全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月288
收稿 2006-10-11 修定 　2007-03-09
资助 国家自然科学基金(30 5 60 0 9 4)和国家教育部重点项目
(2 0 5 0 3 5 )。
* 通讯作者(E-mai l：mllian@ybu.edu .cn；Tel：04 33 -
3 2 6 3 3 8 9 )。
满天星试管苗与其玻璃化苗的RAPD指纹图谱分析
曹天旭，朴炫春，吴松全，王守明，廉美兰 *
延边大学农学院园艺系，吉林龙井 133400
提要：采用分离群体分组分析法(BSA)，用 100个随机引物对满天星的正常苗和玻璃化苗进行RAPD分析的结果表明，7
个随机引物扩增出多态性差异条带。再用上述7个引物分别对试管苗及其玻璃化苗个体进行DNA的PCR扩增的结果显示，
引物 J20在2种苗中出现差异条带。
关键词：满天星；玻璃化苗；RAPD；指纹图谱
Analysis of RAPD Fingerprint of Shoots and Its Vitrification Shoots in vitro of
Gypsophila paniculata L.
CAO Tian-Xu, PIAO Xuan-Chun, WU Song-Quan, WANG Shou-Ming, LIAN Mei-Lan*
Department of Horticulture, College of Agriculturel, Yanbian University, Longjing, Jilin 133400, China
Abstract: In order to identify vitrification shoots at molecular level, analysis of random amplified polymorphic
DNA (RAPD) fingerprinting method was performed on the normal and vitrification shoots in vitro of Gypso-
phila paniculata. One hundred random primers were amplified products by bulked segregation analysis (BSA),
and seven primers which producted polymorphic bands were screened among them. The seven primers were
used on normal and vitrification shoots for PCR amplification, and the result indicated that different bands were
amplified by primer J20 in the two shoots.
Key words: Gypsophila paniculata; vitrification; RAPD; fingerpriting
满天星别名霞草，属石竹科丝石竹属植物，
为多年生宿根草本花卉，是切花用的植物之一，
常用作其他切花的背景花，以构成优雅的花境。
近些年，在满天星试管苗快繁方面已有大量的研
究报道(李黎等 2004；张春华等 2005)，在大规模
生产中满天星组培快繁相对于其它花卉比较容易获
得成功，但普遍存在玻璃化现象，且比较突出和
严重。玻璃化苗极易死亡，不能移栽成活，对植
株离体快繁的成活率造成负面影响，深受人们的
关注(卜学贤和陈维伦 1987)。试管玻璃化植株的
解剖学特点、生理生化变化、形成原因和控制方
法上的研究多有报道，但对玻璃化发生的规律和
机制尚无定论，尤其是分子水平上研究更少。本
文采用随机扩增多态DNA标记(randomly amplified
polymorphic DNA，RAPD)技术，对满天星试管
苗的玻璃化苗和正常苗从DNA水平上作了分析，
为进一步探讨满天星玻璃化苗发生机制建立基础。
材料与方法
茎尖培养得到的满天星(Gypsophila paniculata
L.)试管苗分别接种于 2MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1
mg·L-1 NAA+30 g·L-1蔗糖 +7 g·L-1琼脂和 2MS+5
mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+30 g·L-1蔗糖 +7 g·L-1
琼脂的培养基中。在温度为 25 ℃、湿度为 75%、
光照强度为 30 µmol·m-2·s-1和每天光照 16 h的条件
下培养 30 d，得到的正常苗和玻璃化苗各 7株用
作实验材料。
DNA提取采用CTAB法(Doyle和Doyle 1990)，
根据所加TE的量，在小离心管中分别加入2~3 µL
的 RNase，放到 37 ℃水浴锅中过夜。DNA样品
用 RNase酶解后，采用DYY-12型稳压稳流电泳
仪，缓冲液为 0.5×TBE，0.7%的琼脂糖凝胶电泳
检测DNA质量，电泳时电压 50 V (5 V·cm-1)，时
间 2 h。电泳结束后在凝胶成象仪下(GDS-8000，
美国Ultraviolet公司)照相，并记录结果，符合要
植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月 289
求后放入-20℃冰箱中备用。采用Michelmore等
(1991)的分离群体分组分析法(bulked segregation
analysis，BSA)将 7株正常苗和 7株玻璃化苗的
DNA样品分别等量混合，组成满天星正常苗和玻
璃化苗的基因池。
选取 10碱基的 100个随机引物(美国Operon
Technologies公司)，以 2个基因池的 DNA，用
System-9700 PCR仪(美国Applied Biosystem公司)
进行 PCR扩增。DNA扩增反应程序设置为：94
℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，36 ℃退火
