全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (11): 1103~1108 1103
收稿 2011-07-07　　修定 2011-09-22
资助 国家“863”计划(2010AA10A108)和江苏省环洪泽湖生态
农业生物技术重点实验室开放基金(HZHL0807)。
* 通讯作者(E-mail: qyang19@njau.edu.cn; Tel: 025-84395221)。
野生马铃薯ANS同源基因的克隆与表达分析
王冰, 王全逸, 印敬明, 陈敏, 杨清*
南京农业大学生命科学学院, 南京210095
摘要: 采用PCR和RT-PCR方法从野生马铃薯(Solanum cardiphyllum)分离得到了一个花色素合成酶(anthocyanidin synthase)
同源基因ScANS的cDNA (GenBank登录号HQ701726)和DNA序列(GenBank登录号HQ701727)。序列分析表明, ScANS基因
全长为1 583 bp, 由一个内含子和两个外显子组成, 开放阅读框长度为1 365 bp, 编码一个由454个氨基酸残基组成的蛋白。
该蛋白分子量为51.10 kDa, 理论等电点为5.24。ScANS含有典型的2OG-FeII-Oxy保守功能域, 属于2-OOD酶家族, 其氨基
酸序列与茄子的同源蛋白序列一致性最高, 达82.86%。组织表达分析表明, ScANS在马铃薯植株的茎、叶和顶芽中有较高
水平的转录表达, 在根中有微量表达, 在匍匐茎和块茎中检测不到。
关键词: 野生马铃薯; 花色苷; ScANS; 克隆; 表达
Molecular Cloning and Expression Analysis of an ANS Homologous Gene from
Solanum cardiphyllum
WANG Bing, WANG Quan-Yi, YIN Jing-Ming, CHEN Min, YANG Qing*
College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: A homologue of ANS (anthocyanidin synthase) gene, designated ScANS, was isolated from wild po-
tato (Solanum Cardiphyllum) by RT-PCR. The gene was submitted to GenBank and the accession numbers were
HQ701726-ScANS cDNA and HQ701727-ScANS DNA. ScANS DNA was 1 583 bp long, containing two exons
and one intron. The ORF of ScANS was 1 365 bp long and encoded a putative protein of 454 amino acids with a
molecular weight of 51.10 kDa and a theoretical pI of 5.24. ScANS protein contained a characteristic 2-oxoglu-
tarate Fe2+/O2- binding domain (2OG-FeII-OXY), which is strictly conservative in the 2-oxoglutarate-dependent
dioxygenases superfamily. The multiple alignment of the amino acid sequence of ScANS with those of other
homologues showed that it had high identity with homologous member of Solanum melongena. Spatial expres-
sion analysis of ScANS mRNA indicated that ScANS highly expressed in stem, leaves and buds and little in
roots. No transcript was detected in stolons and tubers.
Key words: Solanum cardiphyllum; anthocyanidin synthase; anthocyanidin; cloning; expression
花色苷是植物次生代谢过程中产生的类黄酮
物质, 属于植物多酚类化合物。花色苷的生物合
成途径经历3个阶段: 第1阶段由苯丙氨酸到4-香豆
酰CoA, 受苯丙氨酸裂解酶(phenylalanine ammonia
lyase, PAL)基因活性调控。第2阶段由4-香豆酰
