全 文 ：铝毒害是酸性土壤限制植物生长的主要因
子。铝通常以无毒害的氧化物和铝硅酸盐的形态
存在土壤中[1]。然而, 当土壤的 pH<5时, 铝从土壤
中溶解出来, 形成有毒害的 Al3+[2]。当 Al离子浓度
达到微摩尔浓度时, Al3+就能抑制植物的根生长,
影响对养分的吸收, 从而影响植物生长[1]。
收稿日期: 2013-11-25; 修回日期: 2014-03-18
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(31260297); 云南省中青年学术技术带头人后备人才培养基金资助项目(2006PY01-10)
作者简介: 宋倩(1988-), 女, 云南玉溪人, 硕士研究生, 主要从事植物铝胁迫研究; *通讯作者: 李昆志(1963-), 男, 广西兴安县人, 昆明理
工大学生命科学学院教授, 博士, 主要从事植物生理生物学研究, Tel: 0871-65920623, E-mail: likunzhi63@126.com。
丹波黑大豆 GmbHLH30转录因子耐铝功能
初步研究
宋 倩, 钱绍方, 陈宣钦, 陈丽梅, 李昆志*
(昆明理工大学 生命科学与技术学院, 中国云南 昆明 650500)
摘 要: 铝毒是酸性土壤作物生长的主要限制因素。 前期研究发现, 铝胁迫下, 耐铝型丹波黑大豆 SSH (sup-
pression subtractive hybridization, SSH) cDNA 文库中 bHLH30 转录因子基因上调表达, 推测该基因与丹波黑大
豆耐铝性相关。 克隆 GmbHLH30 基因, 构建 GmbHLH30 植物表达载体 pK2-35S-GmbHLH30, 并在烟草中过量
表达获得转 GmbHLH30 的转基因烟草植株。在铝胁迫下, 转 GmbHLH30 的转基因烟草相对根伸长率比野生型
烟草大, 可溶性糖和脯氨酸含量高, H2O2水平低。 表明 GmbHLH30 基因的过量表达可以增强植物的耐铝能力,
暗示 GmbHLH30 转录因子参与调控植物的耐铝特性。
关键词: 黑大豆; bHLH30; 铝胁迫; 转基因烟草; 铝耐受性
中图分类号: Q945.78 文献标识码: A 文章编号：1007-7847（2014）04-0332-06
Study on the Function of Transcription Factor GmbHLH30
on Aluminum Tolerance Preliminary in Tampa Black Soybean
SONG Qian, QIAN Shao-fang, CHEN Xuan-qin, CHEN Li-mei, LI Kun-zhi*
(College of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, Yunnan, China)
Abstract: Aluminum toxicity is the major limiting factor of crop growth in acidic soils. Previous studies
found that the expression of bHLH 30 transcription factor gene is upregulated in SSH (suppression subtrac－
tive hybridization, SSH) cDNA library of resistant aluminum type Tamba black soybean under Al stress. It
was speculated that the gene was associated with aluminum tolerance of Tamba black soybean. GmbHLH30
gene was cloned and plant expression vector pK2-35S-GmbHLH30 was constructed, the vector was overex－
pressed in the tobacco. The GmbHLH30 transgenic tobacco lines have bigger relative root elongation rate,
higher soluble sugar and proline as well as lower H2O2 content in leaf and root, compared with wild-type to－
bacco under aluminum stress. These results indicate that GmbHLH30 transcription factor genes would im－
prove the ability of plants resistant aluminum and suggested that GmbHLH30 transcription factor genes par－
ticipate in adjusting aluminum resistant characteristic of plant.
