通讯作者(E-mail: wliqing06@sina.com; Tel: 010-62338294)。
培养条件对澳蜡花 ‘ 舞后 ’ 试管苗玻璃化的影响
孟会, 李青 *, 潘会堂
北京林业大学园林学院, 国家花卉工程技术中心, 北京 100083
提要: 以澳蜡花 ‘舞后 ’的试管苗为试验材料, 研究了培养条件对其试管苗玻璃化的影响。结果表明, 当以1/2MS为基本培
养基, 附加 0.2 mg·L-1 6-BA、0.01 mg·L-1 IBA、4%蔗糖、0.8%琼脂并在以塑料封口膜为封口材料的三角瓶内培养时, 试管
苗的增殖系数较高, 玻璃化率较低。
关键词: 澳蜡花; 试管苗; 玻璃化
Effects of Tissue Culture Conditions on Vitrification of in vitro shoots of
Chamelaucium uncinatum Schauer ‘Dancing Queen’
MENG Hui, LI Qing*, PAN Hui-Tang
National Floriculture Engineering Research Center, College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing 100083,
China
Abstract: Chamelaucium uncinatum ‘Dancing Queen’ were chosen as materials to study the effects of differ-
ent conditions of tissue culture on vitrification. Results showed the optimum medium for proliferation and
overcoming vitrification was 1/2MS medium supplemented with 0.2 mg·L-1 6-BA, 0.01 mg·L-1 IBA, 4% sugar
and 0.8% agar, using conical flask closed with good permeability sealing material.
Key words: Chamelaucium uncinatum; in vitro shoots; vitrification
澳蜡花又称风蜡花, 为桃金娘科(Myrtaceae)澳
蜡花属多年生常绿灌木, 是原产于澳大利亚的重要
野生木本花卉(李长潇2006), 现已逐渐成为世界流
行的新型高档木本切花, 在我国主要用于节日切
花。澳蜡花花后无果实, 且种子细小(Lamont 1986),
难以进行播种繁殖, 生产上主要是扦插繁殖, 但繁
殖速度慢且生根率较低(周玉珍等 2006)。因此, 建
立澳蜡花的组织培养快繁体系, 对缩短生产周期、
扩大生产规模具有重要意义。
澳蜡花组培过程中试管苗经常发生玻璃化现
象, 其中品种 ‘舞后 ’(‘Dancing Queen’)的玻璃化现
象比较严重, 成为其组培快繁的限制因素。影响试
管苗玻璃化的因素主要有基本培养基(秦静远等
2004)、植物生长调节剂(周菊华等 1990)、蔗糖
(Langford和Wainwright 1987)、琼脂(饶雪琴和张
曙光 2005)、封口材料(李娅莉等 2004)等。其中
培养基中无机盐含量, 尤其是NH4+浓度, 对玻璃苗
的产生影响较为显著(张翠玉和廖晴1991); 不同植
物生长调节剂种类与浓度所产生的玻璃化比率不同
(李瑶等 1997; 赵佐敏 2005); 蔗糖浓度、琼脂含量
均与玻璃化苗发生率呈负相关(张燕玲等1997); 透
气性较好的封口材料有利于克服玻璃化现象的发生
(高疆生等 2001)。因此, 我们以 ‘舞后 ’试管苗为
试材, 探讨了培养条件与其玻璃化发生程度的关系,
为建立有效微繁体系提供依据。
材料与方法
1 澳蜡花(Chamelaucium uncinatum Schauer) ‘舞
后 ’ 试管苗的获得
在启动培养基(1/2MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1
mg·L-1 IBA+3%蔗糖 +0.6%琼脂)上接种的外植体
经过 7~9 d开始萌发小芽, 4~5周后长成丛生芽, 将
