全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (8): 747~758 747
收稿 2012-03-07　　修定 2012-07-09
资助 国家自然科学基金(30800082和30730078)、高等学校博士
学科点专项科研基金(200802251039)、中国博士后科学基
金(20090460868和201003409)、东北林业大学青年拔尖人
才支持计划(YTTP-1011-17)。
* 通讯作者 (E-mail: lyhshen@126.com; Tel: 0451-82191783)。
植物花青素合成相关的bHLH转录因子
杨鹏程, 周波, 李玉花*
东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨150040
摘要: 花青素是由类黄酮途径一个特异的分支合成的, 它不仅能够决定花和果实的颜色, 还能保护植物免受各种生物和非
生物胁迫损伤。bHLH转录因子广泛存在于植物中, 在植物的生长发育与形态建成、次级代谢产物的合成及对外界环境胁迫
应答中起着重要的调控作用。近年来, 随着大规模基因组测序技术和分子生物学的发展, 植物中越来越多的bHLH转录因子
得到鉴定。本文主要对花青素合成相关的bHLH转录因子及其在调节结构基因表达和花青素合成中的作用进行了综述。
关键词: bHLH; MYB; 花青素; 转录因子; 结构基因
The bHLH Transcription Factors Involved in Anthocyanin Biosynthesis in
Plants
YANG Peng-Cheng, ZHOU Bo, LI Yu-Hua*
College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: Anthocyanins are produced by a specific branch of the flavonoid pathway. They can not only
determine the colours of flowers and fruits but also defend plants against biotic and abiotic stresses. bHLH
transcription factors are widely distributed in plants and they play important roles in the regulation of plant
growth and development, synthesis of secondary metabolites and stress responses. With the development of
large-scale genome sequencing technologies and molecular biology, more and more bHLH transcription factors
are identified in plants. In this paper, bHLH transcription factors involved in anthocyanin biosynthesis and their
roles in the regulation of structural gene expression and anthocyanin synthesis are reviewed.
Key words: bHLH; MYB; anthocyanin; transcription factor; structural gene
花青素合成途径是植物中研究最为透彻的次
级代谢途径, 借助基因工程、遗传学和分子生物
学手段, 花青素合成调控的研究也取得重大突破,
如玉米(Zea mays)转座子的发现(Fedoroff 2001)以
及副突变、重复基因沉默引起的表观遗传现象的
阐释(Brink 1973; Ronchi等1995), 矮牵牛(Petunia
hybrida)共抑制的发现(Napoli等1990), 第一个植物
转录因子C1 (玉米R2R3-MYB)的获得(Paz-Ares等
1987)等等。人们对植物基因转录调控的认知大都
来自于对花青素合成调控的研究, 因此植物花青
素合成代谢途径及转录调控的研究具有重要意
义。
1 植物中的花青素
花青素(anthocyanidin)又称花色素, 是一类广
泛存在于植物中的水溶性天然色素, 在自然状态
下以花色苷(anthocyanin)形式存在(Harborne和Wil-
liams 2001)。花青素是植物体内重要的次级代谢
产物, 不仅能决定花、果实、蔬菜的颜色, 吸引昆
虫、动物作为传粉者和种子传播者(Bradshaw和
Schemske 2003), 还能保护植物免受紫外线损伤
