全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月754
一种用高效液相色谱-电喷雾/串联质谱(HPLC-ESI/MSn)定量检测植物组
织中微量 1-氨基环丙烷 -1-羧酸(ACC)含量的方法
马莹莹, 盖颖, 陈伟奇, 蒋湘宁 *
北京林业大学生物科学与技术学院, 北京 100083
Quantitative Determination of 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylic Acid (ACC)
Content in Trace of Plant Tissues by High Performance Liquid Chromatogra-
phy-Electrospray Tandem Mass Spectrometry (HPLC-ESI/MSn)
MA Ying-Ying, GAI Ying, CHEN Wei-Qi, JIANG Xiang-Ning*
College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
提要: 介绍一种用高效液相色谱碳 18 柱(HPLC-C18)分离、电喷雾串联质谱(ESI-MSn)鉴定和定量检测植物组织中微量
1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)含量的方法, 其最低检测限达0.7 pmol, 标准曲线线性符合系数为0.9992。建立了从20~100 mg
微量植物样品中提取ACC和固相萃取(SPE)预纯化的方法, 加样回收率为95.1%±4.2%。此种提取方法结合HPLC-ESI/MSn
分析与定性定量检测苹果 ‘2001富士 ’中ACC含量为 306.6 ng·g-1 (FW), 表明此法适合于定性定量检测植物样品中的微量
ACC。
关键词: 1-氨基环丙烷 -1-羧酸(ACC); 固相萃取; 高效液相色谱 -电喷雾 /串联质谱(HPLC-ESI/MSn)
收稿 2008-02-25 修定 2008-06-23
资助 国家自然科学基金(30571512)和国家自然科学基金重点
项目(3 06 3 0 0 53 )。
* 通讯作者(E-ma i l : j i angxn@bj fu .edu .cn; Tel : 01 0 -
6 2 3 3 8 0 6 3 )。
乙烯是五大类植物激素中唯一的以气体形态
存在的化合物, 对植物生长发育有广泛影响。1-氨
基环丙烷 -1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxy-
lic acid, ACC)是乙烯生物合成的直接前体, 也是乙
烯生物合成途径中一个中间代谢物。植物组织中
ACC含量一般随着乙烯生成量的增加而增加, 乙烯
生成受到抑制时ACC的含量即随之下降(张满效等
2000)。一般来说, 它与植物体内一系列生理生化
反应关系密切。
测定植物组织中ACC含量的方法很多, 大多是
采用间接的方法, 即将ACC转化为乙烯或是将ACC
衍生化再用气相色谱仪(gas chromatography, GC)
(韦军 1994; 金昌海等 2006; Park等 2006; Hermann
等 2007; Seo等 2007)、毛细管电泳(capillary
electrophoresis, CE) (Smets等 2003; Liu等 2004;
Castro-Puyana等 2007)和液相色谱(high perfor-
mance liquid chromatography, HPLC)与GC联用的
方法(Hall等1989); 也有人采用直接检测ACC的方
法, 即用 CE (Kazmierczak和Kazmierczak 2007)和
高效液相色谱 -电喷雾 /串联质谱(high performance
liquid chromatography-electrospray tandem mass
spectrometry, HPLC-ESI/MS-MS) (Petritis等 2000,
2003)的方法。前者都存在着ACC转化率和衍生
化率的问题, 不能准确定量植物样品中ACC的含
量, 后者则存在提取方法复杂和植物样品需用量大
的缺点, 不便于大量样品的同时操作, 浪费大量的
有机试剂。植物体内ACC含量较低, 且易破环, 因
此, 本文以 HPLC-MS为基础, 建立了一种简便、