CoA和丙二酰CoA到二氢黄酮醇, 是花色苷代谢的
关键反应, 该阶段产生的黄烷酮和二氢黄酮醇在
不同酶作用下, 可转化为花色苷和其他类黄酮物
质。第3阶段是花色苷的合成, 至少有3个酶参与,
分别是二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-re-
ductase, DFR)、花色苷合成酶(anthocyanidin syn-
thase, ANS)和类黄酮3-葡糖基转移酶(UDP-gluco-
se: flavonoid-3-o-glucosyltransferase, 3GT), 将无色
的二氢黄酮醇转化成有色的花色素。其中DFR催
化二氢黄酮醇进一步还原成无色花色素, 再经过
氧化、脱水和糖基化, 无色花色素变成有色的花
色素苷(砖红色的花葵素、紫红色的芍药花色素和
蓝色的飞燕草色素)。这些花色素苷还可进一步糖
基化、甲基化和酰基化形成不同的产物(Holton和
Cornish 1995)。从马铃薯中已经克隆到一些花色
苷生物合成途径中的关键酶基因, 如查尔酮合酶
(chalcone synthase, CHS)基因(Jeon等1996)、黄烷
酮3-羟基化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)基因
(GenBank登录号AY102035)、DFR基因(De Jong等
植物生理学报1104
2003)和类黄酮3’5’-羟基化酶(flavonoid 3’5’-hy-
droxylase, F3’5’H)基因(Jung等2005)。
花色素合成酶(ANS)是花色苷生物合成途径
后期的关键酶之一, 它依赖2-酮戊二酸离子和Fe2+
催化无色花色素转化成有色花色素 (He l l e r等
1985)。在许多植物中, ANS由一个小基因家族所
编码, 目前已经从矮牵牛、茄子、玉米、葡萄和
水稻等作物中克隆到ANS (Reddy和Coe 1962;
Menssen等1990; Reedy等2007; Samuelian等2009)。
虽然卢其能等(2008, 2009)已经从野生马铃薯(So-
lanum pinnatisectum)中分离得到CHS、F3H、DFR
和3GT四个基因, 但是至今尚未见到马铃薯ANS基
因克隆的报道。本文报道我们从野生马铃薯(Sola-
num cardiphyllum)中克隆ScANS基因的研究结果。
材料与方法
1 材料
植物材料是从美国国家马铃薯种质资源库引
进的马铃薯野生种(Solanum cardiphyllum) (NPGS
Accession: PI 347759), 薯块白色。植株种植在塑
料大棚中 , 进行常规管理。在成熟期分别收集
根、茎、叶、芽、匍匐茎, 立即放入液氮中速冻,
然后在-80 ℃下贮存。
大肠杆菌(Escherizchia coli) DH5α由南京农业
大学马铃薯实验室保存; RNA提取试剂Trizol购于
Invitrogen公司; Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和
PCR缓冲液等试剂购于上海博彩生物科技有限公
司; 逆转录酶AMV、pMD19-T载体和DNA分子量
标准(DL2000)购于大连TaKaRa宝生物工程有限公
司; AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购于Axygen公
司; 常规化学药品为分析纯试剂; 引物由上海华大
天源生物科技有限公司合成。
2 方法
2.1 马铃薯基因组DNA和总RNA的提取　
以马铃薯幼嫩叶片为材料, 在液氮中磨碎, 采
用SDS法提取基因组DNA, 总RNA参照Maríale-
onor等(2002)方法提取。
2.2 ANS cDNA全长序列的克隆
按照Promega公司Reverse Transcription Sys-
tem说明书合成cDNA第一链。根据茄子(GenBank
登录号EU809469)、陆地棉(GenBank登录号EF-
187442)和葡萄(GenBank登录号GQ281057)的ANS
基因的cDNA序列, 分别设计ANS基因的上下游引
物, ANS正向引物S1: 5 TAAAGAGATGGTGAGT-
GAAGTGGTT 3和ANS反向引物A1: 5 TGCTTAT-
TAAATAAAGACATCGCAG 3。以马铃薯野生种
叶片cDNA为模板, 进行PCR扩增。PCR体系: 2.5 µL
10×PCR反应缓冲液、2 µL MgCl2 (25 mmol·L
-1)、
0.5 µL dNTP混合物(10 mmol·L-1)、 0.5 μL cDNA
模板、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、0.25 µL
Taq DNA聚合酶(5 U·µL-1)、加灭菌ddH2O至总体
积25 μL。PCR循环程序为: 94 ℃预变性5 min; 94
