全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (10): 1743~1748　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0316 1743
收稿 2015-06-12　　修定 2015-09-10
资助 国家自然科学基金面上项目(31471908和31372104)。
* 通讯作者(E-mail: zhang-yuxi@163.com; Tel: 13793284502)。
牡丹PsWRKY基因的克隆和表达特性分析
石红梅, 战新梅, 管世铭, 盖树鹏, 刘春英, 张玉喜*
青岛农业大学生命科学学院, 山东省高校植物生物技术重点实验室, 山东青岛266109
摘要: 以课题组前期454高通量测序筛选到的类WRKY基因的部分cDNA序列为基础, 通过RACE扩增、测序和序列拼接获
得了牡丹1 091 bp PsWRKY基因全长cDNA, 包括5′ UTR区57 bp, 3′ UTR区92 bp, 编码框942 bp, 推测编码313个氨基酸序
列。生物信息学分析结果表明PsWRKY基因推测氨基酸序列中不具有信号肽序列, 暗示其不是分泌性蛋白; 在氨基酸序列
中存在核定位信号, 与亚细胞定位预测结果相一致, 这与其作为转录因子行使功能相关。与其他已知植物的WRKY蛋白的
同源性分析结果表明牡丹PsWRKY与葡萄VvWRKY的同源性最高, 为54%。实时定量PCR分析PsWRKY基因的表达特性结
果显示PsWRKY基因在初花期牡丹的叶片和心皮中转录水平较高。在人工低温处理的牡丹花芽的休眠解除过程中, Ps-
WRKY基因受低温诱导, 且转录水平在整个休眠进程中呈上调表达趋势。研究结果为进一步解析牡丹花芽的休眠解除的分
子机制提供理论依据。
关键词: PsWRKY; RACE; 生物信息学分析; 表达特性
Cloning and Expression Pattern Analysis of PsWRKY in Tree Peony (Paeonia
suffruticosa)
SHI Hong-Mei, ZHAN Xin-Mei, GUAN Shi-Ming, GAI Shu-Peng, LIU Chun-Ying, ZHANG Yu-Xi*
Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province, College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University,
Qingdao, Shandong 266109, China
Abstract: In this study, based on the partial cDNA sequence in tree peony obtained by 454 high-throughput se-
quencing, 1 091 bp PsWRKY full-length cDNA sequence was obtained using RACE amplification, including 57
bp 5′ UTR, 92 bp 3′ UTR. The coding fame of 942 bp encoded 313 amino acids. The results of bioinformatics
analysis indicated that PsWRKY has no signal peptide, which suggested that it was not a secreted protein. NLS
was found existing in the PsWRKY protein sequence, which was consistent with that of the prediction of sub-
cellular localization. The result of homology analysis indicated that the similarity between the PsWRKY and
VvWRKY was highest with that of 54%. The expression patterns were analyzed by using real-time quantitative
PCR, and the results showed that the transcript level of PsWRKY at the early stage of flowering in leaf and car-
pel were the highest. During the whole process of dormancy release after chilling treatments, PsWRKY was in-
duced by low temperature, and its transcript was up-regulated. All results would provide theoretical basis for
further analysis the molecular mechanism of dormancy release in tree peony.