Key words: black soybean; bHLH30; aluminum stress; transgenic tobacco; aluminum tolerance
（Life Science Research，2014，18（4）：332～337）
第 18 卷 第 4 期 生命科学研究 Vol．18 No．4
2014 年 8 月 Life Science Research Aug. 2014
第 4 期 宋 倩等：丹波黑大豆 GmbHLH30转录因子耐铝功能初步研究
已有研究证实植物能够通过分泌有机酸、酚
类化合物、磷酸等物质在一定程度上抵抗铝的毒
害作用[3]。Miyasaka等发现在不含铝的营养液中培
养 8 d的菜豆暴露在铝胁迫条件下时, 铝耐受型
的菜豆根际的柠檬酸含量是未经铝处理菜豆的
70倍; 无论铝敏感型菜豆是否经过铝胁迫处理,
其根际的柠檬酸含量是铝处理过的耐受性菜豆的
十分之一, 因此认为柠檬酸能在一定程度上减缓
铝对植物的毒害作用[3]。此外, Kidd等报道铝能够
诱导玉米中的儿茶酚和黄酮类的酚醛树脂 (槲皮
黄酮)的释放[4]。
植物对铝的耐受机制, 根本上是由遗传机制
调控的。在铝胁迫环境条件下, 某些基因特异性
表达, 表达产物可能参与到耐铝信号途径中, 或
者作为酶调节一些代谢途径, 从而增强植物对铝
的耐受性。植物转录因子在植物生长发育及其对
外界环境的反应中起着重要的作用。碱性螺旋-
环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)转录因子
普遍存在于真核生物中, 具有两个功能区。位于 N
端的碱性区域, 又称为亮氨酸拉链区域, 主要参
与 DNA结合; 在 C端为 HLH区域, 主要为二聚
化区域, 形成同源或异源二聚体[5, 6]。bHLH转录因
子的亮氨酸拉链区域能够识别 DNA的核心序列
基序, 包括已知的 E-box (5′-CANNTG-3′), 及最
常见 G-box (5′-CACGTG-3′)[5, 7]。bHLH转录因子
参与植物的生长发育过程、植物激素信号途径以
及非生物胁迫等过程。拟南芥中的 bHLH92转录
因子在 NaCl、干旱、甘露糖醇以及冷处理实验中
都具有较高的表达量, 说明了 bHLH92能够响应
非生物胁迫[8]。水稻中的 RERJ1基因, 编码 bHLH
转录因子, 该转录因子能够响应机械损伤和干旱
胁迫[9]。酵母中的 PHO4的磷酸化与去磷酸化作用
控制 PHO的调节作用, PHO4是一个 bHLH转录
因子, 它能与第二个转录因子 PHO2 相互作用 ,
在磷饥饿条件下调节下游基因的表达 [10]。然而,
bHLH转录因子对抗铝毒性的研究很少见报道。
在先前的研究中, 用铝对丹波黑大豆(铝耐受
性)和云南小黑豆(铝敏感型)进行胁迫处理, 然后
通过正向 SSH cDNA文库分析, 发现在丹波黑大
豆的 SSH cDNA文库中 bHLH30转录因子的基因
呈上调表达, 但是在云南小黑豆中并没有出现这
个转录因子的基因。因此, 我们推测 GmbHLH30
转录因子可能参与到大豆对铝毒的抵御途径中。
本研究从丹波黑大豆中克隆出 GmbHLH30基因,
构建植物表达载体 pK2-35 S-GmbHLH30, 并在烟
草中过量表达 GmbHLH30基因, 对转基因烟草的
相对根伸长率、可溶性糖含量、脯氨酸含量以及过
氧化氢含量进行测定, 以鉴定转基因烟草是否具
有耐铝性, 从而揭示丹波黑大豆 bHLH30转录因
子基因耐铝毒的功能。
1 材料与方法
1.1 植物材料的培养
本实验采用从日本引进的铝耐受型丹波黑大
豆(Tamba)作为实验材料, 在 25 ℃恒温条件下将
大豆催芽, 待其萌发后挑选生长状况一致的豆芽
进行水培。选取生长 14 d形态大小均一致的幼苗,
用 0.5 mmol/L pH 4.5 的 CaCl2 溶液预处理 12 h
后, 再用 50 μmol/L pH 4.5 的 AlCl3溶液 (含 0.5
mmol/L CaCl2)分别处理大豆 0、2、4、8、12、24 h。
本研究所采用的野生型烟草 (Nicotiana
tabacum cv.Xanth)种子均由本实验室所繁殖。烟草
种子先用按 1∶200 比例稀释的农药 (medience-
sporetexnase) 浸泡 24 h 杀灭真菌, 再加入 2 mL