其剪切成为大小均等的小苗(高约 1.5 cm), 进行各
种处理, 每种处理 10瓶, 每瓶 3株, 重复 3次。处
理 60 d后统计玻璃化率。未进行说明的培养基中,
蔗糖浓度为 3%, 琼脂用量为 0.6%。培养温度为
技术与方法 Techniques and Method
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(24±2) ℃, 光照强度为 30~40 μmol·m-2·s-1, 光照时
间为 12 h·d-1。
2 影响澳蜡花 ‘ 舞后 ’ 试管苗玻璃化的因素分析
2.1 基本培养基 通过单因素随机区组试验, 选取
MS、1/2MS、B 5、H、HB 共 5 种基本培养基,
分别附加 1.0 mg·L-1 6-BA和 0.1 mg·L-1 NAA。
2.2 细胞分裂素 将 0.2、0.5、1.0、2.0 mg·L-1
的 6-BA和 0.2、0.5 mg·L-1的KT分别附加 0.1 mg·L-1
IBA进行配比试验, 比较不同细胞分裂素的影响。
2.3 IBA浓度 将4种不同浓度的 IBA分别附加0.2
mg·L-1 6-BA进行配比试验, 比较不同浓度的IBA的
影响。
2.4 蔗糖浓度 设蔗糖浓度为 1%、2%、3%和
4%, 培养基为MS+0.2 mg·L-1 6-BA+0.02 mg·L-1 IBA,
琼脂用量为 0.6%, 比较蔗糖浓度的影响。
2.5 琼脂用量 在培养基中分别添加 0.5%、0.6%、
0.7%和 0.8%的琼脂, 培养基为MS+0.2 mg·L-1 6-
BA+0.02 mg·L-1 IBA, 蔗糖浓度为 3%, 比较琼脂用
量的影响。
2.6 封口材料与培养容器 采用牛皮纸加玻璃纸为
封口材料的三角瓶、塑料封口膜为封口材料的三
角瓶以及用塑料盖密封的玻璃罐头瓶作为培养容器
进行培养, 培养基为MS+0.2 mg·L-1 6-BA+0.02 mg·L-1
IBA。比较封口材料与培养容器的影响。
3 计算与分析
增殖系数和玻璃化率按照以下方法进行计算,
增殖系数 =增殖后的苗数 /原接种苗数; 玻璃化率
(%)=玻璃化的苗数 /总苗数 ×100。
结果与讨论
1 基本培养基对澳蜡花‘舞后’试管苗玻璃化的影响
由表 1可知, 以HB为基本培养基, 试管苗无
玻璃化现象发生, 但增殖系数低, 为0.29, 几乎不生
长, 最后死亡。以MS、B5为基本培养基时, 试管
苗玻璃化程度严重, 基部茎叶肿胀并出现透明现
象。在 H基本培养基中, 试管苗的玻璃化程度为
中度, 基部茎叶肿胀未出现透明现象, 但在该培养
基中的试管苗玻璃化率在 5种基本培养基中最高,
为 85.37%。选择 1/2MS为基本培养基, 玻璃化苗
率较低, 为 16.81%, 同时其玻璃化程度较轻, 基部
茎叶微肿胀, 且试管苗增殖效果较好, 增殖系数为
3.29, 而且植株健壮。MS基本培养基属于富集元
素平衡培养基, B5属于高硝酸钾含量培养基, H为
中等无机盐含量的培养基(王关林和方宏筠 2002),
这可能是因为MS和B5中无机盐含量较高, 较易诱
发澳蜡花 ‘舞后 ’发生玻璃化现象, 在HB中试管苗
死亡率较高, 可能是HB中无NH4+, N元素均以NO3-
状态存在的原因。
2 细胞分裂素对澳蜡花 ‘舞后 ’试管苗玻璃化现象
的影响
由表 2可知, 在澳蜡花 ‘舞后 ’的组织培养过
程中, 使用细胞分裂素KT, 试管苗发生玻璃化的比
率与程度均低于同浓度 6-BA。当 6-BA浓度由 0.2
mg·L-1增加到 2 mg·L-1时, 试管苗发生玻璃化的比
率随之升高, 由 16.25%上升到 76.15%, 并且玻璃
化程度随之加重。在 6-BA浓度为 0.2 mg·L-1时, 玻
璃化苗率最低为 16.25%, 玻璃化程度较轻, 基部枝
叶出现微肿胀, 但试管苗生长健壮, 增殖系数较高
(5.10)。这与Bornman和Vogelmann (1984)、杨雪
等(2009)对云杉和红叶石楠试管苗玻璃化的研究结
果一致。Kevers等(1984)指出, 培养基中的细胞分
裂素容易导致玻璃化, 而且玻璃化苗发生百分率和
细胞分裂素浓度成正相关, 因为玻璃苗一般表现为
茎节短、分枝多的特性, 这可能与细胞分裂素的主
表 1 基本培养基对澳蜡花 ‘舞后 ’试管苗玻璃化的影响