℃变性40 s, 54 ℃退火40 s, 72 ℃延伸1 min 30 s, 35
个循环; 最后在72 ℃保温10 min。PCR产物经
1.5%的琼脂糖电泳后, 用AxyPrep DNA凝胶回收
试剂盒从凝胶上回收、纯化目的条带。取4 μL回
收产物、5 μL连接缓冲液和1 μL pMD19-T载体 4
℃连接, 转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞, 通
过蓝白斑筛选挑取白色菌落, 经菌液PCR验证, 委
托上海美吉生物公司测序。
2.3 gDNA序列的克隆
以马铃薯野生种叶片基因组DNA为模板, 利
用引物S1和A1进行基因全长的扩增, 25 µL体系如
2.2。PCR循环程序为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变
性40 s, 54 ℃退火40 s, 72 ℃延伸1 min 40 s, 35个循
环; 最后在72 ℃保温10 min。PCR产物按2.2的方
法进行电泳、回收、克隆、验证和测序。
2.4 序列分析
将所得的ScANS cDNA序列在线Blast分析, 比
较ScANS DNA和cDNA序列, 确定基因的结构; 用
DNASTAR和DNASIST软件分析基因核苷酸和氨
基酸的结构特征和同源性; 用ProtScale和TargetP分
别对蛋白疏水性和定位进行分析; 用SignalP 3.0
tool对蛋白信号肽进行分析; 用SMART和Scan-
Prosite等软件对基因的功能结构域进行分析; 用
NPS@服务器中的GOR程序对蛋白二级结构进行
预测; 用Swiss Model Server对蛋白高级结构进行
预测; 用DNAMAN软件构建基因氨基酸序列比对
图和系统进化树。
2.5 马铃薯ScANS基因的组织特异性表达分析
分别从根、茎、叶、顶芽、匍匐茎和块茎中
提取总RNA, 合成cDNA第一链。根据已测定的
王冰等: 野生马铃薯ANS同源基因的克隆与表达分析 1105
ScANS基因的cDNA全长序列设计如下特异引物:
正向引物S2: 5 ACCCTCTGGTAATGTCCAAGG-
CTAT 3和反向引物A2: 5 TCTTGTACTTTCCGT-
TGCTTAGGAT 3。PCR循环程序为: 94 ℃预变性
5 min; 94 ℃变性40 s, 54 ℃退火40 s, 72 ℃延伸40 s,
28个循环; 最后在72 ℃保温10 min。然后琼脂糖
凝胶电泳检测。以持家基因GAPDH (3-磷酸甘油
醛脱氢酶)的一段380 bp的序列作内标来确定PCR
时的模板量(Knud 2004), 设计上游引物GAPDHS:
5 TCAACGAGAATGAATACAAGCCA 3 和下游
引物GAPDHA: 5 TCGACAACAGAAACATCAG-
CAGT 3。PCR 循环程序分别与前述相同。
实验结果
1 ScANS cDNA和gDNA全长的扩增
根据来自茄子、陆地棉和葡萄的ANS同源基
因cDNA序列设计引物, 通过RT-PCR方法从马铃薯
野生种中克隆到ANS基因cDNA全长序列, 得到大
小约为1 500 bp的目的片段(图1-A); 同时以马铃薯
野生种叶片gDNA为模板, 采用相同引物扩增, 得
到大小约为1 800 bp的目的片段(图1-B)。经测序
后, 将cDNA和gDNA序列提交到GenBank, 登录号
分别为HQ701726和HQ701727。该基因命名为
ScANS。
2 ScANS序列及其编码氨基酸序列的特征分析
马铃薯野生种ScANS cDNA序列全长为1 583
bp, 包含一个全长为1 365 bp的开放阅读框, 起始
密码子为ATG, 终止密码子为TAG。对ScANS
gDNA和cDNA序列进行比对显示, 该基因由两个
外显子和一个内含子组成(图2)。在核苷酸水平上,
ScANS与茄子(Solanum melongena, GenBank登录号
EU809496)的同源性最高, 达83.08%, 其次是葡萄
(Vitis vinifera, GenBank登录号GQ281057), 达
62.34%。
选择与ScANS相似性较高(≥60%)的其他物
种相应多肽进行多重比较, 结果显示, ScANS与茄
子(Solanum melongena, GenBank登录号ACJ02088)
一致性最高, 达82.86%; 其次是陆地棉(Gossypium
hirsutum, GenBank登录号ABA01483), 达62.42%;
与葡萄(Vitis vinifera, GenBank登录号ABV82967)
和可可树(Theobroma cacao, GenBank登录号ADD-
51356)的同源性分别是62.20%和61.54% (图3)。
ANS蛋白属于2-OOD酶家族 , 含有典型的
2OG-FeII-Oxy功能域, ScANS的保守功能域位于
210~309处, 其在237和292处分别含有一个与Fe2+
