全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (11): 1037~1042 1037
收稿 2012-07-23　　修定 2012-09-28
资助 “十二五 ”国家高技术研究发展计划 “ 8 6 3 ”重大项目
(2011AA10A202-2和2011AA09070402)、“十二五”国家科
技支撑计划(2011BAE06B04)、青岛科技计划基础研究项
目(10-3-4-4-7-jch)和海洋公益项目(201005032-2)。
* 通讯作者(E-mail: wshw8@yahoo.com.cn; Tel: 0532-88967423)。
环境条件对芽孢杆菌B-9987菌株防御酶诱导效应的影响
高伟1,2, 田黎1,2,*, 张久明2, 郑立1, 崔志松1, 史振平2
1国家海洋局第一海洋研究所, 山东青岛 266061; 2青岛科技大学生物系, 山东青岛 266042
摘要: 研究室内外条件下, 海洋芽孢杆菌不同处理物对番茄防御酶系的诱导作用。分别使用不同浓度芽孢杆菌B-9987发酵
液和无细胞滤液喷施番茄植株, 于室内外两种环境条件下养殖, 测定了处理11 d内番茄5种防御酶的变化趋势。两种处理诱
导抗性结果显示, 在两种环境条件下处理植株苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶
(CAT)较空白对照植株酶活性均有不同程度增加。除超氧化物歧化酶(SOD)外, 室内环境较室外更利于B-9987菌株处理液
对番茄防御酶系的诱导作用发挥; 相同环境条件下, 发酵液的处理诱导活性较强。B-9987菌株对番茄防御酶系有较好的诱
导作用, 但诱导作用的发挥受环境条件影响明显。
关键词: 防御酶; 海洋芽孢杆菌; 诱导抗性
Inducing Effect of Defense Enzyme Activities by Bacillus marinus B-9987 under
Different Environmental Conditions
GAO Wei1,2, TIAN Li1,2,*, ZHANG Jiu-Ming2, ZHENG Li1, CUI Zhi-Song1, SHI Zhen-Ping2
1First Institute of Oceanography, Qingdao, Shandong 266061, China; 2Biology Department, Qingdao University of Science &
Technology, Qingdao, Shandong 266042, China
Abstract: The comparative study on the activities of defense enzymes was obtained in tomato leaves under dif-
ferent environmental conditions. The tomato plants were sprayed with B-9987 fermentation broth and cell free
filtrate. The activities of the 5 defense enzymes in tomato leaves were assayed. The trend of the enzymes activi-
ties in 11 days was analysed in the experiment. According to the result, the B-9987 extracts had an inducing ef-
fect on phenylalanine ammonia lyase (PAL), polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD), catalase (CAT) in
tomato leaves. The indoor treatment of the enzymes [except superoxide dismutase (SOD)] showed higher effect
comparing outdoor treatment. The inducement of fermentation broth was much better than the cell filtrate. The
result showed that the B-9987 extracts had an inducing effect on the defense enzymes in tomato. The environ-
mental conditions greatly affect the inducement of B-9987 extracts.
Key words: defense enzymes; Bacillus marinus; induced resistance