(Sarma和Sharma 1999), 抵御低温(Christie等
1994)、干旱胁迫(Castellarin等2007)及微生物病原
体的侵害(Lorenc-Kukula等2005)。诱导植物花青
素合成的因素很多, 如各种环境胁迫, 包括UV光、
高强度光、高温、低温、干旱、伤害、病原菌感
染等, 营养缺乏, 糖类(Kubasek等1992; Batschauer
等1996; Weiss 2000; Winkel-Shirley 2002; Lepiniec
等2006; Solfanelli等2006)以及各种植物激素包括
细胞分裂素(cytokinins) (Deikman和Hammer
1995)、赤霉素(gibberellins, GAs) (Weiss等1995)、
植物生理学报748
茉莉酮酸(jasmonate, JA) (Shan等2009)等均可诱导
植物合成花青素。
花青素生物合成受两类基因的共同控制, 一
类是结构基因, 另一类是调节基因。结构基因编
码一系列生物合成酶 , 主要包括PAL、CHS、
CHI、F3H、F3’H、DFR、LDOX和UF3GT, 它们
组成了整个花青素合成途径(Holton和Cornish
1995)。调节基因编码转录因子, 转录因子能够通
过特异的DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用
激活或者抑制结构基因的时空表达, 从而调节花
青素的合成。参与调节花青素合成的转录因子主
要有3类: R2R3-MYB、bHLH和WD40蛋白, 大多
数植物花青素的合成是通过MYB-bHLH复合物或
者3类转录因子相互作用形成MYB-bHLH-WD40
复合物(MBW复合物)进行调节的(Gonzalez等
2008)。单子叶植物与双子叶植物花青素合成途径
的调控模式不同: 在单子叶植物玉米中, 花青素合
成结构基因均受MBW复合物调控; 而在双子叶植
物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中, 花青素合成结
构基因分为早期合成基因(early biosynthetic genes,
EBGs)和后期合成基因(late biosynthetic genes,
LBGs)。EBGs的表达不受MBW复合物调控, 包括
PAL、CHS、CHI、F3H, 而LBGs的表达受MBW
复合物调控, 包括DFR、LDOX、UFGT (Gonzalez
等2008)。
2 bHLH转录因子
bHLH (basic helix-loop-helix, 碱性螺旋-环-螺
旋)转录因子是植物中仅次于MYB转录因子的第
二大转录因子超家族, 拟南芥和水稻(Oryza sativa)
中分别有大约162和167个bHLH基因(Bailey等
2003; Li等2006), 葡萄(Vitis vinifera)中也至少有119
个bHLH基因(Jaillon等2007)。bHLH转录因子蛋白
结构中含有保守的bHLH基序, 每个bHLH基序约
由60个氨基酸残基组成, 含有两个亚功能区, 即位
于N末端的碱性氨基酸区域和C末端的HLH区域。
碱性区域负责与DNA顺式元件(E-box等)结合 ,
HLH区域之间则可依赖疏水氨基酸的相互作用形
成同型或异型二聚体(张全琪等2011)。
根据起源进化关系、序列相似性、DNA结合
元件以及功能的不同, 动物bHLH蛋白被分为六大
组(A~F), 分别含有20、12、7、1、3、1个家族
(Dang等1992; Ledent和Vervoort 2001)。植物bHLH
蛋白的分类方式与动物不同, 拟南芥和水稻中的
bHLH基因分别被分为21个家族和22个家族(Tole-
do-Ortiz等2003; Li等2006)。Pires和Dolan (2010)对
来自藻类、苔藓以及维管植物9个物种中的544个
bHLH基因进行了系统进化分析, 按照进化关系将
植物bHLH蛋白分为26个家族, 其中20个家族在苔
藓植物和维管植物的共同祖先中都已经出现, 另
外有6个家族在维管植物中得到进化。
植物bHLH转录因子能够参与调控多种生理
途径, 如花器官发育(Heisler等2001; Sorensen等
2003)、光形态建成(Leivar等2008)、表皮细胞命
运(毛状体发生、根毛形成) (Bernhardt等2003;
Zhang等2003; Morohashi等2007)、气孔开关(Serna
2007)、激素应答(Abe等2003; Lorenzo等2004; Li
等2007; Bou-Torrent等2008)、金属离子体内平衡
(Rampey等2006; Séguéla等2008; Long等2010)等,
其中调节类黄酮和花青素合成是植物bHLH转录
因子最重要功能之一。
3 植物中调节花青素生物合成的bHLH转录因子
3.1 玉米中调节花青素生物合成的bHLH转录因子
玉米基因组中有超过20个位点参与了花青素
