全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 583
收稿 2007-01-26 修定 　2007-05-22
资助 国家自然科学基金(30 1 70 7 7 2)。
* 通讯作者(E-mail：shenhl-cf@nefu.edu.cn；Tel/Fax：
0 45 1-82 1 91 04 4)。
植物体细胞胚同步化发生的控制
张宇，沈海龙 *
东北林业大学林学院，哈尔滨 150040
Control of Synchronization for Plant Somatic Embryogenesis
ZHANG Yu, SHEN Hai-Long*
School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
提要：体细胞胚发生的不同步是植物胚状体发生过程中的问题之一。控制体细胞胚同步发生的方法主要有物理方法和
化学方法，文章就此作简要介绍。
关键词：植物；体细胞胚；同步化发生
充分利用植物体细胞胚的前提是应有一个高
频率和同步化的体细胞胚发生体系，这也是自动
控制其进程和研究其生理、生物化学和分子生物
学等问题所必需的。在生产实践中，要真正实现
体细胞胚的工厂化和自动化生产，满足优良品系
大量扩繁的需要和为生产应用开辟有效途径，首
先要做到体细胞胚发生的同步化。另一方面，人
工种子的研制也要求体细胞胚必须是高频率同步诱
导，这不仅要求数量多、质量高，而且还要求
胚状体在形态上大小一致，发育进程相似，如此
制成的人工种子其活力强，萌发率高。取得同步
分裂的细胞培养系，既可控制细胞的分裂速度，
改善细胞间的均一性，又可使全部细胞的分裂周
期处于同一时期，这种细胞于细胞周期的某一时
期取样，可以得到具有相同代谢活动的均一细胞
样品，从而为进一步分析测定细胞分裂过程中脱
氧核糖核酸、核糖核酸和蛋白质的合成及降解提
供均一的实验材料(焦顺兴等 1995)。随着植物体
细胞胚发生研究的不断深入，现已从多种植物中
成功诱导出体细胞胚并获得大量再生植株(姜凤英
等2006)。但在体细胞胚的研究中仍有很多问题需
要解决，体细胞胚发生的不同步化就是其中之
一。近年来，人们在体细胞胚同步化发生的研究
中已取得了一些进展，本文就此作简单介绍。
1 细胞同步化和植物体细胞胚的不同步化
细胞同步化是指在自然过程中发生的，或经
人为处理形成的细胞周期同步化。前者称为自然
同步化，后者称为人工同步化。自然同步化所得
到的细胞群体数量有限，且受诸多条件的限制。
姜安丽等(1997)将细胞同步化(synchronization)定义
为：用人为的方法使培养细胞共同进入细胞周期
的同一时期。另外，也有人将细胞同步化定义为
在自然或实验条件下，一个细胞群体中的所有细
胞都处于细胞周期的同一时相(时期)的现象，即
培养物中的所有细胞都处于细胞周期的相同时期。
细胞同步化是体细胞胚发生同步化的基础。
所谓体细胞胚的不同步化是指在同一外植体
的体细胞胚处于不同的发育时期，或处于同一发
育时期的体细胞胚大小不同。在体细胞胚发生过
程中，细胞的分裂和分化往往是不同步的，加上
胚性细胞和次生胚的不断形成，以致体细胞胚的
产生也不同步，即在同一培养体系中有处于不同
发育时期的体细胞胚。崔凯荣和戴若兰(2000)认
为体细胞胚发生不同步化的原因可能是：(1)从脱
分化形成的愈伤组织，再转移至诱导分化胚性细
胞时，细胞的状态和启动分裂不一致，以致出现
多样化的原胚细胞群；(2)在某些条件下，体细胞
胚发生是先后或反复进行的，新的胚发生中心有
可能从原胚细胞群或从胚体中产生。桑庆亮和赖
钟雄(2000)根据荔枝的研究结果认为体细胞胚的不
同步性可能是养分供给不平衡或者体细胞胚本身同
步性较差造成的。这种发育的不同步性对于研究
体细胞胚的发生和发育以及人工种子的应用研究都
非常不利。
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目前，在已获得体细胞胚发生的植物中，仅
胡萝卜、黄连、水稻和枸杞等少数几种植物中有
过细胞同步化培养及体胚发生同步化控制的报道
(柯善强等 1992)。而木本植物中体细胞胚同步化
的研究尚未见到有突破性进展的报道。
2 控制植物体细胞胚同步化的方法
细胞周期中的G1期(从有丝分裂完成期到DNA
复制之前的间隙时间)、S期(DNA复制的时期)、