在已有植物诱导抗性研究表明化学因子和微
生物的刺激都可以诱导植物抗病性产生或增强这
种作用(Koike等2001), 并且植物抗病性的增强往
往与木质素积累、病程相关蛋白表达密切相关, 而
木质素、病程相关蛋白等生化物质的变化源于磷
酸戊糖途径及乙醛酸循环等代谢途径的调节(Dong
等2003)。因而, 参与这些生理过程调节的关键酶
如苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,
PAL)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、多酚氧化
酶(polyphenol oxidase, PPO)等的活性的变化是反
映植物的抗病能力强弱较直接和有效的指标。近
年来, 有较多学者对植物诱导抗性进行了相应研
究, 包括拟康氏木霉胞外多糖(郭敏等2005)、拮抗
内生细菌B20-006菌株(高增贵等2007)、利迪链霉
菌A02 (刘宇等2007)和化学因子如苯并噻重氮、
茉莉酸甲酯(麻宝成和朱世江2006)等。在已有研
究中多考虑对植物是否产生诱导抗性, 对于影响生
防菌株药效发挥的重要因素——环境条件很少考
虑。因而研究海洋芽孢杆菌在不同环境条件下对
番茄的诱导抗性具有一定的理论和实际意义。本
课题组所筛选海洋芽孢杆菌B-9987对番茄植株显
示出了较好的诱导抗性作用(高伟等2010)。本文
研究报告 Original Papers
植物生理学报1038
旨在研究不同环境条件下海洋芽孢杆菌提取液对
番茄防御酶活性的影响, 以初步揭示海洋芽孢杆
菌的生防机制及环境条件对该菌株发挥诱导抗性
作用的影响, 探索生防制剂不稳定的本质原因, 为
生防制剂的研发提供一定的理论依据。
材料与方法
1 供试植物
番茄(Solanum lycopersicum Miller): T2-69, 购
自青岛农业科学院, 在营养钵内培养至5~6片真
叶。分别在室内、室外进行诱导处理。
2 诱导菌株及诱导物的制备
海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus) B-9987菌株,
专利保藏号为CGMCC No. 2095, 即将研制成具有
自主产权的新型生物杀菌剂。制备B-9987培养液
用于番茄植物诱导抗性处理, 方法参见何培青等
(2001)的研究。
3 番茄植株的处理及生长条件
研究不同生长条件下, B-9987培养液对番茄
防御酶系的诱导作用, 番茄植株分别生长于室内
和室外两种条件, 主要环境参数见表1。对番茄植
株进行如下处理, 处理a为喷施B-9987菌株无细胞
滤液的2倍稀释液, 处理b为喷施活菌原液2倍稀释
液, CK为喷施未接菌培养液的2倍稀释液。喷施
后, 分别于1、3、5、7、9、11 d, 选取5株番茄植
株选取处理及对照叶片各1 g, –20 ℃冻存。
表1 处理期番茄生长主要环境参数
Table 1 Environment parameters during tomato growth
实验周期/d
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
室外 温度/℃ 21~26 21~27 23~29 20~24 19~32 20~28 20~22 20~24 21~26 22~30 22~25
降水/mm 0 0 166 19 0 0 0 4 0 0 0
室内 温度/℃ 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
湿度/% 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60

4 酶活性测定
4.1 酶液提取
将处理叶片4 ℃保存, 放入预冷研钵中, 加入
3.0 mL硼酸缓冲液冰浴条件下研磨成匀浆, 转入
2.0 mL离心管, 5 479×g、4 ℃离心20 min, 上清液
即为所需的酶粗提取液(Lamb和 Rubery 1976),
于–78 ℃超低温冰箱保存。
4.2 蛋白质含量的测定
采用考马斯亮蓝G-250法, 用牛血清蛋白配制
成0~1 000 μg·mL-1标准溶液制作标准曲线, 参照
Bradford (1976)方法。
4.3 过氧化物酶(POD)的活性测定
以愈创木酚作底物, 配制含18 mmol·L-1愈创
木酚的磷酸缓冲液(0.1 mol·L-1, pH 5.8)。取20 μL
酶粗提液, 与3 mL上述磷酸缓冲液混合, 30 ℃水
浴中平衡l min后, 加50 μL双氧水溶液起始酶反
应, 以每分钟OD值的增加值来表示酶活性, 方法
参照Moerschbacher等(1988)的方法, 每样品重复
3次。
4.4 多酚氧化酶(PPO)活性测定
将酶粗提液用0.05 mol·L-1硼酸缓冲液(pH 8.8)
稀释5倍后, 以邻苯二酚为底物。取50 μL 酶粗提
液加入试管中, 与2.95 mL磷酸缓冲液(0.1 mol·L-1,