结合所需的组氨酸(His)保守位点, 在241处含有一
个天冬氨酸(Asp)保守位点, 在304和306处分别含
有一个与2-酮戊二酸特异结合的保守位点(图3)。
3 ScANS蛋白特征分析
采用网络上的蛋白质分析工具(http://isoelec-
tric.ovh.org)对马铃薯ScANS蛋白进行特性分析, 结
果显示, ScANS蛋白质分子量为51.10 kDa, 等电点为
5.24。ProtScale等在线工具分析(表1)显示, ScANS蛋
白不含信号肽, 属于水溶性蛋白, 且其定位在线粒
体、叶绿体或者分泌到胞外的可能性均比较小。
采用SMART和ScanProsite软件对ScANS蛋白
结构域进行分析, 结果(表2)表明, ScANS蛋白含有
2个潜在的蛋白激酶C磷酸化位点、7个潜在的酪
图1 马铃薯ScANS PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of ScANS PCR
amplification products
图2 ScANS基因结构示意图
Fig.2 The gene structures of ScANS
a: ScANS外显子与内含子分布; b: ScANS cDNA ORF结构示意
图。黑色框为外显子, 黑线为内含子, 数字1为翻译起始位点。
植物生理学报1106
蛋白激酶II磷酸化位点、3个N端酰基化位点和1个
潜在的ArgE/dapE/ACY1/CPG2/yscS家族标志蛋白
位点(表2)。
通过NPS@服务器中的GOR程序对ScANS蛋
白质二级结构进行预测, 发现ScANS主要存在3种
二级结构: α螺旋(42.73%)、无规则卷曲(42.95%)
和延伸链(14.32%)。利用在线分析软件Swiss
Model Servers 对马铃薯ScANS三级结构进行预测,
结果(图4)显示, 它含有5个α螺旋和5个β折叠。
表1 ScANS定位分析
Table 1 The prediction of ScANS localization in cell
名称 长度 叶绿体转运肽 线粒体靶肽 信号肽 其他
ScANS 454 0.153 0.149 0.204 0.521
表2 ScANS蛋白功能位点分布表
Table 2 The functional sites of ScANS and their distribution
位点名称 位置: 序列
蛋白激酶C磷酸化位点 264~266: TAK; 376~378: SEK
酪蛋白激酶II磷酸化位点 10~13: SRVE; 106~109: TFFD;
166~169: TPAD; 325~328: TVTE;
327~330 : TEAE; 376~379: SEKD;
397~400: SAAE
N端酰基化位点 125~130: GNVQGY;
131~136: GSKLAN;
197~202: GLEEGR
ArgE/dapE/ACY1/CPG2/yscS 232~241: LGVEAHTDVS
家族标志蛋白位点
图4 马铃薯ScANS三级结构模型
Fig.4 Tertiary structure model of ScANS
图3 ScANS与其它植物ANS的蛋白氨基酸序列比对
Fig.3 Sequence alignment of ScANS with its homologous proteins from other plants
黑色背景的残基为100%相同序列; 灰色背景的残基为75%相似序列。2OG-FeII-Oxy功能域序列用加粗下划线加以标注; 结合Fe2+离
子的His和Asp残基用箭头“↓”表示; 与 2OG相结合的保守位点用“★”加以标注。
王冰等: 野生马铃薯ANS同源基因的克隆与表达分析 1107
4 ScANS分子进化分析
选择11个亲缘关系最密切和具有代表性的
ANS蛋白, 用相邻连接法构建ScANS系统发育树
状图, 结果(图5)显示, 马铃薯ScANS与茄子SmANS
亲缘关系最近, 与菠菜SoANS、连翘FiANS和洋桔
梗EgANS属同一亚簇。
5 ScANS组织表达模式分析
基因的表达特性与其生理功能密切相关。为
了了解ScANS的功能, 利用半定量RT-PCR方法检
测马铃薯植株不同部位的ScANS mRNA水平。
ScANS在马铃薯植株的叶和顶芽中有较高水平的
转录表达, 在根中有微量表达, 在匍匐茎和块茎中
则检测不到(图6)。
讨　　论
花色苷是植物中一种重要的次生代谢产物,
对植物自身, 花色苷不仅能使植物表现出鲜艳的
图5 ScANS的系统发生分析
Fig.5 Phylogenetic analyses of ScANS and its
homologous proteins from different species
拟南芥(AtLOX1, NP194019), 甜橙(CsANS, AAT02642), 胡
萝卜(DcLOX1, AAD56580), 龙眼(DlANS-like, ACK76231), 洋