G2期(DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时
间)和M期(细胞分裂开始到结束)各期持续时间和
生化过程各不相同，对外界的需求和反应也各不
相同，对此，可以采取一些措施使其进入同步化
状态。
目前，人们已发现多种可促进植物体细胞胚
同步化发生的方法，可根据细胞来源不同而选
用。大多数报道称用液体悬浮培养比固体培养更
易获得同步化的植物细胞，此方法对于间接发生
的体细胞胚的效果更佳。Tonon等(2001)用悬浮培
养方式从尖果梣(Fraxinus angustifolia)获得高频率
同步化的体细胞胚。Osuga等(1999)采用悬浮培养
获得高频率同步化的胡萝卜体细胞胚。Jayasankar
等(1999)发现悬浮培养可促进葡萄体细胞胚的同步
化水平，并可减少畸形胚的发生。Choi和 Jeong
(2002)在用悬浮方式进行人参的体细胞胚发生培养
中发现所有体细胞胚都是独立发生的，不经过任
何特殊筛选或同步化处理即处于同步状态。但由
于植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易聚
集并进入不同程度的分化状态，因此要达到完全
同步化对于植物细胞培养来说仍然十分困难；而
且，同一方法对不同植物以及同一植物的不同品
种、不同类型、不同组织或器官诱导体细胞胚形
成都有很大差异，因此人们应不断尝试采用其他
方法来控制植物体细胞胚的同步化(张智俊等
2004)。迄今，控制体细胞胚同步化的方法主要
分为物理方法和化学方法 2类。
2.1 物理方法
2.1.1 温度处理 低温可导致发育停滞，即形成所
谓的温度伤害(temperature shock)，温度伤害常可
增加胚性细胞同步化。低温处理后恢复至正常温
度时，胚性细胞即可同步分裂。不同温度对细胞
有丝分裂有影响，在一定温度范围内，温度下
降，有丝分裂周期加大，分裂期相应地延长，有
丝分裂指数提高(Doležel等 1992)。有研究表明，
短暂的低温处理可提高有丝分裂指数，增加早期
染色体数目，比未恢复培养和短时恢复培养的有
丝分裂指数高，早期染色体比例较多。这说明低
温有促进同步化的作用，即由于在细胞对数生长
期间，分裂期的细胞仅占 3%~4%，数量不充足，
温度伤害后，随着培养温度的降低，细胞中DNA
合成受阻或停止，细胞趋向 G1期；当恢复培养
后，大量细胞即进入 DNA合成期，随后便出现
一个明显的细胞分裂高峰，于是细胞分裂指数明
显提高(冯立新等 2005)。梅兴国等(2001)报道，
低温可促使红豆杉悬浮培养细胞同步化，此种细
胞以 4 ℃处理 24 h，再恢复培养 24 h后，分裂指
数可达 10.26%。刘华和钟阳(2000)以及陈凡国等
(2004)的研究也证明低温在同步化中有作用。
高温或低温能使细胞停止分裂但不能停止生
物合成，如 DNA复制并不同步化。前期细胞内
含物(蛋白质、淀粉、核酸等)积累不充分和分裂
较慢的细胞，在温度伤害之后可赶上其他细胞的
分裂。单一的温度伤害，只有一小部分细胞同步
化，但如以高温处理数次，就可一次又一次地使
大量细胞聚集在分裂前的时期，从而促使绝大多
数细胞同步化(梅兴国等 2001)。
迄今为止，无论是在动物还是在植物的细胞
培养中，低温处理都是效果较好的同步化方法。
适当的低温一般不会引起细胞染色体变异，且操
作简单、方便，因此认为用低温处理的方法促使
细胞同步化比较合适。但此法的细胞同步化率还
不够高，有待进一步探讨。
2.1.2 过筛选择 将胚性细胞及悬浮液分别通过20、
30、40和 60目的滤网过滤、培养、再过滤。重
复几次后，可获得所需要的材料。此法简单易
行，是目前控制植物体细胞胚同步化发生方法中
应用最为普遍的。但此法仅适用于液体培养的体
细胞胚。
2.1.3 渗透压筛选 不同发育时期的胚对渗透压有不
同的要求。例如，向日葵的幼胚在发育过程中，
渗透压有明显变化，球形胚的渗透压为 17.5%，心
形胚的为 12.5%，鱼雷形胚的为 8.5%，而成熟
胚的则降至 0.5%，即胚状体由小到大，其渗透
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压由高到低。根据不同发育时期的胚状体对渗透
压要求的不同，可用高浓度的蔗糖或聚乙二醇培