pH 6.8; 含0.02 mol·L-1邻苯二酚)充分混合, 于30 ℃
水浴中反应2 min后, 记录398 nm处的OD值, 以不
加酶液而加相同体积提取缓冲液为空白对照。以
每分钟OD值变化0.01为1个酶活性单位, 每样品重
复3次(李靖等1991)。
4.5 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
超氧化物歧化酶以不加酶液照光后测得的
OD值为还原率100%, 抑制50% NBT光还原的酶量
为1个酶活性单位, 测试管添加酶液量为50 μL, 参
照张治安等(2004)的方法, 每样品重复3次。
4.6 过氧化氢酶(CAT)活性测定
用0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液(pH 7.0)将0.6 mL
30%过氧化氢溶液稀释到100 mL做底物溶液, 以
OD值降低0.0436的酶量为1个酶活性单位。在240
nm处以提取缓冲液为参比测定吸光度, 若吸光度
高伟等: 环境条件对芽孢杆菌B-9987菌株防御酶诱导效应的影响 1039
的降低幅度超过0.01, 则在计算主值时需减去此值,
每样品重复3次(贾显禄1997)。
4.7 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定
以0.1 mL 0.01 mol·L-1 L-苯丙氨酸为底物, 在
40 ℃水浴中反应15 min后, 于冰浴中终止反应, 测其
在290 nm处的吸光值, 以不加酶液的为空白对照测
吸光值。以每小时使OD值变化0.01的酶量定为1个
酶活性单位, 每样品重复3次(Koukol和Conn 1996)。
5 试验数据处理
采用SPSS 11.5统计软件对酶活性数据进行差
异显著性分析。
实验结果
1 不同环境下番茄的过氧化氢酶活性变化
室内条件下(图1-A), 处理a、b在5 d过氧化氢
酶 (CAT)活性达最大值 , 分别为对照酶活性的
1.39、1.76倍。其中处理b酶活性显著高于对照酶
活性(P<0.05)。
在室外条件下(图1-B)处理a、b对植株过氧化
氢酶的影响较小, 第1天处理a、b植株酶活性与对
照酶活性相差较大, 分别是对照酶活性的1.54、
1.59倍, 其余取样时间段内与对照的相近。总体
图1 不同处理条件下番茄叶片CAT活性的变化
Fig.1 Changes of catalase activity in tomato leaves under different conditions
A: 室内生长条件; B: 室外生长条件。下图同此。
来看, 2种处理对CAT的室内诱导效果较好, 且处理
b的诱导效果高于处理a。
2 不同环境下番茄的苯丙氨酸解氨酶活性变化
处理a、b对苯丙氨酸解氨酶(PAL)的室内诱
导结果如图2-A, 处理b诱导效果最好, 分别在3 d和
7 d出现2个酶活性高峰, 是对照酶活性的4.13倍和
3.22倍, 处理a植株在1~9 d酶活性也高于对照植株
酶活性, 显示了良好的诱导作用。在室外条件下
(图2-B), 处理a、b对PAL的诱导效果较差, 在整个
处理过程中与对照酶活性相近, 且在5、7 d处理植
株酶活性低于对照的。实验结果表明, 在3 d之内
无论室内还是室外, 海洋芽孢杆菌对番茄PAL都有
较好的诱导作用, 酶活性均显著高于对照酶活性
(P<0.05)。但维持时间较短, 3 d之后开始下降, 室
内环境下7 d还会再上升, 室外环境下PAL酶活性
则表现持续下降, 虽然9~11 d稍有上升, 但总体水
平低于对照。
3 不同环境下番茄的过氧化物酶活性变化
处理a、b的室内实验结果(图3-A)显示, 在11 d
中, 处理与空白植株过氧化物酶(POD)的变化趋势
相近, 在1~3 d酶活性上升, 3~11 d缓慢下降, 处理b
在整个取样时间段内酶活性虽高于对照, 但差异
不显著, 没有显示出明显的诱导活性。
在室外条件下(图3-B), 处理b在7 d出现峰值,
为对照酶活性的2.45倍。处理a植株酶活性与对照
酶活性差异不显著。
总体来看, 室内2种处理植株酶活性在大部分
时间内要高于对照, 但差异不显著, 诱导作用较
差。室外条件下, 处理b在7 d酶活性显著高于对照
的, 其余时间段内与对照酶活性相近。
4 不同环境下番茄的多酚氧化酶活性变化
在整个取样时间段内, 室内处理a、b酶活性
植物生理学报1040
均高于对照酶活性(图4-A)。处理b在7 d出现峰值
[5.16 U·mg-1(FW)·min-1], 是对照酶活性的2.54倍,
显著高于处理a (P=0.05)。
室外处理(图4-B)整个取样时间段内2种处理
植株酶活性对照差异较小, 处理b在3 d、5 d酶活
性低于对照。
图2 不同处理条件下番茄叶片PAL活性的变化
Fig.2 Changes of phenylalanine ammonialyase activity in tomato leaves under different conditions