的合成, 其中, B1、R1、C1和PL1四个重要位点基
因能协调控制花青素合成途径中结构基因的表
达。R1/B1家族成员(R1、LC、SN、B1)和C1/PL1
家族成员(C1、PL1)分别编码bHLH和MYB类转录
因子(Cone等1993)。R1/B1基因表达具有较强的组
织特异性, 决定花青素的组织特异性分布, 例如R1
位点S基因调节谷粒糊粉层着色, R1基因调节花药
及胚芽鞘着色 , LC基因却可以调节叶中脉、叶
舌、叶缘、颖片、膜、托苞和果皮等组织的着色
(Dooner和Kermicle 1976; Ludwig等1989)。B1位点
基因能调节植物多个组织花青素的合成与分布,
但很少影响糊粉层和幼苗的颜色(Radicel la等
1991)。C1、PL1基因则分别决定种子和营养组织
中发育时间和光对花青素合成的调节(McCarty等
1989; Cocciolone和Cone 1993)。R1家族基因LC与
C1在矮牵牛叶片中共同表达可激活矮牵牛CHSJ
和DFRA启动子, 且在叶片上产生红色斑点(Quat-
trocchio等1993)。在莲花(Lotus corniculatus)中异
位表达R1家族基因SN使得花青素和丹宁酸合成量
杨鹏程等: 植物花青素合成相关的bHLH转录因子 749
均有增加(Robbins等2003)。最新研究表明, 在拟
南芥中玉米R1蛋白N端序列能够促进叶片毛状体
以及根毛的分化, 而全长的R1是促进花青素合成
必需的(Tominaga-Wada等2012)。
玉米IN1 (intensifier1)基因能够编码与R1高度
同源的bHLH转录因子, 但由于错误剪接, IN1基因
转录产物可与R1/B1结合, 阻止二聚体形成以及
R1/B1与DNA结合, 还能与C1/PL1的R2R3-MYB结
构域结合, 阻止它们发挥功能, 从而抑制花青素合
成(Burr等1996)。玉米种子中bHLH蛋白可对整个
花青素合成途径进行调节, 但要依赖于MYB蛋白
(如C1蛋白)和WD40蛋白(如PAC1), 三者相互作用
形成MBW复合物共同发挥作用(Carey等2004), 然
而营养器官中花青素合成不依赖于PAC1蛋白
(Selinger和Chandler 1999)。
3.2 玉米R1蛋白
玉米R1 (RED1)蛋白是植物中第一个被发现
的bHLH转录因子(Ludwig和Wessler 1990), 无论蛋
白结构还是调节结构基因表达的模式都是调节花
青素合成的bHLH转录因子中的典型。R1蛋白包
含几个重要结构域(图1): MIR (MYB-interacting re-
gion)、WD40/AD、bHLH和ACT结构域。MIR结
构域位于R1蛋白N端 , 负责与MYB蛋白相互作
用。R1蛋白MIR结构域与C1蛋白R2R3-MYB结构
域相互作用是bHLH转录因子和R2R3-MYB转录
因子相互作用的最好例证(Goff等1992)。WD40/
AD结构域是R1与WD40蛋白以及RNA聚合酶II
(RNA polymerase II)相互作用的结构域(Pattanaik
等2008)。bHLH结构域是DNA结合结构域, 能形
成同源或异源二聚体, 这是bHLH蛋白与DNA结合
的前提(Ma等1994)。单体R1蛋白的bHLH结构域
还能与RIF1 (R-interacting-factor)相互作用, RIF1是
EMSY类似蛋白, 是R1/C1复合物结合和激活结构
基因所必需的(Hernandez等2007)。ACT结构域位
于R蛋白C端, 是R1蛋白实现二聚体化的另一个区
域, 在激活R1/C1复合物中起重要作用(Feller等
2006; Feller 2010)。
R1蛋白在调控花青素合成中的功能可能是通
过形成二聚体(bHLH结构域和ACT结构域), 作为
连接R2R3-MYB蛋白(MIR结构域)和WD40蛋白
(WD40/AD结构域)的船坞蛋白(docking protein)。
并且通过MYB-bHLH相互作用招募未知因子结合
于花青素合成基因的启动子上, 从而促进C1蛋白
的转录激活活性。R1蛋白还可能通过促进C1蛋白
与抑制子(IN1蛋白)分离激活C1蛋白(Hernandez等
2004; Feller 2010)。
R1蛋白对目的基因的调控模式已经得到研
究, 它可根据目的基因启动子区的顺式元件不同,
动态地形成不同构象发挥调控作用: 对于含E-box
的C2基因(ZmCHS)和Bz1基因(ZmUFGT), R1可通
过bHLH结构域形成二聚体, 在体内直接与C2和
Bz1启动子区的E-box结合, 激活两个基因的表达,
但这种结合和激活均依赖于R1与C1的相互作用。
对于不含E-box的A1基因(ZmDFR), R1由ATC结构
域形成同源二聚体, 通过与C1的相互作用被招募
到A1启动子区, 此时R1还通过单体的bHLH结构域
招募RIF1, 从而在A1启动子区形成C1-R1-RIF1转
录复合物激活A1基因的表达(Feller 2010)。
3.3 拟南芥中调节花青素生物合成的bHLH转录