1% SDS与 5% NaClO的混合液进行消毒处理, 播
种于 MS培养基上。
1.2 引物合成
根据丹波黑大豆 SSH cDNA文库测序所得的
GmbHLH30 EST 片段 , 在大豆数据库中查找
bHLH基因全长序列, 设计引物, 在 5′-端引物加
BamH Ⅰ酶切位点, 3′-端引物加 Xho Ⅰ酶切位
点, 引物序列如下:
基因全长克隆引物:
GmbHLH30 5′ : 5′ -GGATCCATGATACAGGAA－
GATCAAGG-3′ (BamH Ⅰ),
GmbHLH30 3′ : 5′ -CTCGAGAAGACCTCGATC－
CGTTCC-3′ (Xho Ⅰ);
表达谱引物:
GmbHLH30 5′ : 5′ -GGATCCATGATACAGGAA－
GATCAAGG-3′,
GmbHLH30 3′ : 5′-GTCCAACAAGGGATTCAGA－
TA-3′。
1.3 GmbHLH30基因的获得
使用 TRIzol誖 Reagent (Invitrogen)提取植物
总 RNA, 并将 RNA纯化, 然后使用 M-MLV反转
录酶合成 cDNA。采用 TIANGEN 公司 Taq DNA
polymerase进行 PCR扩增 GmbHLH30基因, 再用
琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回收 GmbHLH30基
333
生 命 科 学 研 究 2014 年
因片段, 并使用 pMD18-T vector kit (TaKaRa)进
行 TA 克隆 ; 然后用热刺激法转化 E.coli DH5α;
最后采用蓝白斑筛选阳性克隆。
1.4 转基因烟草根伸长的测定
分别取具有 4~6条幼根的野生型烟草(WT)、
GmbHLH30-10和 GmbHLH30-20烟草无菌苗各
4株, 水培 3 d后, 用 0.5 mmol/L、pH 4.5的 CaCl2
溶液预处理 12 h后测定每株幼苗的根长。然后置
入 50 μmol/L pH 4.5的 AlCl3 (含 0.5 mmol/L CaCl2)
溶液处理 24 h后再次测定其根长。相对根伸长
率=(AlCl3处理后根长－AlCl3处理前根长)/CK 根
伸长。
1.5 烟草植株中可溶性糖、脯氨酸和过氧化氢含
量测定
分别取生根后 1 个月左右的 WT、Gmb -
HLH30-10和 GmbHLH30-20烟草无菌苗各 3株,
置入 0.5 mmol/L pH 4.5的 CaCl2溶液预处理 12 h,
再放入 50 μmol/L pH 4.5的 AlCl3 (含 0.5 mmol/L
CaCl2)溶液中处理 24 h, 用于测定可溶性糖、脯氨
酸(Pro)和过氧化氢(H2O2)含量。
采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量 [11], 以
μmol·g－1 FW表示。测定 OD625值后代入标准曲线
y=0.0345x+0.0204计算可溶性糖含量。
采用磺基水杨酸法 [12]测定脯氨酸含量 , 以
μmol·g－1 FW表示. 测定 OD520值后代入标准曲线
y=0.0223x－0.0286后计算脯氨酸含量。
过氧化氢(H2O2)含量采用二甲酚橙法 [13]进行
测定, 以 μmol·g－1 FW表示。
1.6 数据统计分析
所有生理生化指标测定至少设置 3次重复,
用 TEST法对所得数据进行统计学分析和差异显
著性分析。星号表示 50 μmol/L AlCl3胁迫处理
24 h后转基因株系和WT株系间生理指标间存在
显著性差异(*表示 P<0.05, **表示 P<0.01)。
2 研究结果
2.1 不同铝处理时间黑豆根中 bHLH30 基因表
达谱分析
用 50 μmol/L AlCl3处理丹波黑大豆和云南
小黑豆, 处理时间为 0、2、4、8、12、24 h, 然后以大
豆 28S rRNA 作为内参, 分别对这两种豆根进行
RT-PCR分析 bHLH30的表达水平。结果显示云
南小黑豆处理 2 h 时 bHLH30 表达量突然上升,
4 h又下降, 8 h表达量达到最大, 随后表达量呈
现下降趋势(图 1)。而丹波黑大豆根中 bHLH30的
表达量开始随着处理时间的增加而增加, 当达到
8 h时, 丹波黑大豆 bHLH30 的表达量达到最大
值, 之后随着处理时间的增加其表达量逐渐下降
(图 1)。这表明黑豆根中 bHLH30的表达受铝胁迫