Table 1 Effect of different basic media on vitrification of C. uncinatum ‘Dancing Queen’
培养基 增殖系数 玻璃化率 /% 玻璃化程度 生长状况
MS 3.42Aa 73.76Bb 重: 基部茎叶肿胀并透明 长势较弱, 叶鲜绿
1/2MS 3.29Ab 16.81Dd 轻: 基部茎叶微肿胀 植株健壮, 叶深绿
B5 2.71Bc 33.56Cc 重: 基部茎叶肿胀并透明 植株健壮, 叶鲜绿
H 1.43Cd 85.37Aa 中: 基部茎叶肿胀 植株矮小, 叶绿色
HB 0.29De 0Ee 无玻璃化现象 几乎无生长现象, 最后死亡
表中不同大小写字母分别表示同列数据在 0.01 和 0.05 水平有差异显著性, 下表同此。
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要作用: 促进芽的分化, 打破顶端优势, 促进腋芽发
生相关(蔡祖国等 2005)。
3 IBA对澳蜡花 ‘舞后 ’试管苗玻璃化现象的影响
由表 3可知, 随着 IBA浓度的升高, 试管苗发
生玻璃化的比率上升, 当其浓度为 0.01 mg·L-1时,
玻璃化率为13.62%, 当浓度升高至0.2 mg·L-1时, 玻
璃化率升高为 39.85%。试管苗玻璃化程度也发生
了相应的变化, 在 IBA浓度为 0.01 mg·L-1和 0.05
mg·L-1时玻璃化程度较轻, 基部枝叶发生微肿胀现
象, 其增殖系数相对较高; 浓度为 0.1 mg·L-1和 0.2
mg·L-1时, 玻璃化程度为中度, 基部枝叶肿胀现象
较为明显; IBA浓度为 0.2 mg·L-1时的增殖系数显著
低于其他浓度, 为 4.32。
4 蔗糖浓度对澳蜡花 ‘ 舞后 ’ 玻璃化现象的影响
由表4的结果可知, 随着培养基中蔗糖浓度的
增加, ‘舞后 ’试管苗的玻璃化率显著降低。当蔗
糖浓度为 3%时, 玻璃化率为 16.25%, 玻璃化程度
为中度, 基部茎叶肿胀未出现透明现象。而当蔗糖
浓度为1%、2%时, 试管苗玻璃化程度严重, 基部茎叶
肿胀并伴随透明现象发生, 玻璃化率分别为 52.84%、
34.63%。因此, 当蔗糖浓度较低时, 玻璃化率高,
玻璃化程度较重。当其浓度增加至 4%时, 玻璃化
率极显著低于其他处理, 玻璃化程度较轻, 基部茎
叶微肿胀, 然而其生长势一般, 叶为黄绿色, 但试管
苗增殖系数与其他处理无显著差异, 均较高。这与
王小敏等(2006)、马济民(2009)对薄荷、桉树试
管苗玻璃化的研究结果一致, 这可能是因为蔗糖对
调节培养基的渗透压起着决定性的作用, 适当的提
高蔗糖浓度, 可以降低培养基的渗透压, 从而使玻
璃化苗率降低。
表 2 细胞分裂素对澳蜡花 ‘舞后 ’试管苗玻璃化的影响
Table 2 Effect of cytokinin on vitrification of Chamelaucium uncinatum ‘Dancing Queen’
细胞分裂素 浓度 /mg·L-1 增殖系数 玻璃化率 /% 玻璃化程度 生长状况
6-BA 0.2 5.10Aa 16.25Dd 轻: 基部茎叶微肿胀 植株健壮, 叶绿色
0.5 4.00Bb 34.01Cc 中: 基部茎叶肿胀 枝叶簇生状, 叶绿色
1.0 3.01Cc 69.01Bb 重: 基部茎叶肿胀并透明 枝叶簇生状, 低矮, 叶绿色
2.0 2.28Dd 76.15Aa 重: 基部茎叶肿胀并透明 枝叶簇生状, 未伸长, 低矮, 叶绿色
KT 0.2 0.28Ff 0Ff 无玻璃化现象 均无生长现象, 后死亡
0.5 0.44Ee 12.57Ee 轻: 基部茎叶微肿胀 66.7%无生长现象, 其余生长缓慢, 叶绿色
表 4 蔗糖浓度对澳蜡花 ‘舞后 ’试管苗玻璃化的影响
Table 4 Effect of sucrose concentration in culture medium on vitrification of C. uncinatum ‘Dancing Queen’
蔗糖浓度 /% 增殖系数 玻璃化率 /% 玻璃化程度 生长状况
1 5.17Aa 52.84Aa 重: 基部茎叶肿胀并透明 植株生长势一般, 叶黄绿色
2 5.29Aa 34.63Bb 重: 基部茎叶肿胀并透明 植株生长健壮, 叶绿色
3 5.10Aa 16.25Cc 中: 基部茎叶肿胀 植株生长健壮, 叶绿色