因子
拟南芥中参与调控花青素合成的bHLH蛋白
均聚集于bHLH家族第三亚组(subgroup III), 有TT8
(AtBHLH042)、GL3 (AtBHLH001)、EGL3 (MYC-
146/AtBHLH002)和MYC1 (AtBHLH012) (Bailey等
2003; Heim等2003)。它们均能与第六亚组R2R3-
MYB蛋白相互作用, 包括PAP1 (AtMYB75)、PAP2
(AtMYB90)、MYB113和MYB114 (Zimmermann等
2004)。TT8基因是通过筛选T-DNA插入的拟南芥
突变体库和BAC文库分离得到的, 其cDNA编码
518个氨基酸, 序列的C端包含典型的bHLH结构,
与玉米IN1同源性最高(59%)。拟南芥长角果中,
TT8能够调节DFR和BAN的表达, 且这种调节作用
依赖于TTG1 (WD40蛋白)和TT2 (R2R3-MYB蛋
图1 调节花青素合成的bHLH转录因子的结构
Fig.1 General structure of the bHLH transcription factors
involved in the regulation of anthocyanin biosynthesis
数字代表每个区域第一个氨基酸所在的位置。
植物生理学报750
白), EBGs以及LBGs中的LDOX的表达不受TT8调
节(Nesi等2000)。GL3和EGL3分别与玉米R1
(61%)和金鱼草DELILA (58%)具有较高同源性, 与
TT8不同的是, GL3和EGL3的表达不受TTG1调节,
且它们能够调节LDOX的表达(Ramsay等2003)。
拟南芥幼苗中TT8、GL3和EGL3的表达及其对花
青素的调节功能存在部分重叠和冗余 , GL3和
EGL3在调节F3’H表达中的作用相当, 而在调节
DFR和ANS/LDOX的表达中EGL3起主要作用(Gon-
zalez等2008)。
MBW复合物参与拟南芥多种生理途径, 如表
皮细胞分化和命运调节(根毛和毛状体形成)、种
皮粘液产生、花青素和种皮原花青素合成等
(Ramsay和Glover 2005)。拟南芥bHLH蛋白主要
通过参与形成MBW复合物调节种子原花青素以
及营养器官花青素合成, 例如TT2-TT8-TTG1复合
物促进拟南芥种子原花青素合成 ( B a u d r y等
2004)。而调节花青素合成的MBW复合物有多种,
酵母双杂交实验证明PAP1、PAP2、MYB113、
MYB114能与TTG1以及TT8、GL3、EGL3相互作
用, 原生质体瞬时表达实验证明PAP1、PAP2和
GL3、EGL3或者TT8共表达能够强烈激活DFR启
动子(Zimmermann等2004), 并且PAP1、PAP2、
MYB113、MYB114的异位表达能显著增加花青
素的合成, 但要依赖于bHLH和TTG1 (Gonzalez等
2008)。与玉米不同 , 拟南芥MBW复合物只对
LBGs的表达进行调控, EBGs的表达受R2R3-MYB
蛋白MYB11、MYB12和MYB111调控(Gonzalez等
2008; Mehrtens等2005)。F3’H基因则可能受两组
调控因子的调控(Stracke等2007)。
除了调节结构基因表达外, 拟南芥花青素合
成调节因子还能正反馈或负反馈调节自身表达。
例如TT2、PAP1能和TTG1相互作用激活TT8的表
达, 而TT2、PAP1在体内与TT8启动子结合依赖
TT8自身或者GL3、EGL3的表达, 证明TT8能够参
与形成M B W复合物正反馈调节自身的表达
(Baudry等2006)。MYBL2和CAPRICE (CPC)是拟
南芥中发现的花青素合成负调控因子, 两者均属
于R3-MYB蛋白, 能够替代R2R3-MYB与bHLH相
互作用阻止MBW复合物的形成 , 或者结合到
MBW复合物后通过TLLLFR阻遏结构域抑制
MBW复合物的转录激活活性, 从而抑制花青素合
成基因的表达(Matsui等2008; Zhu等2009)。另外,
MYBL2还能够抑制TT8、PAP1、PAP2等正调控基
因的表达, 然而TT8又能正调控MYBL2的表达, 从
而负反馈调节自身表达(Matsui等2008)。
3.4 观赏植物中调节花青素生物合成的bHLH转
录因子
矮牵牛中调节花青素合成的bHLH蛋白有2个:
AN1和JAF13。AN1 (anthocyanin 1)是通过转座子
dTphl标签克隆获得的, 该基因与结构基因DFR同
源, 可直接调节DFRA的表达。花药中AN1的表达
依赖于AN4 (R2R3-MYB), 在AN4功能缺失的叶片
和花药中AN2 (R2R3-MYB)能够重新激活AN1的
表达, 表明AN2和AN4均是AN1表达的激活因子
(Gerats等1990; Spelt等2000)。Quattrocchio等
(1998)通过同源克隆得到矮牵牛JAF13, 该基因与
AN2一起在叶片中瞬时表达能够激活DFRA启动