的诱导。
0 2 4 8 12 24 (h)
33
33
30
Tamba black soybean bHLH30
Yunnan soybean bHLH30
Soybean 28S rRNA
图 1 丹波黑大豆与云南小黑豆中 bHLH30 基因表达谱
Fig.1 The expression profilings of bHLH30 gene in Tamba black
soybeans and Yunnan soybeans
2.2 GmbHLH30过表达转基因烟草的筛选与鉴定
通过 Gateway 技术将 GmbHLH30 基因亚克
隆到植物表达载体 pK2GW7中构建植物表达载体
pK2-35S-GmbHLH30, 通过农杆菌介导的叶盘法
转化烟草。在基因组水平 (图 2A)、RNA水平 (图
2B)和蛋白水平(图 2C)上对转基因烟草进行鉴定。
在基因组水平检测时,转基因株系 GmbHLH30-9、
GmbHLH30-10、GmbHLH30-11、GmbHLH30-13、
GmbHLH30-20等植株中均检测出了 GmbHLH30
基因。在这些植株中 , 选取 GmbHLH30-10 与
GmbHLH30-20 株系进行 RNA 水平与蛋白水平
的检测, 结果表明 GmbHLH30基因成功转入烟草
并能够在转基因烟草中成功表达。在后续的实验
中均选取 GmbHLH30-10与 GmbHLH30-20株系
作为研究对象。
2.3 GmbHLH30 过表达转基因烟草的抗铝生理
特性分析
在铝胁迫下, 铝对植物根部的毒害最明显。
为了验证转基因烟草对铝是否具有耐受性,我们对
其根相对伸长率进行测定。结果表明在 50 μmol/L
AlCl3胁迫处理 24 h后, 转 GmbHLH30基因烟草
的相对根伸长率比野生型大, 其相对根伸长率比
334
第 4 期
1 2 3 4
图 2 转基因烟草的鉴定
(A) 基因组 PCR 扩增。1: 无菌水(负对照); 2: 野生型烟草; 3~16: 转 GmbHLH30 基因烟草; 17: pK2-35S-GmbHLH30 质粒(正
对照); M: DNA Marker Ⅲ。 (B) 转基因烟草 RT-PCR 扩增结果。 1: 野生型烟草; 2: 转 GmbHLH30 基因烟草 10#株系; 3: 转
GmbHLH30基因烟草 20#株系; 4: pK2-35S-GmbHLH30 质粒; (C) 转基因烟草 Western blot 分析。 1: pET28a(+)-GmbHLH30;
2: 转 GmbHLH30 基因烟草 20#株系; 3: 转 GmbHLH30 基因烟草 10#株系; 4: 野生型烟草。
Fig.2 The detection of GmbHLH30 in transgenic tobacco
(A) PCR amplification of genomic. 1: Sterile water (negative control); 2: Wild-type tobacco; 3~16: The Tobacco transformed with
GmbHLH30 gene; 17: Plasmid with pK2-35S-GmbHLH30 (positive control); M: DNA Marker Ⅲ. (B) The amplification results
by RT-PCR in transgenic tobacco. 1: Wild-type tobacco; 2: The transgenic tobacco lines 10# transformed with GmbHLH30; 3:
The transgenic tobacco lines 20# transformed with GmbHLH30; 4: Plasmid with pK2-35S-GmbHLH30. (C) Western Blot analysis
of transgenic tobacco. 1: pET28a (+)-GmbHLH30; 2: The transgenic tobacco lines 20# transformed with GmbHLH30; 3: The
transgenic tobacco lines 10# transformed with GmbHLH30; 4: Wild-type tobacco.