养基来控制胚的发育，使其停留于某一时期，然
后降低糖的浓度，使胚状体进入同步发育状态。
此法也是目前使用较多且效果较好的体细胞胚同步
化控制方法，其不足之处在于蔗糖浓度过高会极
大地降低胚性愈伤组织的活力和后来的胚性能
力；而且，蔗糖浓度过高还会对形态建成起负作
用(Danso和 Ford-Lloyd 2004)。
2.1.4 不连续密度梯度离心(discontinuous density
gradient centrifugation，DPGC) 根据不同浓度
Ficoll (一种多聚糖)溶液能产生不同密度梯度的原
理，对不同比重的细胞进行离心筛选，从而得到
发育较为一致的体胚。Câmara Machado da等
(1995)即采用过滤和离心的方法进行胚性细胞同步
化控制的。
2.1.5 分级仪淘选胚性细胞 分级仪的原理是根据
不同发育时期的体细胞胚在溶液中的浮力不同而设
计的。淘选液一般用 2%的蔗糖，进样速度为 15
mL·min-1，经过几分钟的淘选后，体细胞胚即分
为几级，由此可获得一定纯化的成熟胚，其转化
率在 75%以上。分级仪可将合适的胚分选出来供
制种用，较小的胚和细胞团仍保持在无菌状态并
可能继续产生体细胞胚。
DPGC离心筛选和植物胚性细胞分级仪淘选
虽然都可得到发育比较一致的体细胞胚，但这些
方法不适合于发育早期和更为早期的体细胞胚同步
化调控，对体胚发生机制的研究有一定的局限性。
2.1.6 手工选择 在无菌操作条件下，逐个地筛选
体细胞胚。此法仅适用于实验室小规模的试验。
2.2 化学方法
2.2.1 饥饿 在一个培养体系中，如果细胞生长所
需的基本成分(如各种盐、维生素、糖等)丧失，
细胞即会因饥饿而致使分裂受阻，从而停留在某
一分裂时期。当在培养基中加入所缺少的营养成
分或将饥饿细胞转入营养成分完全的培养基上时，
细胞又重新恢复分裂。饥饿导致的细胞分裂受
阻，常常会使细胞不能合成DNA，即不能进入 S
期，或细胞分裂不能进行，即不能进入 M 期。
因此，采用饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步
化细胞。有研究显示，处于氮( N)饥饿的细胞，
一般仅可获得G1期的同步化细胞；细胞处于磷(P)
和碳(C)饥饿时，常可获得G1和G2期的同步化细
胞(Chawla 1999)。Smith和Muscatine (1999)在培
养从海葵(Aiptasia pulchella)体内分离出的共生甲藻
(Symbiodinium pulchrorum)的细胞时，同时用氮和
磷饥饿处理 50 h后，有 50%的甲藻细胞处于 G1
期；饥饿解除后，甲藻细胞立即进入S期并恢复细
胞生长，从而获得较好的细胞同步化培养体系。
迄今为止，在动物和植物细胞的同步化培养
中都广泛采用饥饿法(Korfiatis等 2001；Lee等
2001)。
2.2.2 阻断和解除 采用氟尿嘧啶(5-fluorouracil，
5FU)等化学物质，适当阻断细胞循环进程，可促
使细胞产生同步化。在细胞分裂周期中用这类化
学物质处理，可促使核苷酸类物质[如5-氟脱氧尿
苷(floxuridine，FudR)、过量的胸苷(thymidine，
TdR)和羟基脲(hydroxyurea，HU)等]在一个特殊
阶段的细胞内积累，细胞分裂受阻，从而使其都
停留于此发育阶段；阻断解除后，细胞重新恢复
分裂，即同步地进入下一个阶段。
2.2.3 阻止有丝分裂 秋水仙碱是纺锤体的抑制剂，
可抑制细胞的有丝分裂。但秋水仙碱处理时间不
宜过长，否则会引起不正常的有丝分裂。有些研
究是在细胞培养初期加入抑制DNA合成的药剂(如
5-氨基尿嘧啶，5-aminouracil，5AU)，使细胞
DNA合成暂时停止；除去DNA抑制剂时，细胞
即进入同步分裂(郭文义等 2004；Chu和 La rk
1976)。Pan等(1993)在大麦根尖分生组织细胞中
期用HU和甲酰氨草磷(amiprophos-methyl，APM)
的双阻断法同步化诱导可得到高达 50%的中期细
胞。但HU和APM二者均直接作用于细胞的染色
体，容易引起染色体变异，使用时应考虑。
2.2.4 气体调节 每隔 36 h 向连续培养中的大豆细
胞吹入 3%或 5%的乙烯 3 h，可以使细胞分裂同
步化；如果在用 3%的乙烯处理 3 h后接着用 3%
的 CO2处理 3 h，则同步化效果更好；且这些处