Key words: PsWRKY; RACE; bioinformatics analysis; expression pattern
WRKY转录因子是近年来在植物中发现的新
的转录调控因子, 因其N端都至少含有1个WRKY
结构域而得名(Eulgem等2000)。WRKY基因参与植
物生长发育、衰老和多种代谢途径, 并且在调控
生物和非生物胁迫过程中起着重要作用(Lagacé和
Matton 2004)。目前已经从棉花(Xu等2004)、拟南
芥(Dong等2003)、油菜(Yang等2009)、橡胶树
(Wang等2013)、杨树(He等2012)和葡萄(Guo等
2014)等多种植物中克隆得到WRKY基因。到目
前国内外尚没有关于牡丹WRKY转录因子的研究
报道。
牡丹, 芍药科、芍药属的落叶小灌木, 因其丰
富的花型、花色被誉为“花中之王”。 本课题组
Gai等(2012, 2013)通过454测序得到了15 284个uni-
gene, 通过芯片分析筛选到差异表达的转录因子
176个, 其中包括WRKY转录因子。宋燕春(2013)
利用差减文库研究梨花芽休眠解除相关基因, 也
筛选到了WRKY转录因子。本研究在此基础上,
植物生理学报1744
利用RACE扩增得到WRKY完整cDNA序列, 并进行
了生物信息学分析, 利用实时定量分析了其在初
花期不同组织和花芽内休眠进程中的表达模式。
研究结果为进一步解析牡丹花芽内休眠解除的分
子机制提供基因资源, 为利用基因工程手段培育
早、晚花新品种奠定基础。
材料与方法
1 总RNA提取与cDNA合成
以生长健壮的4~5年生牡丹(Paeonia suffruti-
cosa Andr.)品种‘鲁荷红’ (‘Lu He Hong’, 由青岛农
业大学植物生理研究室提供)为材料, 取初花期的
牡丹各组织(根、茎、叶、花瓣、萼片、心皮和
雄蕊), 液氮速冻, –80 ℃冰箱保存备用。在2013年
11月份, 待日最低温度达到10 ℃时, 采用4 ℃冷库
处理牡丹花芽, 每隔7天移到温室(25 ℃, 16 h/8 h)
后取花芽, 立刻投入液氮速冻, –80 ℃保存备用。
共5个低温处理时间, 分别是0、7、14、21和28
d。采用原平皓 (天津 )生物技术有限公司的
EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取总RNA,
–80 ℃保存。
RACE-ready cDNA第一链合成按照SMART
RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech)步
骤进行。实时定量cDNA第一链的合成按照Re-
verse Transcriptase M-MLV (RNase H)试剂盒(Ta-
KaRa, 大连)说明书进行。反转录cDNA产物用
EASY dilution (TaKaRa, 大连)10倍稀释作为实时
定量PCR分析的模板, 分别设定3个生物学重复。
2 RACE扩增、实时定量PCR
根据454测序筛选得到的WRKY基因的部分
EST序列设计基因特异性引物(PsWRKY5′和Ps-
WRKY3′), 分别进行5′ 和3′ RACE扩增(表1)。
RACE扩增反应根据SMART RACE cDNA Amplifi-
cation Kit试剂盒(Clontech)步骤进行。
qPCR反应体系根据SYBR Premix Ex TaqTM
(TaKaRa, 大连)试剂盒配制, 反应在实时荧光定量
PCR仪(Agilent, Mx3000P)上运行。 20 µL PCR反
应体系为 2×SYBR Premix Dimer EraserTM 10 µL,
上下游引物(10 µmol·L-1)各0.75 µL, 2 µL cDNA模
板, 无菌水配齐, 每个样品3次技术重复。反应条
件为: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,
共45个循环。设置在延伸收集荧光信号。Actin为
内参, 数据分析采用2-∆∆CT法(Livak和Schmittgen
2001)。
3 生物信息学分析
测序结果用DNAMAN6.0软件进行序列分析
和拼接。利用NCBI在线软件(http://blast.ncbi.nlm.
nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_
TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)进行
Blast分析。用ProtParam程序(http://expasy.org/cgi-
bin/protparam)进行蛋白质分子量和等电点等性质
的预测。用TMPRED (http://www.ch.embnet.org/
software/TMPRED_form.htmL)进行蛋白质跨膜结
构域的预测。用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/ser-
vices/SignalP/)进行蛋白质信号肽的分析。利用
WOLFPSORT在线软件(http://www.genscript.com/
psort/wolf_psort.html)进行亚细胞定位预测。用
Clusta l W软件进行多序列比对。核定位信号
(NLS)预测利用NLS Mapper (http://nls-mapper.iab.
keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)进行。利
用MEGA 5.2软件中的邻接法(neighbor-joining)方
法构建系统发生树, 通过自举分析(bootstrap)作置
信度检验, 1 000次重复检验。
表1 引物、序列及退火温度
Table 1 Primers, sequences and their annealing temperatures
引物 序列(5→3) 退火温度/℃ 扩增目的
PsWRKY5 CGATGGTCACGCATGGAGAAAATATGG 65 5 RACE扩增
PsWRKY3 CCATATTTTCTCCATGCGTGACCATCG 65 3 RACE扩增
PsWRKYF GCTTCAAACCCTCCTCACCAAAC 55 PsWRKY实时定量
PsWRKYR CAGAAGCGTCGGTGGAGTTGAGT 55 PsWRKY实时定量
ActinF GAGAGATTCCGTTGCCCTGA 55 内参
ActinR CTCAGGAGGAGCAACCACC 55 内参
石红梅等: 牡丹PsWRKY基因的克隆和表达特性分析 1745
实验结果
1 PsWRKY基因的全长cDNA及推测编码的氨基酸
根据454测序筛选得到的部分WRKY片段, 经
RACE扩增, 5 RACE PCR产物为452 bp, 3 RACE
PCR产物为666 bp (图1)。测序后经序列拼接, 得
到1 091 bp WRKY基因全长cDNA, 包括5非编码区
(untranslated region, UTR) 57 bp, 3 UTR 92 bp, po-
lyA 25 bp, 完整的开放阅读框(open reading frame,
ORF) 942 bp, 利用DNAMAN软件推测编码313个
氨基酸(图2)。利用NCBI在线Blast结果发现其氨
基酸序列中123~182个氨基酸(E-value为1.15e-30)
序列为WRKY保守结构域。根据Gray等(2009)对
转录因子的命名方法, 该序列被命名为PsWRKY
(Genbank accession nunber: KR559041)。
2 PsWRKY基因生物信息学分析
PsWRKY基因的完整编码区推测编码313个氨
基酸。PsWRKY蛋白分子式为C1532H2353N433O512S13,
其分子量为35 439.7 Da, 理论等电点pI为6.24; 不
稳定指数为58.32 (40以下为稳定蛋白), 推测该蛋
白为不稳定蛋白; 丝氨酸的含量最高为15.34%, 其
次是苏氨酸占7.99%, 天冬氨酸占7%, 亮氨酸占
6.7%; 总平均疏水指数为–0.854, 表明其为亲水性
蛋白。信号肽预测结果表明其不具有信号肽序列,
表明其不是分泌性蛋白。在推测蛋白的第101~114
图1 PsWRKY 5-RACE和3-RACE扩增的电泳图
Fig.1 Electrophoresis result of PsWRKY RACE PCR
M: DL 2000 Maker; 5: 5 RACE扩增产物; 3: 3 RACE扩增产物。
图2 PsWRKY的全长cDNA序列与推测的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide sequence and putative amino acid sequence of PsWRKY
起始密码子ATG和终止密码子TGA斜体加粗表示; 双下划线标示出polyA尾; 单下划线标示核定位信号NLS; 波浪线标示PsWRKY保守
区即功能结构域。
植物生理学报1746
位存在核定位信号(RRGSYKRRKNSDSF)。亚细
胞定位预测结果表明其定位在细胞核, 这与其作
为转录因子执行功能相关。
3 PsWRKY蛋白序列的同源性分析与构建进化树
利用Clustal W软件将PsWRKY的推测的氨基
酸序列与其他已知植物的WRKY蛋白进行同源比
对, 结果表明, PsWRKY与其他已知植物的WRKY
相似性在34.06%~54.0%, 其中与葡萄的相似性最
高, 为54.0%, 与拟南芥同源性最低, 为34.06%。利
用MEGA5.2软件构建系统进化树, 结果如图3, Ps-
WRKY与葡萄VvWRKY70聚为一支, 然后与其他
木本植物的WRKY70蛋白形成分支, 最后与拟南
芥AtWRKY70蛋白聚在一起, 结果符合进化关系,
与同源性比对结果一致。
图5 PsWRKY在低温处理不同时间的牡丹花芽中的表达模式
Fig.5 The relative expression level of PsWRKY in flower buds
after different chilling times
图3 PsWRKY与其他物种WRKY蛋白的系统进化树分析