野生型大 1.75~2倍(图 3A)。这说明转基因植株对
铝的耐受性比野生型植株强。
转 GmbHLH30基因烟草可溶性糖、脯氨酸含
量测定结果见图 3B、C。结果表明 50 μmol/L AlCl3
胁迫处理 24 h后转 GmbHLH30基因烟草根和叶
中可溶性糖含量都比野生型的高, 其中叶中的可
溶性糖含量显著增加 , 而脯氨酸含量在转
GmbHLH30基因的植物根中比野生型的低, 叶片
中则显著增加。这说明铝胁迫下转基因烟草通过
调节可溶性糖、脯氨酸含量的变化来维持植物体
内渗透压的稳态来提高转 GmbHLH30基因烟草
的耐铝能力。
在铝胁迫下, 通常会导致植物体内产生氧化
损伤。通过测定植株体内 H2O2含量水平来反映出
转基因植株与野生型植株中氧化损伤水平差异。
野生型烟草和转基因烟草根和叶中 H2O2含量测
定结果见图 3D。研究结果显示与野生型相比 ,
50 μmol/L AlCl3胁迫处理 24 h 后转 GmbHLH30
基因烟草根和叶中 H2O2含量均下降且维持较低
水平。说明转基因烟草在铝胁迫下能够在一定程
度上清除体内的 H2O2, 降低氧化损伤的程度, 最
终提高自身的耐铝能力。
3 讨论
前期研究已证明丹波黑大豆的耐铝能力比云
南小黑豆强[14, 15]。本研究中, 用 50 μmol/L的 AlCl3
处理丹波黑大豆(RB)和云南小黑豆(SB)后对其表
达谱进行分析。研究结果表明 Al胁迫处理丹波黑
大豆 0到 8 h, bHLH基因表达水平逐渐增强, 8 h
达到最大值, 随后表达逐渐减弱。云南小黑豆在
2 h表达量上升, 4 h下降, 到 8 h达到最大值, 之
后逐渐减弱(图 1)。这可能是由于云南小黑豆对铝
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1.2 kb
GmbHLH30
18S rRNA
(A)
1 2 3 4
34
30
(B)
(C)
宋 倩等：丹波黑大豆 GmbHLH30转录因子耐铝功能初步研究
M
335
生 命 科 学 研 究 2014 年
图 3 GmbHLH30 转基因烟草中相对根伸长、可溶性糖含量、脯氨酸含量、H2O2含量的测定
用 50 μmol/L AlCl3 pH 4.5 处理转 GmbHLH30 基因烟草 24 h 后, (A) 相对根伸长率测定; (B) 可溶性糖含量的测定; (C) 脯
氨酸含量的测定; (D) 过氧化氢含量的测定。 WT: 野生型烟草, GmbHLH30-10 和 GmbHLH30-20 均为转基因烟草。
Fig.3 The determination of the relative root elongation, soluble sugar, proline, H2O2 content in GmbHLH30 transgenic
tobacco
The relative root elongation(A), the soluble sugar content(B), the proline content(C) and the hydrogen content (D) were deter-
mined in the GmbHLH30 transgenic tobacco treated with 50 μmol AlCl3 (pH 4.5) for 24 h. WT: Wild-type tobacco; GmbHLH30-20
and GmbHLH30-10: The GmbHLH30 transgenic tobacco line 20＃ and line 10＃.
