全 文 ：植物生理学通讯 第 4 卷 第 l期 , 20 08 年 2 月
大赖草总 D N A 转化小麦的 R A PD 分析
赵民安 ‘, 刘敏 ‘, 曹玉锦 ‘,2 ’
‘中国科学院新疆理化技术研究所 , 乌鲁木齐 8 3 0 01 1 ; 2 中国科学院研究生院 , 北京 1 0 0 0 4 9
提要 : 用 160 个随机引物对不同性状转基因小麦、 受体 ‘春麦 76 1 ’ 和大赖草等进行随机扩增多态性 D N A (R A PD) 分析 ,
筛选 出 5 个重复性好和多态性高的引物 。 转基因小麦的扩增图谱中出现供体大赖草的特异性条带, 简单遗传相似系数和聚
类的分析结果均表明 , 大赖草基因片段已整合到转化的小麦基因组中。
关键词 : 大赖草; R A PD ; 转基因小 麦
R A PD A n a lysis o fTr
a n sg e n ic W h ea t (升介忿c u m a e s材vu m L . ) w ith TO ta l D N A o f
L ey m u s ra c em o s u s (L a m
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A b str a c t : G e n e tic d iv e r sity o f tr an sg e n ic w he a t w ith d ife
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’ a n d L eym u s
ra ee m o s u s w as a n alyz e d by ra n d o m am Plifi e d Po lym o印hie D N A (R A PD ) w ith 1 6 0 a rb itr ary o lig o n u e leo tid e
Prim e rs
.
Fiv e Prim e r s w ith g o o d rePe titio n a n d hig h Po lym o rp h ism w er e ser e e n e d
.
T he re w e re se v e r al sPe e ia l
b an d s the sa m e a s the d o n o r in the tr an sg e n ie w h e at
.
T h e g e n etic sim ila rity c o e fi eie n t a n d el
u steri n g an a lysis
a lso c o n fi rm ed th at the g e n e fr ag m e n ts o f L
.
ra e e m o su s h a d b ee n in te g r ated in to th e g e n o m e o f tr a n sg e n ic
w he a t
.
K e y w o rd s : Ley m u s ra c em o s u s : R A PD ; tr a n sg e n ie w h ea t
大赖草是新疆和中亚地区特有的禾本科小麦
亚族赖草属植物 , 是培育小麦新品种的优 良亲
本 。 由于远源杂交困难 , 上世纪 9 0 年代 , 我们
用大赖草总 D N A 通过花粉管通道法转化栽培品种
‘春麦 7 6 1 ’ 并获得大穗 、 高蛋白和抗病的变异
植株 , 以后经多年 自交 , 其遗传性已趋于稳定 ,
统计学分析变异极显著护 < 0 . 0 1) 。
外源 D N A 导入受体植物后可 以引起后代的大
量变异 , 这在农业分子育种的实践中已经得到证
明(C he a h 和 S o n 2 0 0 6 ), 我们实验室采用 D N A 杂
交手段 , 在转基因小麦中发现受体 ‘春麦 7 6 1 ’
中所没有的条带(缪军等 2 0 0 0) 。 近年来 , 随机扩
增多态性D N A (R A PD )技术在遗传育种中逐渐得到
应用(T eM e w o ld 和 B e c k e : 2 0 0 6) , 用 R A PD 检测技
术寻找受体和变异体的差异条带 , 已成为证实外
源基因导入受体的有效手段 (A tie n z ar 和 Jha 2 0 0 6)。
本文对不同性状转基因小麦及其受体进行了R A PD
分析 , 进一步证实大赖草基因片段已整合到转化
小麦基因组 中 。
材料与方法
小麦(Tr itic u m a e stiv u m L . )的不同转基因株系
由我们实验室保存 。 其中大穗和高蛋白株系为转
化后 自交稳定后的株系 , 冬性大穗为转基因大穗
冬性化之后的株系 , 小穗株系为转基 因大穗与受
体 ‘春麦 7 6 1 ’ 杂交后筛选出的株系 。 受体 ‘春
麦 7 6 1 ’ 、 供体大赖草 [I. e夕m u s r a e e m o s u s (L a m . )
T z v el
.