桔梗(EgANS, BAD34462), 金钟连翘(FiANS, CAA73094), 陆
地棉(GhANS, ABA01483), 西洋梨(PcANS, ABB70119), 毛果
杨(PtANS, XP002304452), 葡萄(VvANS, ABV82967), 茄子
(SmANS, ACJ02088), 菠菜(SoANS, BAE54520)和可可树(TcANS,
ADD51356)。
图6 不同器官中ScANS的表达分析
Fig.6 Expression analysis of ScANS in different organs
色彩从而吸引传粉者和采食者, 有利于植物的授
粉和种子的传播(Winkel-shirley 2001), 对植物的生
长发育也起着保护作用。对人类而言, 花色苷作
为一类重要的天然色素, 可广泛用于食品、药品
和化妆品中, 同时具有抗氧化、抗衰老、防止血
管硬化等作用(Wang等1999; Liu等2002), 又是一种
潜在的抗癌化合物(Kamei等1993, 1995)。虽然在
植物上, 花色苷生物合成途径具有保守型, 但是,
在不同植物之间花色苷生物合成存在一些差异。
野生马铃薯是重要的马铃薯野生种, 含有许多马
铃薯栽培种中所没有的基因资源。本研究从该野
生种S. cardiphyllum中克隆到ScANS基因, 该基因
含有2-酮戊二酸-Fe2+-双加氧酶家族的保守结构域,
在结构域含有与Fe2+结合所需的保守His、Asp及
与2-酮戊二酸特异结合的Arg, 为植物双加氧酶家
族基因保守的典型特征 , 这些特征与其他植物
ANS及双加氧酶家族的F3H、FLS、ACC氧化酶
的催化活性中心特征一致(Menssen等1990)。但
是 , 这些保守氨基酸数目则有所差异(Martin等
1991)。同时我们通过分析发现, ScANS和其他植
物中ANS的三级结构比较相似, 说明了ANS家族
蛋白结构比较保守。
我们以前的研究发现, 马铃薯的基因组含有
花色苷合成的全套基因; 在有色马铃薯中, 这些基
因全部表达; 但在白色或黄色马铃薯中, 某些关健
酶基因的沉默导致不能合成花色苷(尚未发表的资
料)。S. cardiphyllum的块茎颜色是白色, 本文结果
发现, ScANS主要在叶和顶芽中表达, 而在匍匐茎
和块茎中没有表达, 这解释了S. cardiphyllum的块
茎之所以为白色的原因。而ScANS在叶和顶芽中
大量表达, 表明它可能参与到其它未知的生物学
过程。
S. cardiphyllum块茎中ScANS的不表达, 推测
可能有两个原因: 一是它的上游启动子中缺乏相
应的块茎特异表达的顺式元件, 二是马铃薯块茎
中不存在调节ScANS基因上游块茎特异顺式元件
植物生理学报1108
的转录因子或特定转录因子基因在块茎中不表达
(Honda等 2002)。进一步深入研究ScANS的沉默原
因, 对揭示不同颜色马铃薯花色苷合成的分子机
理, 推动花色苷基因工程在马铃薯育种中的应用,
有重要意义。
参考文献
卢其能, 杨清, 却志群, 黄友明(2008). 马铃薯野生种CHS基因
cDNA的克隆与表达分析. 华北农学报, 23 (5): 17~22
卢其能, 杨清, 沈春修(2009). 马铃薯类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基
因的克隆与表达分析. 华北农学报, 24 (4): 11~16
De Jong WS, De Jong DM, De Jong H (2003). An allele of dihydro-
flavonol 4-reductase associated with the ability to produce red
anthocyanin pigments in potato (Solanum tuberosum L.). Theor
Appl Genet, 107: 1375~1383
Heller W, Forkmann G, Britsch L, Grisebach H (1985). Enzymatic
reduction of (+)-dihydroflavonols to flavan-3,4-cis-diols with
flower extracts from Matthiola incana and its role in anthocyanin
biosynthesis. Planta, 165: 284~287
Holton TA, Cornish EC (1995). Genetics and biochemistry of antho-
cyanin biosynthesis. Plant Cell, 7: 1071~1083
Honda C, Kotoda N, Wada M (2002). Anthocyanin biosynthetic genes
are coordinately expressed during red coloration in apple skin.