快速和直接测定植物组织中微量ACC含量的方法,
对精准、灵敏地测定ACC的含量、深入研究ACC
在植物生长发育中的作用都有意义。
材料与方法
1 仪器、试剂和材料
仪器有美国 Thermo Finnigan LCQ DECA XP
MAX电喷雾离子阱多级质谱仪、Surveyor四元梯
度泵、Surveyor 自动进样器、高速离心机、超
技术与方法 Techniques and Methods
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声仪、Thermo FastPrep Bio101微量样品破碎仪、
离心管及常用玻璃器皿等。
试剂有乙酸(色谱纯, Baker公司)、甲醇(色谱
纯, Merck公司)、水(市售乐百氏纯净水)、ACC
(Sigma公司)。
实验材料为市售苹果(Malus pumila Mill) ‘2001
富士 ’, MCX固相萃取小柱(3cc 60 mg, Waters公
司)。
2 方法
2.1 ACC的HPLC-ESI/MSn分离检测条件 色谱
条件: Zorbax Eclipse XDB-C18分离柱(2.1 mm×150
mm, 3.5 µm, Agilent Technologies), 柱温为28 ℃, 流
动相为甲醇和0.1%乙酸水溶液(比例为1:9)等梯度
洗脱, 流速为 165 µL·min-1。ESI/MSn条件: 电喷
雾离子源(ESI), 阳离子模式, MS/MS全扫描, 鞘气
(sheath gas, N2)流速为 50 arb, 辅助气(N2)流速为
10 arb, 喷雾电压为3.5 kV, 传输毛细管温度为300 ℃,
传输毛细管电压为 3.0 V, 碰撞能量为 22.5 eV。
2.2 ACC标准曲线的系列浓度溶液配制 准确取
ACC固体样品, 用容量瓶定容, 将其配制为母液, 母
液再进行逐级稀释, 分别配制成 2 000、1 000、500、
250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9和 0 pg·µL-1
共 11个浓度标样。
2.3 最低检测限 色谱仪器的检测限不仅反映了仪
器的灵敏度, 还间接地影响样品的检测。仪器的检
测限越低, 检测植物样品中痕量物质成分就更准确,
所以要尽可能降低仪器的检测限。在测定标准曲
线的同时, 还测定了ACC的最低检测限。
2.4 植物组织中ACC的提取和预纯化 准确称取植
物样品, 以 Thermo FastPrep Bio101微量样品破碎
仪破碎或于液氮中研磨, 以10倍体积去离子水超声
提取 30 min, 12 000×g离心 20 min, 取上清液并调
pH值小于 4, 用等体积氯仿洗涤一次, 取水相, 过
MCX固相萃取小柱, 分别用 2 mL甲醇和 1 mL水
洗柱, 最后用 1 mL 1 mol·L-1氨水(溶剂为甲醇)洗
脱, 收集并用氮气吹干, 以流动相复溶后用HPLC-
M S检测。
2.5 加样回收率 标准样品、植物样品和植物样品
中添加标准样品分别经过提取后以仪器检测得到色
谱峰的峰面积, 用标准曲线公式分别计算这些峰面
积对应的进样量, 分别记为 S0、S1和 S2, 回收率 =
(S2-S1)/S0×100%。
结果与讨论
1 ACC的ESI裂解行为和碰撞能量的优化
在 ESI/MSn阳离子模式下, ACC的母离子
[M+H]+质荷比(m/z)为102, 在二级MS中母离子发
生断裂生成子离子[H2N＝ CH— R]+ (R为氨基酸
残基) m/z为 56 (Petritis等 2000; 王一红等 2006)
(图 1)。子离子是ACC的特征离子, 下面实验均采
用子离子做定性定量分析。另外, 碰撞能量会严重
影响母离子和子离子的离子丰度(Petritis等2000)。
随着碰撞能量的增加, 母离子逐渐减少, 子离子逐
渐增加, 子离子在最大值之后即随着碰撞能量的增
加又逐渐减少, 碰撞能量为22.5 eV时, 子离子相对
丰度最高(图2)。
图 1 ACC的裂解
图 2 相对离子丰度与碰撞能量之间的关系
2 ACC的HPLC分离和MS检测鉴定
Thermo Finnigan LCQ DECA XP MAX电喷雾
离子阱多级质谱仪在低质量范围内, m/z扫描范围
可从 25~2 000, ACC的碎片离子完全可以检测到。
对于流动相的选择, 甲醇和乙腈对ACC分离效果差
异不大, 乙酸水溶液的pH应尽可能低一些, 但一定