子, 却不影响CHSA和F3H等早期基因的表达; 且
JAF13与AN1的功能不完全等同, 因为JAF13无法
恢复AN1突变体表型。
矮牵牛的bHLH蛋白也类似于拟南芥是通过
形成MBW复合物调节结构基因表达。参与形成
复合物的有WD40蛋白AN11, R2R3-MYB蛋白
AN2、AN4以及最新发现的DEEP PURPLE (DPL)
和PURPLE HAZE (PHZ)。MBW复合物只能调节
LBGs (DFR、AN13、RT、AMT)和CHSJ的表达,
而不能调节EBGs (CHSA、CHI、F3H)表达(Quat-
trocchio等1993)。有研究表明, 矮牵牛花瓣表皮细
胞中MYB3可激活EBGs中的CHS表达, 且不需要
bHLH蛋白协助(Solano等1995)。由于组成的
R2R3-MYB蛋白不同, MBW复合物能调节不同组
织的花青素合成: 在光照下, AN1-AN2-AN11调控
花瓣着色, AN1-AN4-AN11调控花筒和花药着色,
AN1-PHZ-AN11调控发育中的花芽表面着色, 而
AN1-DPL-AN11调控花筒脉络着色(Albert等
2011)。矮牵牛中也存在着正负调节机制, 在暗处
时MBW复合物表达受抑制而PhMYB27 (R2R3-
MYB)基因和PhMYBx (R3-MYB, CPC-like)基因表
达量大大增加(Albert等2011)。PhMYB27与草莓
FaMYB1 (R2R3-MYB)蛋白类似, 该蛋白能与矮牵
牛bHLH蛋白JAF13、AN1结合, 抑制花青素的合
杨鹏程等: 植物花青素合成相关的bHLH转录因子 751
成(Aharoni等2001)。PhMYBx则是花青素合成中
的一个竞争抑制因子, 能与JAF13和AN1蛋白结合
阻止MBW复合物形成从而抑制花青素合成, 而
AN1和AN11却能激活PhMYBx的表达导致花青素
合成受抑制(Koes等2005)。
金鱼草(Antirrhinum majus)中已经鉴定出6个
花青素合成调控基因: DELILA、MUTABILIS、
ELUTA、ROSEA1、ROSEA2和VENOSA (Martin等
1991; Davies和Schwinn 2003)。DELILA和MUTA-
BILIS编码bHLH转录因子, DELILA的表达具有较
强的组织特异性, 主要在花冠(花冠管部)、萼片、
子叶和茎中起作用。在DELILA突变的无色花冠管
部(del-), PAL和CHI的表达量正常, 而UFGT的表达
量大幅降低, 且DELILA对F3H的表达影响显著而
对CHS的表达量几乎无影响(Martin等1991)。这表
明与拟南芥和矮牵牛相似, DELILA主要对LBGs起
调控作用, 不同之处在于金鱼草F3H属于LBGs
(Schwinn等2006)。与DELILA相比, 金鱼草R2R3-
MYB蛋白却可以调控不同的EBGs和LBGs表达,
如ROSEA1调控F3H、FLS、F3’H、DFR、ANS/
LDOX和UFGT表达, ROSEA2仅调控CHI和F3’H表
达, VENOSA调控CHI、F3H、FLS、F3’H、ANS/
LDOX和UFGT表达, 而MYB305和MYB340调控
PAL、CHI、F3’H表达(Schwinn等2006; Tama-
gnone等1998)。
圆叶牵牛(Ipomoea purpurea)中, bHLH2不仅
调控花器官花青素以及种皮原花青素合成, 还能
促进种皮毛状体形成。bHLH2基因中自发插入
DNA转座子会产生ivs (ivory seed)突变体, 与野生
型相比这类突变体花变为白色, 种子由深棕色变
为乳白色, 且表面毛状体变少、变短。ivs突变体
花芽中所有花青素合成结构基因表达量均有部分
降低, 其中DFR-B和ANS停止表达(Park等2007)。
bHLH2发挥功能依赖于MYB1和WDR1, 三者相互
作用形成MBW复合物对上述生理过程进行调节,
如果这些基因突变, 则圆叶牵牛花器官中除CHS-E
之外所有结构基因均下调表达, 而在种皮中只有
LBGs下调表达(Park等2007; Morita等2006)。
大丽花(Dahlia variabilis)具有多种花色, 这是
由于其放射小花中花青素和其他类黄酮物质不同
而造成的。野生型品种‘Michael J’ (MJW)的花为
鲜黄色且夹杂着少量亮橙色花纹, 而两种横向突
变体MJOr和MJY则分别有纯亮橙色和纯鲜黄色的
花。研究表明 , 3种花色的不同是由bHLH基因
DvIVS突变造成的, MJW和MJY中DvIVS基因第四
个内含子中插入了转座子Tdv1 (transposable ele-
ment of Dahlia variabilis 1)。Tdv1长5.4 kb, 属
CACTA超家族转座子 , 它的出现抑制了花中
DvCHS1、DvF3H、DvDFR、DvANS的表达, 从而
抑制花青素合成(Ohno等2011)。亮橙色和鲜黄色
花形成机制是: MJOr中DvIVS正常表达, 从而调控