1 min，72℃延伸 1.5 min，45个循环；最后 72℃
延伸 7 min。反应体系(25 µL)为：14.17 µL ddH2O、
150 µmol·L-1 dNTP、1.5 µmol·L-1 MgCl2、2.5 µL
10×Buffer、0.3 µmol·L-1引物、10 ng DNA模板
和 1 U Taq DNA聚合酶。PCR扩增反应结束后，
取10 µL扩增产物与2 µL电泳载体缓冲液混匀，采
用 0.5×TBE电泳缓冲液、1.4%的琼脂糖凝胶(含
0.5% EB)电泳。电压为 80 V，电泳结果在凝胶
成像仪下观察，拍照，实验重复 3 次。
实验结果
1 引物筛选
针对本文研究目的，选择不仅能扩增出清
晰、重复性好的条带， 且能扩增出玻璃化苗或正
常苗的特征性条带的引物。采用 BSA，总共筛选
Operon 系类(F01~20、G01~20、H01~20、I01~20
和 J01~20) 100个随机引物，初步获得指纹条带
明显的引物有 28个，其中重复性好、条带清晰
稳定、有差异的引物只有 7个(表 1)。7个引物在
2个基因池间扩增出的多态性条带的数目、位置
以及强弱均有明显差异(图 1)。
2 满天星正常苗和玻璃化苗的RAPD分析
用上述7个引物分别对7株正常苗和7株玻璃
化苗进行DNA的PCR扩增后，引物J20在正常苗和
玻璃化苗中出现明显的差异带，而其它引物的扩增
效果不佳(资料未列出)。正常苗在 1 700、1 400、
900和 700 bp处各有 1条带，而玻璃化苗除了上
述 4条带外，分别在 1 000和 500 bp出现了 2条特
有的差异带，且 1 000 bp的条带特别亮(图 2)。说明
玻璃化苗的部分碱基已发生变异，这可能是导致玻
璃化苗形态畸变和各种生理生化水平异常的原因。
讨　　论
关于满天星试管苗玻璃化现象的研究已有很
多报道，王纪方等(1997)认为，玻璃化现象可能
表 1 随机引物序号及其碱基序列
Table 1 Random primers and their nucleotide sequence
引物序号 序列(5→ 3)
F06 gggaattcgg
F16 ggagtactgg
G17 acgaccgaca
H17 cactctcctc
J10 aagcccgagg
J17 acgccagttc
J20 aagcggcctc
图 1 采用BSA筛选出不同引物的RAPD产物
Fig.1 RAPD products of different primers screened by BSA
　　M：200 bp D NA分子量标记；F0 6、F16、G1 7、H1 7、
J 1 0、 J 1 7 和 J 2 0：引物；1：正常苗；2：玻璃化苗。
图 2 引物 J20在满天星正常苗与玻
璃化苗中的RAPD指纹图谱
Fig.2 RAPD fingerprint of normal and vitrification shoots in
vitro of G. paniculata generated with primer J20
　　M：2 0 0 bp D N A 分子量标记；1 ~ 7：正常苗；8 ~ 1 4：
玻璃化苗。
植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月290
与环境胁迫直接或间接地引起体内自由基的增加以
及体内防御活性氧毒害的保护性酶的失常有关。
张淑改等(1999)根据满天星玻璃化苗的酯酶和过氧
化物酶分析的结果，提出外部形态上的玻璃化现
象与分子水平上酶的变化密切相关的观点。沈宁
东(2003)比较满天星试管正常苗与玻璃化苗叶片解
剖结构的结果认为，玻璃化苗的形态畸变是因某
些生理生化指标发生变化引起。郭达初等(1991)
认为，具有局部正常顶端分生组织结构的重瓣丝
石竹玻璃化苗通过茎尖培养可使其恢复为正常苗。
本文用RAPD技术从分子角度对满天星试管苗的玻
璃化现象进行了分析，从正常苗和玻璃化苗的指
纹图谱(图2)中可以看出，玻璃化苗在1 000和500
bp处比正常苗多出 2条带，可以确认其遗传物质
DNA发生了变化，因此培养过程中满天星试管苗
一旦产生一定程度的玻璃化现象，即很难恢复正
常，但这些碱基的变化是否是造成试管苗玻璃化
的真正原因仍需进一步研究。
参考文献
卜学贤, 陈维伦(1987). 试管植物的玻璃化现象. 植物生理学通
讯, 23 (5): 13~19
郭达初, 刘克斌, 刘非厌, 柴明良(1991). 重瓣丝石竹试管快速繁
殖和玻璃化现象探讨. 科技通报, 7 (1): 50~55
李黎, 陈菲, 曲彦婷(2004). 重瓣丝石竹的组织培养与快速繁殖.
国土与自然资源研究, (2): 96
沈宁东(2003). 满天星试管正常苗与玻璃苗叶片解剖结构的比较.
青海师范大学学报(自然科学版), (3): 45~47
王纪方, 李锡香, 贾春兰, 沈镝(1997). 丝石竹玻璃苗生理特性和
形成机理初探. 农业生物技术学报, 5 (1): 72~78
张春华, 朴炫春, 廉美兰, 赵长新, 金花(2005). 培养基组成对满
天星试管苗增殖的影响. 延边大学农学学报, 27 (1): 35~39
张淑改, 齐力旺, 时宝凌, 张芸香(1999). 满天星玻璃苗的酯酶和
过氧化物酶研究. 山西农业科学, 27 (2): 68~70
Doyle JJ, Doyle JL (1990). Isolation of plant DNA from fresh
tissue. Focus, 12 (1): 13~15
Michelmore RW, Paran I, Kesseli RV (1991). Identification of
markers linked to disease-resistance genes by bulked seg-
regant analysis: a rapid method to detect markers in specific
genomic regions using segregating populations. Proc Nat
Acad Sci USA, 88: 9828~9832