]和小麦 ‘新春 6 号 ’ 由新疆农业科学院提
供 。
采用 S D S 法 (王关林和方宏笃 20 0 1) 提取各种
植株幼苗叶片的总 D N A 。 选用 O p er o n 公司生产
的 A 、 D 、 E 、 F 、 G 、 M 、 S 、 T 组的 1 6 0 个
随机引物进行 D N A 的 PC R 扩增 , 筛选清晰 、 多
态性 明显的引物作为扩增引物 。 PC R 反应体系总
收稿 2 0 0 7 一 10 一 1 7 修定 2 0 0 8 一0 1一0 3
资助 新疆维吾尔 自治 区专利实施项 日(2 0 0 4 2 0 1 0 7 2 9 1 6 ) 。
通讯作者(E 一 m a il : e a o yz @ m s . xjb . a e . e n : T e l: 0 9 9 1 -
3 8 1 3 6 1 0 )
。
平l, 1物厂! 于,l! ’沂通讯 第 4 4 卷 第 l期 , 2 00 8 了卜2 )J
体积 50 林L : 5 林L lo x p CR 缓补},液 、 3 林L 25 m m o l·
L
一
1 M g C 12
、
l 林L 1 0 m m o l· L 一 1 d N T p 、 2 林L 1 0
林m o l· L 一 ’弓}物 、 模板 D N A 至终浓度 1 n g’林L 一’、 I
林L SU 似L 一 ’ T a q 酶 , 补加双蒸水至 5 0 林L 。 p e R
反应程厂犷为 : 9 4 OC 预变性 10 m in ; 9 4 OC 1 m in ,
3 7 oC 1 m in
,
7 2 ℃ 1 . 5 m in , 4 5 个循环 ; 最后
7 2
’
C 延仲 10 m in 。
扩增反应结束后 , 用 3 % 聚内烯酞胺凝胶 ,
以 15 V , e m 一’的电)1夏梯度进行电泳 , 待 D N A 片1段
在凝胶上按分子量大小分离后用银氨染色法(李宏
业等 1 9 9 9) 染色 。 统计各株系转基 因小麦、 受体
‘春麦 7 6 1 ’ 和供体大赖草的扩增条带 , 按照公
式 : 相似系数 = Zx M 、 y/(M 、 + M y)it·算它们之 l、,JI’l{J简
单遗传相似系数 。 式中 , M 、 表示 x 物种条带总
平11 , M , 表示 y物利, 条带总不11, M 、, 农示 x 不11y 物
种共有谱带总和 。
根据 R A PD 一PC R 扩增条带的有无 , 以 1 和 O
记数 , 统计稳定 、 清晰出现的条带 , 采用 N T sy s -
Pc 软件包中的 u P G M A 分析法进行聚类分析
(o a lv应n 等 2 0 0 6 ) , 并建立进化树图 。
实验结果
1 引物的扩增和筛选
)11 160 个不1司的引物扩增不同植株总 D N A 的
结果表明 , O PA 1 1 、 O PD 2 0 、 O PE 0 2 、 O P G 10 、
O PM 1 3 (表 l) 等 5 个引物扩增条带差异显著 , 经
3 次服父能够得到稳定的谱带 。 图 1 为 5 个引物的
扩增图谱 , 其中转基因高蛋自株系 、 冬性大穗株
系和转基 因 大穗株 系出现 了数条受体 ‘ 春麦
表 l 多态性较好的 5 个随机引物
T a b le 1 Fiv e ra n d o m Pr im e rs w ith h ig h Po lym o rp h ism
编 、J 总 条带数 多态性 条带数
O PA ll
O PD 2 0
O PE OZ
O PG 10
O PM I3
CA A T CG CC G T
A CCC G G T C AC
G G T G CG G G A A
AG G G CCG T C T
G G T G G T CA AG
l3
l l
l3
9
1 0
图 1 5 个小 1可引物的 R APD 勿增图 i普
Fig
.
1 T he R A PD a m Plifi e a tio n g raPh o f s Prim e rs
l
: ‘ 存 麦 7 6 1 ’ : 2 : 转 从 囚 .佰蛋 「] : 3 : 冬性 人穗 : 4 : 转 华囚 人穗 : 5 : 人赖 草 ; 6 : 转 基因小穗 : 7 : ‘ 新春
6 号 ’ 。 箭头处为齐株 系转 从囚小 麦‘卜的特 片条带
7 6 1
’ 中没有 的条带 , 并且这些条带叶, 有大赖学
也扩增出的特异条带 。
2 相似系数的计算
根据大穗小麦 、 ‘春麦 7 6 1 ’ 和 大赖 草的扩
增条带计算它们之间的简单.遗传相似系数 (农 2) 。
通过统 计分析 ,叮以看 出 , 大穗小麦转化株 ‘、新姗
人赖 草之间的遗传相似系数比 ‘春麦 7 6 1 ’ 与新
疆 人赖草高出 0 . 0 14 (l . 4 % ) , 这从侧面反映出供
体新疆大赖草基 因组中的部分 成分 已进 入受体
‘存 麦 7 6 1 ’ 从而 形成大穗转化株 。
3 聚类分析
应用 N Ts ys 一Pc 软件包中的 u PG MA 聚类法构
植物生理学通讯 第 4 卷 第 1 期 , 20 0 8 年 2 月
表 2 大赖草 、 ‘春麦 7 6 1 ’ 和转基因
大穗小麦之间的相似系数
T ab le 2 G en e tie 5 1而lari ty eoe fi c ie n t a rn o n g L ra cemo s u s
,
‘s
Pri
n g w he at 76 1
’
an d tran
sg e n ie lo n g
一ear w he a ts
品种 引物数 从 峡 Mx , 相似系数
大穗 x ‘春麦 7 6 1 ’ 1 3 3 1 2 7 5 1 2 7 5 1 1 5 6 0 . 9 0 7
大穗 x 大赖草 4 4 5 2 8 5 2 9 1 9 5 0 . 3 6 9
大赖草 x ‘春麦 7 6 1 ’ 4 4 5 1 3 5 2 9 1 8 5 0 . 3 5 5
建 ‘春麦 7 6 1 ’ 、 大赖草和各株系转基因小麦的
分子系统关系的结果(图 2) 表明 , 大赖草与各种小
麦株系之间遗传距离很远 , 这与它们分属不同属
的分类学地位是相应的 。 ‘春麦 7 6 1 ’ 和 ‘新春
6 号 ’ 归为同一类群 , 这两个品种均为新疆农业
科学院经杂交育种培育的优 良小麦品系 , ‘新春
6 号 ’ 为 ‘春麦 7 6 1 ’ 的改进型 , 目前在新疆
地区广泛种植 。 4 种不同株系的转基因小麦归属
‘春麦 7 6 1 ,
‘新春 6 号 ’
转荃因高蛋白
冬性大称
转基因大称
转基因小移
大赖草
0
.