要在仪器的承受范围内, 这样对ACC峰形的改善有
很大帮助。ACC是一个环状小分子, 亲水性极强,
流动相流速为165 µL·min-1时, ACC的保留时间为
2.20 min, 在MS/MS全扫描条件下得到MS图(图
3 )。
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3 标准曲线的绘制和最低检测限
用Surveyor自动进样器将配好的11个浓度的
ACC标样分别进样 10 µL, 每个浓度重复 3次,
HPLC-ESI/MSn记录总离子流图。根据ACC母离
子与子离子的m/z分别为 102和 56、保留时间为
2.2 min和信噪比大于 3这几个条件, 测得该仪器
对ACC的最低检测限为 0.7 pmol。用仪器所带的
专业软件计算得到色谱峰的峰面积, 绘制进样量-峰
面积标准曲线(图 4), 标准曲线公式为 y=0.8445x-
0.2464, 线性符合系数为 0.9992, 可以根据该曲线
对植物样品中的ACC进行定量分析。
样, 另外 3份分别加入 25、50和 100 ng ACC标
样, 再取 25、50和 100 ng ACC标样, 共 7个样
品。每个样品重复 3次, 分别按照 2.4节中ACC的
提取和预纯化流程提取ACC, 氮气吹干后用100 µL
流动相复溶, 取10 µL上样进行HPLC-MS检测, 重
复 3次, 得到相应的色谱峰。用仪器所带的专业软
件计算这些色谱峰的峰面积, 根据标准曲线计算这
些峰面积所对应的进样量, 最后根据 2.5节中回收
率的计算公式计算ACC的平均加样回收率为95.1%±
4.2% (表 1), 以后再依据此种提取预纯化方法提取
植物样品中的 ACC。
图 3 ACC HPLC分离离子流图(a)和ACC MS图(b)
a: 子离子 m/z为 56离子峰; b: 母离子 m/z为 102, 子离子 m/z为 56。
4 加样回收率
取 50 mg苹果果肉 4份, 其中1份不加ACC标
图 4 ACC标准曲线
纵坐标表示特征碎片 m/z为 56 的离子峰面积, 横坐标表示
A C C 的进样量。
表 1 加样回收率
添加质量 /ng 加样回收率 /%
25 99.3±4.44
50 92.0±2.08
100 93.9±2.06
　　n = 3。
5 植物样品中的ACC检测
取 50 mg苹果果肉按照 2.4节中ACC的提取
和预纯化流程, 经HPLC-MS检测得到苹果果肉中
ACC的色谱图和MS图(图 5)。其中保留时间为
2.20 min的峰就是从苹果中提取的ACC的特征离
子峰, 其MS图与标准样品中ACC的MS图(图 3)
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完全一致。用仪器所带的专业软件计算峰面积, 根
据标准曲线公式得到该峰面积对应的进样量, 再根
据平均加样回收率计算50 mg样品中的ACC含量,
进而得出苹果果肉中的 ACC含量为 306.6 ng·g-1
(FW)。
总之, 样品的提取和预纯化是检测ACC含量的
核心内容, 在样品提取时, 常受到不同程度的色素
干扰, 为了除去这些色素, 我们分别采用石油醚、
氯仿和乙酸乙酯进行萃取, 三者之中样品 pH小于
4的条件下用氯仿为萃取剂的萃取效率最高, ACC
几乎没有损失。此外, 植物样品中许多杂质也会直
接影响ACC的色谱分离和ACC的定性定量检测,
为了减少这些杂质的干扰, 我们又对MCX阳离子
交换柱、DEA阴离子交换柱和SEP-PEK柱的纯化
效率和回收效率进行比较的结果表明, 以MCX阳
离子交换柱提取的样品在液相色谱中杂峰少, 回收
率高, 其他两种方法杂峰则多, 很难对ACC进行定
性, 且回收率很低(分别为 1%和 50%)。还有, 分
析中应采用旋转浓缩的方法浓缩样品, 但在提取
ACC的过程中应避免于40 ℃以上的高温条件下浓
缩, 因为ACC在此种条件下极不稳定, 为此, 我们
采用了室温氮气吹干的方法。
测定加样回收率和植物样品中ACC含量的结
果表明, 本文方法有一定的可行性, 毋需将ACC转
化或衍生化, 操作简单, 植物样品用量少, ACC的
最低检测限可以达到pmol量级, 完全适合于植物组
织中微量ACC的分析, 可能也适用于食品营养和医
药卫生行业中ACC的定性定量分析。
参考文献
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