花青素合成结构基因正常表达, 能够合成花青素
(anthocyanidin)、黄酮(flavone)和紫铆花素(butein),
因此花呈纯的亮橙色; MJY中由于Tdv1的插入, 只
有部分DvIVS正常表达, 因此花青素合成结构基因
无法正常表达, 不能合成花青素而只能合成黄酮
和紫铆花素, 因此花呈鲜黄色(Ohno等2011)。
非洲菊(Gerbera hybrida) GMYC1编码的bHLH
蛋白与金鱼草DELILA、JAF13及玉米LC蛋白有
较高同源性。GMYC1蛋白能与非洲菊R2R3-MYB
蛋白GMYB10相互作用共同激活DFR的表达, 且
GMYC1对DFR的调节具有较强的器官、组织和花
类型特异性。例如GMYC1调节花冠和心皮中DFR
的表达, 在冠毛和雄蕊中却不能(Elomaa等1998)。
DFR启动子区的花青素调节元件ARE (anthocyanin
regulatory element)在GMYB10/GMYC1激活DFR
中起关键作用, 是调节复合物与DFR启动子结合的
位点(Elomaa等2003)。
龙胆(Gentian)是日本最受欢迎的花卉作物之
一, 它具有独特的碧蓝色花朵, 这是由飞燕草色素
(delphinidin)积累形成的。系统进化分析和基因组
结构分析表明, 龙胆GtbHLH1蛋白与矮牵牛AN1
高度同源, 花瓣中GtbHLH1表达模式与花青素合
成结构基因的表达及花青素合成模式一致。Gtb-
HLH1能与GtMYB3相互作用, 且两个基因共同表
达后显著增强GtF3’5’H和Gt5AT启动子活性, 却不
能影响GtCHS的活性, 表明GtbHLH1和GtMYB3在
调节龙胆花瓣花青素合成基因表达时具有特异性
(Nakatsuka等2008)。
亚洲杂交百合(Lilium spp.)能够受光诱导合成
花青素, 从其被片中分离到的两个花青素合成调
节基因LhbHLH1和LhbHLH2在被片、茎和叶子中
植物生理学报752
均有表达 , 而在花丝和雌蕊中只有LhbHLH2表
达。LhbHLH1与金鱼草DELILA和矮牵牛JAF13同
源, LhbHLH2却与矮牵牛AN1同源。两个基因表达
均受光的诱导且LhbHLH2受光诱导表达强于Lhb-
HLH1, 在调节花青素合成中起主要作用(Nakatsu-
ka等2009)。另外, LhbHLH2能与LhMYB6、Lh-
M Y B 1 2相互作用 , 激活L h D F R、L h C H S a、
LhCHSb的表达(Yamagishi等2010)。
3.5 园艺作物果实中调节花青素生物合成的bHLH
转录因子
葡萄中调节花青素合成的 b H L H蛋白有
VvMYC1和VvMYCA1。VvMYC1和拟南芥TT8、
矮牵牛AN1一起聚集于bHLH蛋白第IIIf-1亚组, 该
亚组bHLH蛋白均可调控花青素和原花青素合成;
而VvMYCA1与拟南芥EGL3和GL3、矮牵牛
JAF13、苹果bHLH33一起聚集于第IIIf-2亚组, 该
亚组bHLH蛋白只调节花青素的合成(Hichri等
2010)。VvMYC1能够与自身相互作用形成二聚
体, 二聚体化的VvMYC1能与葡萄所有R2R3-MYB
蛋白(VvMYB5a/5b、VvMYBA1/A2、VvMYB-
PA1)相互作用, 激活花青素或者原花青素合成结
构基因(CHI、ANR、UFGT)表达。VvMYC1和
VvMYBA1的瞬时表达能够诱导葡萄悬浮细胞合
成花青素, 有趣的是, VvMYC1能与VvMYBA1相
互作用激活自身启动子, 从而正反馈调节自身表
达, 这与拟南芥TT8的自我反馈调节一致(Hichri等
2010)。亚细胞定位研究表明, VvMYCA1和VvW-
DR1 (WD40)能够共定位于细胞质和细胞核内, 且
它们的表达模式与葡萄浆果中花青素的积累, 高
盐胁迫下葡萄幼苗花青素积累, 以及VvMYBA1/
A2、UFGT、ANR的表达模式一致(Matus等2010)。
作为蔷薇科(Rosaceae)植物中的重要园艺作
物, 苹果(Malus domestica)花青素生物合成调控的
研究最近几年取得了较大进展。两个bHLH蛋白
MdbHLH3和MdbHLH33参与了花青素合成的调
节, 它们是MdMYB10 (R2R3-MYB)有效诱导花青
素合成所必需的, 与MdMYB10相互作用后可诱导
苹果果皮、果肉和叶子合成红色花青素(Espley等
2007), 而与MdMYB10来自同一基因位点的Md-
MYB1和MdMYBA只能诱导果皮红色花青素的合
成(Takos等2006; Ban等2007)。最近, 苹果中参与
花青素合成的WD40蛋白MdTTG1得到鉴定, 但它
是否能与苹果MYB和bHLH蛋白相互作用还有待
研究(Brueggemann等2010)。与苹果MdMYB10直
系同源的MYB蛋白在其他蔷薇科物种中也得到鉴
定, 如梨(Pyrus pyrifolia)中的PyMYB10 (Feng等