Fig.3 Phylogenetic tree of Paeonia suffruticosa PsWRKY and the known proteins in other plants species
麻风树: JcWRKY56; 胡杨: PeWRKY70; 甜橙: CsWRKY70; 可可树: TcWRKY70; 牡丹: PsWRKY; 葡萄: VvWRKY70; 桑树: Mn-
WRKY70; 陆地棉: GhWRKY7; 拟南芥: AtWRKY70。
图4 PsWRKY在初花期牡丹的不同组织中的表达模式
Fig.4 The relative expression level of PsWRKY in different
tissues at the early stage of flowering
4 PsWRKY基因的表达模式
荧光定量PCR分析PsWRKY基因在初花期牡
丹的根、茎、叶、花瓣、萼片、雄蕊和心皮中的
表达特性(图4), 结果表明PsWRKY基因在牡丹七种
不同组织中表达量不同。其中在叶中转录水平最
高, 其次为心皮, 在根、萼片、茎和花瓣中表达量
相对较低, 在雄蕊中转录水平最低, 其中在叶中Ps-
WRKY的表达量约是雄蕊中的306倍。
利用荧光定量PCR分析PsWRKY 基因在利用
人工低温处理解除牡丹花芽内休眠过程中的表达
水平(图5), 结果显示PsWRKY 基因的转录水平受
低温诱导, 且随着低温处理天数的增长, PsWRKY
基因的转录本呈上调趋势。
石红梅等: 牡丹PsWRKY基因的克隆和表达特性分析 1747
讨　　论
WRKY蛋白是植物中一类的转录因子, 含有
高度保守WRKY域和锌指结构蛋白。课题组前期
工作利用454高通量测序筛选到WRKY基因的部分
cDNA (Gai等2012), 本研究利用RACE扩增得到了
WRKY基因的全长cDNA, 推测的氨基酸如其他
WRKY蛋白一样, 其保守域由约60个氨基酸残基
组成, 靠近保守域N末端的7个保守的氨基酸残基
WRKYGQK, 为WRKY结构域的核心序列。在
推测蛋白序列的第101~114位存在核定位信号
(RRGSYKRRKNSDSF), 亚细胞定位预测结果其可
能定位在细胞核, 这与其作为转录因子执行功能
相一致。同源性比对与进化树结果相一致, 结果
基本符合进化关系。
WRKY转录因子参与植物多种重要生理生化
过程, 从而调控植物生长发育、胁迫应答等各种
重要生理过程。Eulgem等(2000)研究发现在与种
子萌发、叶片和根系生长、开花等发育相关的基
因中存在WRKY结构域。Rushton等(2010)最早发
现的野生燕麦中的WRKY家族成员ABF1和ABF2
参与了种子的萌发; 茄科中的转录因子ScWRKY1
被证明在植物胚形成过程中发挥重要作用(Lagacé
和Matton 2004); Luo等(2005)发现拟南芥中WRKY
转录因子参与了种子大小的形成, 特别是对拟南
芥中WRKY2的功能进行研究后, 发现其可以调控
种子萌发过程, 其缺失突变体对ABA存在着超敏
感, 并且发现WRKY2可以调节由ABA诱导的幼苗
生长停滞(Jiang和Yu 2009); 最近Kang等(2013)发现
拟南芥转录因子WRKY家族成员MINISEED可以
调控SYG1类蛋白SHB1的活性, 从而参与到种子发
育过程。本研究PsWRKY基因的组织表达分析表
明其在初花期牡丹品种‘鲁荷红’中主要在牡丹的
叶片和心皮中表达, 在其他器官中表达量非常低,
推测牡丹PsWRKY基因在种子发育和叶片生长过
程中起至关重要的作用。
近年来大量的实验结果证明WRKY与植物的
抵御逆境胁迫相关, 对其是否参与花芽休眠过程
知之甚少。如大麦WRKY38在冷害和干旱胁迫中
表达, 表明其在冷害和干旱胁迫的信号转导中起
调控功能(Maré等2004); Skinner (2009)发现小麦经
过低温驯化, 抗冷性增强, 在这个过程中有423个
基因表达发生变化, 17个基因上调至少5倍, 其中包
括转录因子CBF、WRKY以及锌指相关蛋白基
因。牡丹花芽休眠属于典型内休眠, 花芽的分化
基本在夏末结束, 但是芽体需要经历秋冬季才能
膨大萌动, 进而开花展叶。王宗正等(1996)研究发
现在解除牡丹花芽内休眠进程中低温起着关键作
用。Huang等(2008)发现牡丹品种‘鲁荷红’在人工
低温(4 ℃)处理18 d即可休眠解除。本研究发现在
人工低温处理的过程中, 牡丹PsWRKY基因呈上调
表达趋势, 该结果表明PsWRKY基因受低温诱导,
而且暗示了PsWRKY基因参与了牡丹花芽的休眠
解除。
参考文献
宋燕春(2013). 梨资源ISSR分析与花芽休眠解除研究[学位论文].
福州: 福建农林大学
王宗正, 韩莉, 孔兰静(1996). 低温处理对牡丹开花和展叶的影响.