胁迫的耐受性较弱, 对铝的外部耐受机制也比丹
波黑大豆弱。因此在 2 h处理时, 主要依靠诱导内
部耐受机制抵御铝毒, 随着铝胁迫时间的增加,
已表达的 GmbHLH30转录因子会调节相关基因
的表达, 在一定程度上增强植株的耐铝能力, 使
植株对铝毒的敏感性稍微减弱, 所以云南小黑豆
处理 4 h, GmbHLH30的表达量减少。处理 8 h, 云
南小黑豆中的 GmbHLH30的表达水平较丹波黑
大豆中的表达水平高。由于丹波黑大豆的耐铝能
力相对较强, 其外部耐受机制可能也较强, 所以,
在 0~8 h的处理过程中, GmbHLH30的表达量是
逐步增加的。在处理时间为 8 h 时 , 两种豆中
GmbHLH30的表达量都达到最大值。但是, 随后
的 12~24 h 之间, GmbHLH30 的表达量都降低。
这可能是由于植株可以在一定程度上通过内部耐
受机制和外部耐受机制抵抗铝的毒害作用, 超过
一定的范围后, 铝的毒害作用会对植株造成损伤,
影响植株正常的新陈的代谢、生理生化过程, 从
而导致植株整体机能下降, 使得处理时间过长,
GmbHLH30转录因子表达量会下降。
由于植物的根与土壤中的铝直接接触, 在铝
胁迫下, 铝的毒害作用对植物根部的影响较明
显。本研究结果表明转基因植物的根相对伸长率
比野生型烟草的大(图 3A), 说明转基因植物具有
抵抗铝的毒害作用, 使根部不受损伤, 具有较大
的相对根伸长率; 而野生型烟草对铝毒害作用较
敏感, 根的生长受到抑制。有文献报道, 用铝处理
大麦 8 h后, 根尖细胞中的 DNA会发生断裂, 并
且还会形成凋亡体, 使细胞发生凋亡。由于细胞
死亡, 从而抑制根的生长[16]。
在各种逆境胁迫下, 植物细胞通过主动积累
各种有机和无机物质来提高细胞液浓度,维持膨压,
保护质膜的稳定,从而维持原有的生理过程[17]。本
实验结果表明, Al胁迫对转基因烟草和野生型烟
草的生理特性有显著不同的影响。铝胁迫下转基
因烟草根中可溶性糖和脯氨酸的含量都较低, 而
在叶中的含量比野生型烟草显著的增加 (图 3B、
C), 这说明在铝胁迫下转基因植物根受到的危害
比较少, 具有铝毒抗性。转基因植物叶片上累积
较多的可溶性糖和脯氨酸, 由于这两种物质都是
渗透调节物质, 可降低溶质势, 保持较高的膨压,
维持植物的正常生长, 同时这两种物质有利于转
基因烟草清除体内的过氧化物质, 从而提高转基
因植物耐铝毒性。从 H2O2含量的生理期指标来
看, 转基因烟草的根和叶中含量都维持较低水平
(图 3D), 这说明转基因烟草的根部受 Al胁迫危害
比较少, 植物能够正常生长。
综上所述, 铝胁迫下转 GmbHLH30基因烟草
通过累积渗透调节物质可溶性糖和脯氨酸来维持
植物体内渗透压的稳态, 低的 H2O2水平以减少氧
WT GmbHLH30-10 GmbHLH30-20
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WT GmbHLH30-10 GmbHLH30-20
(D)
GmbHLH30-10 GmbHLH30-20
336
第 4 期
化损伤来抵御铝胁迫, 提高转 GmbHLH30基因烟
草的耐铝能力。在铝胁迫下, 促进了转基因烟草
bHLH转录因子的过量表达, 可能通过转录调控
可溶性糖和脯氨酸等调节渗透物质的代谢合成和
累积以及清除自由氧基相关的靶基因, 使烟草叶
中含有较高的可溶性糖和脯氨酸含量以及较低的
H2O2含量, 维持植物膨压和保护细胞膜的结构,
达到减轻 Al对细胞的毒害, 从而使植物在一定程
度上忍受、减缓或抵抗逆境胁迫。bHLH转录因子
具体调控哪些靶基因还有待进一步研究。
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