理效果都好于用氮气处理(Constabel等 1977)。
Shimazu和Kurata (1999)报道，有 7%的氧气溶解
于培养基中即会抑制胡萝卜子叶胚的发育，从而
促使体细胞胚停留于鱼雷胚期。
用化学方法控制细胞使之同步化有许多优
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点，化学试剂对许多类型的细胞均有效，不需要
特殊的仪器，而且可以获得较高的同步化率和收
获率，其缺点是会干扰细胞的正常调节过程，以
致畸形胚增多。一般认为重复过滤法比较简便，
且可避免由于化学物质处理所诱导的体细胞变异
(郭勇等 2004)。
此外，陈春玲和赖钟雄(2002a，b)通过控制
培养基中 2 ,4 -D 的浓度调控龙眼体胚的发育进
程；Hutchinson和 Saxena (1996)用乙酰水杨酸
( A S A )可提高天竺葵体细胞胚的同步化水平；
Smiskova等(2005)报道，脱落酸(ABA)和聚乙二醇
(PEG)可明显影响五味子球形胚的同步化水平；
Osuga等(1999)将荧光染料注射到胡萝卜细胞中也
可获得同步化的体细胞胚；李涛等(2000)用交变
应力控制烟草细胞分裂的同步化；有时几种方法
结合使用也可收到良好的同步化效果，如柯善强
等(1992)采用物理、化学以及生长调节剂与过筛
相结合的综合方法获得了同步率达60%~85%的黄
连体细胞胚。
需要指出的是，无论是何种细胞同步化处
理，对细胞本身或多或少都有一定的伤害。如果
处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理
想的同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡。
因此，在进行细胞同步化处理之前，细胞必须进
行充分的活化培养。用于试验的细胞系最好是处
于对数生长期的。
3 植物体细胞胚同步化发生的机制
侯敢等(2001)用 TdR双阻断法制备同步化细
胞，TdR是细胞 DNA合成不可缺少的前体，向
培养基中加入过量 TdR，可形成过量的三磷酸腺
苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而
抑制DNA的合成，细胞应控制在DNA合成的前
期；当重新加入完全培养基后，大部分细胞即进
入同步化状态。上面所提到的渗透压筛选法也是
一种通过渗透压的调节使体胚停留于某一阶段的方
法；温度伤害可使细胞趋于 G1期，而数次高温
处理可使大量细胞处于分裂前的阶段；P a n 等
(1993)用双阻断法曾获得较多的大麦中期细胞。
总之，从上述诸多控制细胞同步化的方法中不难
看出，体外培养细胞同步化的方法虽有多种，但
其基本原理相同，都是使细胞停止在细胞周期的
某一时期。
4 结语
在体细胞胚培养中建立一个胚高频率同步化
发生的实验系统，是实现植物转基因工作的先决
条件，这对胚发育的理论研究和人工种子的应用
研究均很重要。与此同时，植物体细胞胚同步化
材料所产生的高频率的体细胞胚，可用于植物遗
传转化的研究。体细胞胚同步化受诸多因素制
约，除了上面提到的可通过各种理化因子进行适
当调节之外，植物种类和外植体来源的差异、试
验材料本身的细胞敏感性即对各种处理的反应程
度，以及胚发生潜力等遗传因素也有很大影响。
在研究体细胞胚发生及其同步化控制时，应从材
料选择、各种处理对培养物的适用性和胚发生规
律等诸多方面给予综合考虑。直到目前为止，体
细胞胚同步化问题仍是尚未解决的难题。对此问
题，我们认为今后的工作应在以下几个方面进
行：(1)提高接种物的均匀性，并抑制额外或次生
胚的产生；(2)体细胞胚发生的实质是细胞分化的
问题，因此应从分子水平上进行更深入的研究，
掌握细胞分化的分子机制；(3)对体细胞胚不同发
育阶段的细胞内含物(如糖类、蛋白质、核酸、
激素等)的变化趋势进行深入研究，了解其与外源
物质(如蔗糖、激素、附加物等)相互作用的关
系；(4)通过基因差异表达和调控以及内外源物质
的共同作用进行体细胞胚同步化的控制。另外，
最近在如类受体蛋白激酶基因(SERK)(陈小飞等
2005)与体细胞胚发生发育相关基因的研究取得了
长足的进展，以后这方面的研究也应加强。
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