2 3
Fig
.
2
遗传距离
图 2 大赖草及各种株系小麦的 R APD 聚类树状图
D e n dr o g r a m s o fL
.
ra c e m o su s an d dife re
n t ki n d s o f w h e a t b y R A PD a n a lysis
同一个类群 , 与它们的受体 ‘春麦 7 6 1 ’ 已有较
大的遗传距离 , 由此可见 , 由于大赖草 D N A 的
导入 , 转基因小麦与受体之间产生了一定的基因
型的差别 , 这种差别远大于传统的杂交育种 。
讨 论
上世纪 90 年代 , 由于农杆菌侵染的方法对小
麦等禾本科植物的转化并不理想 , 在转基因小麦
的研究中 , 花粉管通道法得到广泛应用(王秀玲等
2 0 03 )
。 我们实验室采用与小麦同亚族的 、 且具
有多种小麦不具有的优 良性状的大赖草总 D N A 对
小麦进行转化 , 获得了一系列的转基因新株系 。
本文中遗传相似系数和聚类分析的结果表明 , 转
基因小麦中确实已经含有大赖草的基因组片段 ;
同时R A PD 扩增图谱中发现了数条转基因小麦和大
赖草中的特异条带 , 这些条带的克隆和 SC A R 分
析正在进行中 。
传统的 R A PD 分析一般用琼脂糖凝胶电泳检
测(黄亚红等 2 0 0 2 : 曹天旭等 2 0 0 7) , 本文采用改
进的聚丙烯酞胺电泳并配合银染法 , 大大增加了
PC R 产物分析的灵敏度和分辨率 , 在原来无差异
的产物中发现新的差别 , 有的甚至是单拷贝的差
别 。
通过花粉管通道导入法获得的转基因小麦株
系具有一系列的优 良性状 , 但由于大赖草自身具
有分孽多 、 无法密植 、 单穗结实少等缺点 , 我
们所获得的转基因小麦也有这些性状 , 以致这些
转基因新株系的实际种植价值不大 。 分离大穗小
麦中转入的大赖草基 因片段 , 并克隆其中与大穗
性状相关的基因 , 对于研究小麦穗形性状的分子
机制以及在生产实践中的应用都有意义 。
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Th
e ra n d o m a m Plifi e d Po ly m o rp hie
D N ^ (R ^ PD ) a s s a y a n d re la te d te e hn iq u e s aPPlie d to
g e n o to x ie ity an d c a re in o g e n e s is stu d ie s : a e r itie a l re v ie w
.
M u ta tio n R e s
,
6 1 3 : 7 6 ~ 1 0 2
Che a h YK
,
S o n R (2 0 0 6 )
.
R a n d o m a m Plifi e d Po lym o印h ie D N A
an a ly sis o f g e n e tie a lly m o d ifi e d o rg a n is m s
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J B io te e hn o l
,
12 7 : 16 1~ 1 6 6
G alv孟n MZ , Me n乙n d e z 一S e v illan o MC , D e R o n AM , S a n talla M ,
B a la tti PA (2 0 0 6 )
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be a n s fr o m n o rth w e stern ar g e n tin a ba s e d o n m o rp ho
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.
G e n e t R e so u r Cro P E v o l
,
5 3 (5)
:
8 9 1 ~ 9 0 0
T ek le w o ld A
,
B e e ke r H C (2 0 0 6)
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G e o g ra Phie Patte r n o f g e n e tie
d iv e rsity a m o n g 4 3 E thio Pian m u star d (Bra s sie a e a r in a ta A
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