园艺学报, 23 (3): 307~308
Dong J, Chen C, Chen Z (2003). Expression profiles of the Arabidop-
sis WRKY gene superfamily during plant defense response. Plant
Mol Biol, 51 (1): 21~37
Eulgem T, Rushton PJ, Robatzek S, Somssich IE (2000). The WRKY
superfamily of plant transcription factors. Trends Plant Sci, 5 (5):
199~206
Gai SP, Zhang YX, Liu CY, Zhang Y, Zheng GS (2013). Transcript
profiling of Paoenia ostii during artificial chilling induced dor-
mancy release identifies activation of GA pathway and carbohy-
drate metabolism. PLoS ONE, 8 (2): e55297
Gai SP, Zhang YX, Mu P, Liu CY, Liu S, Dong L, Zheng GS (2012).
Transcriptome analysis of tree peony during chilling requirement
fulfillment: Assembling, annotation and markers discovering.
Gene, 497 (2): 256~262
Gray J, Bevan M, Brutnell T, Buell CR, Cone K, Hake S, Jackson D,
Kellogg E, Lawrence C, McCouch S et al (2009). A recommen-
dation for naming transcription factor proteins in the grasses.
Plant Physiol, 149: 4~6
Guo C, Guo R, Xu X, Gao M, Li X, Song J, Zheng Y, Wang X (2014).
Evolution and expression analysis of the grape (Vitis vinifera L.)
WRKY gene family. J Exp Bot, 65 (6): 1513~1528
He H, Dong Q, Shao Y, Jiang HY, Zhu SW, Cheng BJ, Xiang Y
(2012). Genome-wide survey and characterization of the WRKY
gene family in Populus trichocarpa. Plant Cell Rep, 31 (7):
1199~1217
Huang X, Zhu W, Dai SL, Zheng GS, Zheng CC (2008). The involve-
ment of mitochondrial phosphate transporter in accelerating bud
dormancy release during chilling treatment of tree peony (Paeo-
nia suffruticosa). Planta, 228 (4): 545~552
Jiang W, Yu D (2009). Arabidopsis WRKY2 transcription factor medi-
ates seed germination and postgermination arrest of development
by abscisic acid. BMC Plant Biol, 9: 96
Kang X, Li W, Zhou Y, Ni M (2013). A WRKY transcription factor
植物生理学报1748
recruits the SYG1-like protein SHB1 to activate gene expression
and seed cavity enlargement. PLoS Genetics, 9 (3): e1003347
Lagacé M, Matton DP (2004). Characterization of a WRKY transcrip-
tion factor expressed in late torpedo-stage embryos of Solanum
chacoens. Planta, 219 (1): 185~189
Livak J, Schmittgen D (2001). Analysis of relative gene expression
data using real time quantitative PCR and the 2-∆∆CT method.
Methods, 25 (4):402~408
Luo M, Dennis ES, Berger F, Peacock WJ, Chaudhurv A (2005).
MINISEED3 (MINI3), a WRKY family gene, and HAIKU2
(IKU2), a leucine-rich repeat (LRR) KINASE gene, are regulators
of seed size in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 102 (48):
17531~17536
Maré C, Mazzucotelli E, Crosatti C, Francia E, Stanca AM, Cattivelli
L (2004). Hv-WRKY38: a new transcription factor involved in
cold- and drought-response in barley. Plant Mol Biol, 55 (3):
399~416
Rushton PJ, Somssich I E, Ringler P, Shen QJ (2010). WRKY tran-
scription factors. Trends Plant Sci, 15 (5): 247~258
Skinner DZ (2009). Post-acclimation transcriptome adjustment is a
major factor in freezing tolerance of winter wheat. Funct Integr
Genomics, 9: 513~523
Wang Y, Guo D, Li H L, Peng SQ (2013). Characterization of Hb-
WRKY1, a WRKY transcription factor from Hevea brasiliensis
that negatively regulates HbSRPP. Plant Physiol Biochem, 71:
283~289
Xu YH, Wang JW, Wang S, Wang JY, Chen XY (2004). Characteriza-
tion of GaWRKY1, a cotton transcription factor that regulates the
sesquiterpene synthase gene (+)-δ-cadinene synthase-A. Plant
Physiol, 135 (1): 507~515
Yang B, JiangYQ, Rahman MH, Deyholos MK, Kav NNV (2009).
Identification and expression analysis of WRKY transcription
factor genes in canola (Brassica napus L.) in response to fungal
pathogens and hormone treatments. BMC Plant Biol, 9: 68