4 5.33Aa 9.85Dd 轻: 基部茎叶微肿胀 植株生长势一般, 叶黄绿色
表 3 IBA浓度对澳蜡花 ‘舞后 ’试管苗玻璃化的影响
Table 3 Effect of IBA concentration in culture medium on vitrification of C. uncinatum ‘Dancing Queen’
IBA浓度 /mg·L-1 增殖系数 玻璃化率 /% 玻璃化程度 生长状况
0.01 5.21ABab 13.62Dd 轻: 基部茎叶微肿胀 植株生长较健壮, 叶绿色
0.05 5.33Aa 14.32Cc 轻: 基部茎叶微肿胀 植株生长较健壮, 基部木质化, 叶绿色
0.10 5.10Bb 16.25Bb 中: 基部茎叶肿胀 植株生长健壮, 叶绿色
0.20 4.32Cc 39.85Aa 中: 基部茎叶肿胀 植株生长较健壮, 叶绿色
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5 不同琼脂用量对澳蜡花 ‘舞后 ’玻璃化现象的影
响
由表 5可知, 当琼脂用量为 0.6%时, 玻璃化
率为 16.25%, 玻璃化程度为中度, 基部茎叶肿胀未
出现透明现象。当琼脂用量为 0.5%时, 玻璃化率
显著高于其他处理, 为 36.51%, 玻璃化程度严重,
基部茎叶肿胀并有透明现象。当琼脂用量升高至
0.8%时, 玻璃化率显著低于其他处理, 为5.10%, 玻
璃化程度较轻, 增殖系数显著高于其他处理, 这与
丰锋等(2001)对芦荟试管苗玻璃化现象研究结果一
致, 因为培养容器内相对空气湿度提高容易产生玻
璃化苗(蔡祖国等 2005)。
6 封口材料与培养容器对澳蜡花 ‘舞后 ’玻璃化现
象的影响
由表6可知, 使用不同的封口材料与培养容器
对试管苗玻璃化现象的发生有不同的影响。使用
罐头瓶作为培养容器, 由于其透气性差, 玻璃化率
表 5 琼脂用量对澳蜡花 ‘舞后 ’试管苗玻璃化的影响
Table 5 Effect of agar concentration in culture medium on vitrification of Chamelaucium uncinatum ‘Dancing Queen’
琼脂用量 /% 增殖系数 玻璃化率 /% 玻璃化程度 生长状况
0.5 4.86Cc 36.51Aa 重: 基部茎叶肿胀并透明 4 种情况生长状况相近,
0.6 5.10Bb 16.25Bb 中: 基部茎叶肿胀 植株生长健壮, 叶绿色
0.7 5.10Bb 11.39Cc 中: 基部茎叶肿胀
0.8 5.67Aa 5.10Dd 轻: 基部茎叶微肿胀
表 6 封口材料与培养容器对澳蜡花 ‘舞后 ’试管苗玻璃化的影响
Table 6 Effect of sealing material on vitrification of Chamelaucium uncinatum ‘Dancing Queen’
处理 增殖系数 玻璃化率 /% 玻璃化程度
牛皮纸 +塑料纸 5.10Aa 16.25Bb 中: 基部茎叶肿胀
封口膜 4.97Aa 9.65Cc 轻: 基部茎叶微肿胀
罐头瓶 4.56Bb 36.54Aa 重: 基部茎叶肿胀并透明
最高为 36.54%, 玻璃化程度严重, 基部茎叶肿胀并
出现透明现象。使用牛皮纸加塑料纸为封口材料
的三角瓶, 其玻璃化率有所降低为 16.25%, 玻璃化
程度中度。使用塑料封口膜为封口材料的三角瓶,
透气性好, 加强了与外界空气的流通, 有效的降低
了容器中的相对湿度, 玻璃化率显著低于其他处理
为 9.65%, 玻璃化程度也较轻, 同时其增殖系数较
高为 4.97。这与李云等(1996)对珠美海棠试管苗
玻璃化的研究一致。因为试管苗生长期间, 要求足
够的气体交换, 气体交换的好坏取决于外植体生长
量、瓶内空间、培养时间和瓶盖种类等(王爱芝
等 2009)。
综合考虑澳蜡花 ‘ 舞后 ’ 试管苗的玻璃化现
象、增殖情况及生长状况, 克服玻璃化苗的适宜培
养基为以 1/2MS为基本培养基, 附加 0.2 mg·L-1 6-
BA、0.01 mg·L-1 IBA、4%蔗糖和 0.8%琼脂并在
以塑料封口膜为封口材料的三角瓶内培养。
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