图3 不同处理条件下番茄叶片POD活性的变化
Fig.3 Changes of peroxidase activity in tomato leaves under different conditions
图4 不同处理条件下番茄叶片PPO活性的变化
Fig.4 Changes of polyphenol oxidase activity in tomato leaves under different conditions
高伟等: 环境条件对芽孢杆菌B-9987菌株防御酶诱导效应的影响 1041
实验结果说明, 处理a、b在室内条件下对多
酚氧化酶有较好的诱导活性, 且处理b诱导作用要
大于处理a, 但在室外诱导作用较差。
5 不同环境下番茄的超氧化物歧化酶活性变化
室内处理a、b对超氧化物歧化酶(SOD)的影
响差异较大(图5-A)。处理b在3 d、7 d出现2个酶
活性峰, 分别为对照酶活性的1.85、1.53倍; 并且
在整个取样时间段内, 处理b植株酶活性均高于对
照的。处理a仅在3 d出现一个酶活性峰, 为对照酶
活性的1.44倍。
室外处理a、b植株酶活性差异较小, 并且波
动幅度较大, 在5 d时2种处理酶活性一度显著小于
对照的(P<0.05) (图5-B)
比较SOD室内外实验结果显示, 室内处理b对
SOD诱导作用要高于处理a; 室外2种处理诱导作
用较小, 且波动较大。
讨　　论
植物在与病原物长期的共同演化过程中, 针
对病原物的多种致病手段, 产生了复杂的抗病机
制, 如: 形态的、机能的和组织结构的抗病因素(即
物理抗病性因素)以及生理的和生物化学的因素
(即化学抗病性因素)。化学抗病因素中的植物次
生代谢产物尤其是其中的酚酸类、萜类和植保素
与植物的抗病性有密切关系, 含有这几类次生代谢
产物的植物往往具有较高的抗病性, 且抗病性的强
弱与次生代谢物的含量以及相关酶类的活性高低
成正比。参与抗病代谢相关的酶活性的高低在一
定程度上反映了植物抗病性的强弱, 如Kuć (1982)
发现黄瓜受诱导处理后体内过氧化物酶活性明显
提高; 麻宝成和朱世江(2006)对苯并噻重氮和茉莉
酸甲酯处理采后香蕉果实后, 发现两个处理均提高
了6种抗病相关酶的活性, 从而提高了香蕉对炭疽
菌的抗病性。课题组以往研究也发现B-9987处理
过的番茄植株, 由于诱导抗性的增加, 而提高了对
灰霉病和早疫病的抗性(高伟等2010)。
诱导植物抗病性为芽孢杆菌类生防菌株的防
病作用之一, 环境条件的变化经常导致其药效不
稳定, 国内外都较少见对植物诱导抗性受条件变
化原因的报道, 本文模拟生产上的温室(室内)和大
田(室外)栽培条件, 测试了番茄几种重要防御酶的
诱导活性的动态变化, 由于诱导抗性在生防制剂
防治病害的一个重要方面。本实验通过对比研究,
在较为恒定的温湿度条件下(室内), 菌株B-9987能
够对防御酶系产生较好的诱导作用, 但在温湿度
变化较为剧烈, 尤其是在3 d出现的降水, 会较为显
著的影响菌株诱导作用的实现, 导致相应诱导作
用的降低, 待环境条件稳定后, 各酶出现了相应的
活性增加的趋势。由此可见, 环境条件的剧烈变
化尤其是温度与湿度的变化, 会对番茄防御酶系
诱导活性的增加产生较大的影响。由于防御酶系
与植物抗病性有着显著的相关性, 因而表现出对
药效的影响(Fridovich 1978; 张树生等2006)。
海洋芽孢杆菌B-9987发酵液及无细胞滤液处
理番茄植株, 能够诱导番茄防御酶系活性的增加,
图5 不同处理条件下番茄叶片SOD活性的变化
Fig.5 Changes of superoxide dismutase activity in tomato leaves under different conditions
植物生理学报1042
在3~7 d为诱导活性的高峰, 其中SOD与PAL与其
他酶有较大差别, 出现两个明显的活性峰, 分别出
现在3 d和7 d, 但诱导活性的增加受环境条件的影
响较为明显, 室外情况下, 除超氧化物歧化酶外,
其余4个酶均表现出下降趋势, 仅CAT和POD在7 d
表现出了较明显的诱导活性, 其余酶活性趋近于
对照植株, 并且对防御酶系的诱导作用较差, 波动
较大。由于诱导抗性为生防菌株防病机制之一,
然而本研究发现番茄植株诱导抗性在室外条件下
出现较大波动且诱导作用不明显, 这可能是导致
生防菌株田间防效不稳定的原因之一。本研究培
养条件的主要差异在于温度和湿度, 在温度和湿
度变化剧烈的环境条件下, 会影响菌剂生防效果,
在温度条件稳定的环境条件下, 会更有利于防治
效果的发挥, 并且在使用9~11 d内, 能表现出较好
的诱导抗性作用, 对于菌剂的使用环境条件和使
用周期具有一定的指导意义。本研究也从另一方
面证明了与陆地习居菌差别较大的海洋芽孢杆菌
B-9987菌株良好的诱导抗性作用和应用前景。
参考文献
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