2010)、山竹(Garcinia mangostana)中的GmMYB10
(Palapol等2009)以及杨梅(Myrica rubra)中的
MrMYB1 (Niu等2010)。这些MYB蛋白均与果实
成熟过程中花青素的积累有关, 且它们与bHLH蛋
白共同表达可激活花青素合成基因的表达(Palapol
等2009; Niu等2010)。
3.6 蔬菜中调节花青素生物合成的bHLH转录因子
红叶卷心菜(Brassica oleracea var. capitata)是
十字花科蔬菜作物的一种, 除了十字花科蔬菜共
有的优点外, 它的独特之处是还能合成高量的花
青素, 且花青素的含量与抗氧化物的量呈正相关,
食用后对预防人体肿瘤和其他疾病具有积极作
用。对红叶卷心菜花青素合成调控研究表明, 相
对于绿色品种, 红色品种中除CHI外, CHS、F3H、
F3’H、DFR、LDOX、GST均得到明显的上调表
达。同样上调表达的还有2个调控基因BoTT8
(bHLH)和BoMYB2 (R2R3-MYB), 表明BoMYB2和
BoTT8可对几乎整个花青素合成途径进行调控
(Yuan等2009)。
花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis)中Pur-
ple (Pr)基因突变导致凝乳以及其他组织大量合成
紫色花青素。与野生型相比, 紫色花椰菜中只有
bHLH蛋白BobHLH1、R2R3-MYB蛋白PURPLE和
LBGs (BoF3’H、BoDFR、BoLDOX)上调表达,
EBGs表达量不受影响。其中PURPLE还可激活
BobHLH1的表达, 从而调节下游的LBGs表达(Chiu
等2010)。
紫背天葵(Gynura bicolor)是日本传统的蔬菜
作物, 茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MJ)能够诱导
其根部合成紫色花青素。MJ诱导的紫背天葵根部
调节基因GbMYC1 (bHLH)、GbMYB1 (R2R3-
MYB)以及结构基因GbCHS、GbCHI、GbDFR、
GbANS均上调表达, 且基因的上调表达依赖于光
照。GbDFR、GbANS启动子区存在MYB结合序列
(包括MYBCORE和CNGTTR)、bHLH识别元件G-
box (CACGTG)以及bHLH结合位点CANNTG。瞬
杨鹏程等: 植物花青素合成相关的bHLH转录因子 753
时表达实验证明, GbMYC1和GbMYB1共同表达能
激活GbDFR和GbANS启动子(Shimizu等2011)。
3.7 紫苏(Perilla frutescens)和烟草(Nicotiana ta-
bacum)中调节花青素生物合成的bHLH转录因子
紫苏可分为红色和绿色2个品种, 各种花青素
合成酶基因的表达只有在红色紫苏中能够检测到,
因此花青素合成的调控只存在于红色紫苏中, 且
依赖于光的诱导(Gong等1997, 1999)。紫苏中参与
调节花青素合成的bHLH蛋白有MYC-RP/GP和
MYC-F3G1。Gong等(1999)用金鱼草的DELILA
cDNA为探针, 分别从红色紫苏和绿色紫苏中分离
出MYC-RP基因和MYC-GP基因, 这两个基因均编
码620个氨基酸, 唯一不同的是, MYC-RP第132位
氨基酸为丙氨酸而MYC-GP为丝氨酸。MYC-RP/
GP在烟草和番茄(Lycopersicon esculentum)中异位
表达可提高花中花青素含量, 在酵母中MYC-RP/
表1 花青素合成相关的bHLH蛋白及其相互作用蛋白和它们所调控的基因
Table 1 bHLH proteins, their interacting proteins and genes regulated by them involved in anthocyanin biosynthesis
物种 调节花青素合成的bHLH蛋白 MYB蛋白 WD40蛋白 受调控的基因
玉米(Zea mays) R1 (种子) C1 PAC1 CHS、CHI、F3H、
B1和SN1 (植株) PL1 PAC1 DFR、LDOX、UFGT
IN1 (负调控) C1和PL1
拟南芥(Arabidopsis TT8、GL3、EGL3、 PAP1、PAP2、MYB113、 TTG1 F3’H、DFR、LDOX、
thaliana) MYC1 MYB114、TT2、MYBL2、 UFGT
CPC (负调控)
矮牵牛(Petunia hybrida) AN1和JAF13 AN2、AN4、DPL、PHZ、 AN11 CHS-J、DFR、AN13、
PhMYBx (负调控) RT、AMT
紫苏(Perilla frutescens) MYC-RP/GP和MYC-F3G1 MYB-P1 PFWD DFR
葡萄(Vitis vinifera) VvMYC1和VvMYCA1 VvMYB5a、VvMYB5b、 VvWDR1和 CHI、ANR、UFGT
VvMYBA1、VvMYBA2、 VvWDR2