Plant Physiol Biochem, 40: 955~962
Jeon JH, Joung H, Byun SM (1996). Characterization of two members
of the chalcone synthase gene family from Solanum tuberosum L.
Plant Physiol, 111: 348~355
Jung CS, Griffiths HM, De Jong DM, Cheng S, Bodis M, De Jong WS
(2005). The potato plocus codes for flavonoid 3’, 5’-hydroxylase.
Theor Appl Genet, 110: 269~275
Kamei H, Kojima T, Hasegawa M, Koide T, Umeda T, Yukawa T
(1993). Suppressive effect of flavonoid extracts from flower
petals on cultured human malignant cells. J Clin Exp Med, 164:
829~836
Kamei H, Kojima T, Hasegawa M, Koide T, Umeda T, Yukawa T
(1995). Suppression of tumor cell growth by anthocyanins in
vitro. Cancer Invest, 13: 590~594
Knud L (2004). Molecular cloning and characterization of cDNAs
encoding cinnamoyl CoA reductase (CCR) from barley (Hordeum
vulgare) and potato (Solanum tuberum). Plant Physiol, 161:
105~112
Liu M, Li XQ, Weber C, Lee CY, Brown J, Liu RH (2002). Antioxi-
dant and antiproliferative activities of raspberries. J Agric Food
Chem, 50: 2926~2930
Maríaleonor VC, Andrés CH, Octavio PL (2002). Isolation of func-
tional RNA from cactus fruit. Plant Mol Biol Rep, 20: 279~286
Martin C, Prescott A, Mackay S, Bartlett J, Vrijlandt E (1991). Con-
trol of anthocyanin biosynthesis in flowers of Antirrhinum ma-
jus. Plant J, 1: 37~49
Menssen A, Hohmann S, Martin W, Schnable PS, Peterson PA, Sae-
dler H, Gierl A (1990). The En/Spm transposable element of Zea
mays contains splice sites at the temini generating a novel intron
from Spm element in the A2 gene. EMBO J, 9: 3051~3057
Reedy AM, Reedy VS, Scheffler BE, Wienand U, Reedy AR (2007).
Novel transgenic rice overexpressing anthocyanidin synthase
accumulates a mixture of flavonoids leading to an increased anti-
oxidant potential. Metabol Engin, 9: 95~111
Reddy GM, Coe EH (1962). Inter-tissue complementation: a simple
technique for direct analysis of gene-action sequence. Science,
138: 149~150
Samuelian SK, Camps C, Kappel C, Simova EP, Delrot S, Colova VM
(2009). Differential screening of overexpressed genes involved
in flavonoid biosynthesis in North American native grapes:
‘Noble’ muscadinia var. and ‘Cynthiana’ aestivalis var. Plant Sci,
177: 211~221
Wang H, Nair MG, Strasburg GM, Chang YC, Booren AM, Gray JI,
DeWitt DL (1999). Antioxidant and anti-inflammatory activities
of anthocyanins and their aglycone, cyanidin, from tart cherries.
J Nat Prod, 62: 86~88
Winkel-Shirley B (2001). Flavonoid Biosynthesis: A colorful model
for genetics, biochemistry, and biotechnology. Plant Physiol,
126: 485~493