VvMYBPA1
苹果(Malus domestica) MdbHLH3和MdbHLH33 MdMYB10 MdTTG1 DFR和UFGT
圆叶牵牛(Ipomoea bHLH2 MYB1 WDR1 CHS-D、CHI、F3H、
purpurea) DFR、LDOX、UFGT
花椰菜(Brassica oleracea BobHLH1 PURPLE BoWD40 F3’H、DFR、LDOX
var. botrytis)
非洲菊(Gerbera hybrida) GMYC1 GMYB10 DFR
龙胆(Gentian) GtbHLH1 GtMYB3 F3’5’H和5AT
亚洲杂交百合(Lilium spp.) LhbHLH1和LhbHLH2 LhMYB6和LhMYB12 CHSa、CHSb、FR
红叶卷心菜(Brassica BoTT8 BoMYB2 CHS、F3H、F3’H、
oleracea var. capitata) DFR、LDOX、GST
紫背天葵(Gynura bicolor) GbMYC1 GbMYB1 DFR和ANS
烟草(Nicotiana tabacum) NtAn1 NtAn2 CHS和DFR
金鱼草(Antirrhinum majus) DELILA和MUTABILIS F3H、F3’H、DFR、
LDOX、UFGT
橙(Citrus sinensis) CsMYC2 UFGT
大丽花(Dahlia variabilis) DvIVS CHS1、F3H、DFR、ANS

GP可激活酵母GAL-1启动子和紫苏DFR启动子,
且转录激活结构域位于第193~420位氨基酸之
间。同时, MYC-RP/GP能够与MYB-P1 (R2R3-
MYB)和PFWD (WD40)相互作用形成复合物调节
花青素的合成(Yamazaki等2003)。通过mRNA差
异显示技术分离到的MYC-F3G1仅在红色紫苏中
表达, 且受光的诱导, 是决定紫苏颜色的关键因子
之一。在酵母中MYC-F3G1能够与MYC-RP
(bHLH)以及PFWD (WD40)蛋白相互作用, 但不能
与MYB-P1 (MYB)蛋白相互作用(Yamazaki等
2003)。由此推测紫苏调控蛋白的作用模式是: 两
个bHLH蛋白MYC-RP和MYC-F3G1首先分别与
PFWD相互作用, 然后两者相互作用形成二聚体,
最后通过MYC-RP与MYB-P1相互作用形成五元
的MBW复合物激活花青素合成结构基因表达(图
2)。
植物生理学报754
烟草经常被用作异源系统来研究MYB、
bHLH和WD40类转录因子对类黄酮或花青素的组
合调控, 然而烟草内源的花青素合成调节因子却
知之甚少。Bai等(2011)从烟草花中分离到了2个
bHLH基因NtAn1a和NtAn1b, 它们分别来源于祖先
Nicotiana sylvestris和Nicotiana tomentosiformis, 异
位表达能提高烟草花中花青素含量, 且两个基因
过表达的烟草中EBGs和LBGs均上调表达。R2R3-
MYB蛋白NtAn2能够诱导NtAn1的表达, 酵母内
NtAn1能与NtAn2相互作用, 且NtAn1-NtAn2复合
物能激活烟草CHS和DFR启动子。
4 展望
综上所述, 人们对花青素合成的研究目光已
经从结构基因转向了调控基因, 从转录水平研究
花青素合成的调控机制, 使得越来越多的花青素
合成调控因子得到鉴定。然而许多非模式物种或
者不同组织器官中花青素合成相关的转录因子还
没有得到鉴定, 需要借助基因组测序技术、基因
组学和蛋白质组学技术, 进一步对植物bHLH转录
因子及其他转录因子进行鉴定, 对转录因子间以
及转录因子与结构基因间的相互作用模式及其表
达调控模式进行研究。这样, 更多的花青素合成
调控因子将在园艺花卉、果实和蔬菜中得到鉴定,
从而可通过转基因等技术控制转录因子的表达量,
以达到定向改变花色, 提高花的观赏价值, 提高果
实和蔬菜的食用价值和品质的目的。总之, 对花
青素合成调控因子进行研究, 将为提高花卉、果
实和蔬菜的商品特性以及将来实现人工调控花青
素合成的工业化生产提供科学依据和理论基础。
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图2 调节紫苏花青素合成的蛋白复合物模型
(Yamazaki等2003)
Fig.2 The model for the protein complex involved in the
regulation of anthocyanin biosynthesis in P. frutescens
(Yamazaki等2003)
杨鹏程等: 植物花青素合成相关的bHLH转录因子 755
colour locus produces a pollinator shift in monkey flowers. Na-
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