全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月264
花楸体细胞胚发生过程中抗氧化酶活性的变化
张建瑛，杨玲，沈海龙 *
东北林业大学林学院，哈尔滨 150040
提要：花楸体细胞胚发生过程中，胚性愈伤组织可溶性蛋白含量高于其他类型的愈伤组织，非胚性愈伤组织中超氧化物
歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性均高于其他类型的愈伤组织；SOD、POD活性均在胚性细胞向
球形胚转化时下降，球形胚向心形胚发育时下降，心形胚向鱼雷形胚和鱼雷形胚向子叶形胚发育时再升高；CAT活性变
化规律与SOD和POD活性变化不同，从胚性细胞到鱼雷形胚的 3个发育时间内表现为下降 -升高 -下降的趋势，鱼雷形
胚向子叶胚发育时略有回升。据此认为，SOD酶活性降低似可作为花楸胚性细胞分化以及胚胎早期发育的一个判断指标。
关键词：花楸；体细胞胚发生；抗氧化酶活性
Changes of Antioxidative Enzyme Activity in Somatic Embryogenesis of Sorbus
pohuashanesis Hedl
ZHANG Jian-Ying, YANG Ling, SHEN Hai-Long*
School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: During somatic embryogenesis of Sorbus pohuashanesis, the content of soluble protein in embryonic
callus was higher than that in other types of calli and the activities of SOD (superoxide dismitase), POD
(peroxides) and CAT (catalase) in non-embryonic callus were higher than that in other types of calli; the
activities of SOD and POD decreased from embryogenic tissues to globular embryos, decreased from globular
embryos to heart-shaped embryos, and increased again from heart-shaped embryos to torpedo embryos and
from torpedo embryos to cotyledon embryos. The activity variation pattern of CAT differed from SOD and
POD, showed a decrease-increase-decrease pattern during the first 3 stages from embryogenic tissues to
torpedo embryos and increased slightly in the last stage from torpedo embryos to cotyledon embryos. Accordingly,
SOD activity decreased may be an index of differentiation of embryogenic cells and early development of
somatic embryos of Sorbus pohuashanesis.
Key words: Sorbus pohuashanesis; somatic embryogenesis; antioxidative enzyme activity
收稿 2006-12-31 修定　 2007-03-12
资助　 国家“十一五”科技支撑课题(200 6BAD03A04)和东
北林业大学校立基金(20 05 -2 00 7)。
* 通讯作者(E-m a i l：she nhl -c f@nefu .edu . cn；T el：
0 45 1-82 1 91 04 4)。
影响植物体细胞胚发生的因素有基因型、外
植体、植物生长物质、还原性氮盐和外源氨基
酸、蔗糖渗透压、活性炭、金属离子、光、活
性氧和 pH值等内外各种因素(袁澍等 2003)，其中
活性氧对植物体既有伤害作用也有诱导作用(田敏
等 2005)，适当浓度的H2O2对体细胞胚的发生有
很好的诱导作用(崔凯荣等 1998)，活性氧还可以
诱导多种多肽的合成和引起细胞内 Ca2+的释放，
从而调控基因的表达(Cui等 1999)。植物体内活性
氧的生成和清除处于动态平衡之中(Gupta和Datta
2 0 0 3 )，这种动态平衡主要是通过过氧化物酶
(peroxides，POD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)
等酶系统调节的(崔凯荣和戴若兰 2000)。所以抗
氧化酶活性变化可以反映活性氧的平衡状态。研
究体细胞胚发生过程中抗氧化酶活性变化，以了
解体细胞胚发生与活性氧平衡的关系，对人工调
控活性氧平衡状态，控制体细胞胚发生和发育是
有意义的。植物体细胞胚发生和发育过程中抗氧
化酶活性研究已有些报道(詹园凤等 2006；Cui等
1999；王亚馥等 1989，1993；李付广等 1994；
吴家和等 1999；邢更妹等 2000；刘成圣等 2002；
杨和平等 1992；臧运祥 2004)，但花楸体细胞胚
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发生发育过程中抗氧化酶活性的研究尚未见报道。
本文以花楸未成熟合子胚为外植体诱导的愈伤组织
和体细胞胚为材料，研究其体细胞胚发生过程中
超氧化物歧化酶(superoxide dismitase，SOD)、
POD和CAT活性变化及其与体细胞胚发生发育的
关系，从而为建立稳定高效的花楸体细胞胚发生
体系建立基础资料。
材料与方法
以MS为基本培养基，在不同浓度 6-BA (6-
benzyladenine)和 2,4-D (2,4-dichlorophen oxyacetic
acid)的组合下诱导花楸(Sorbus pohuashanesis Hedl)
体细胞胚发生。取暗培养的胚性愈伤组织(黄色、
颗粒状、松散)、非胚性愈伤组织(白色或浅黄
色、致密)、褐色愈伤组织(经过多次继代胚性愈
伤呈现褐色、松散状态)和光(光照 16 h/黑暗 8 h，
光强 40~60 µmol·m-2·s-1)下的绿色愈伤组织以及
在体细胞胚分化培养基(MS+0.01 mg·L-1 2,4-D，
pH=5.8)上培养 0 d的胚性愈伤组织、7 d的多细
胞原胚和球形胚、14 d的心形胚、21 d的鱼雷
形胚和 30 d的子叶形胚为材料进行SOD、POD和
CAT活性的测定，并同步测定可溶性蛋白质含量。
样品制备时，准确称取 0.5 g左右上述材料
的新鲜样品，加入 5 mmol·L-1 (pH 7.8)的磷酸缓冲
液，于冰浴中研磨匀浆，4 ℃下以 10 000×g离
心 20 min，上清液为粗酶液。可溶性蛋白含量测
定用考马斯亮蓝G-250法(李合生 2001)。SOD活
性测定用NBT光化还原法(李合生 2001)，POD活
性测定用愈创木酚显色方法(Amako等 1994)，
SOD和 POD活性均以U·mg-1(蛋白)表示。CAT活
性测定参考Beers和Sizer (1952)的紫外分光光度法
并加以改进，酶活性单位以U·mg-1 (蛋白)·min-1表
示。
数据采用Excel 2003软件进行作图，用SPSS
软件对测定数据进行统计分析。
结果与讨论
1 可溶性蛋白含量变化
如图 1和图 2所示，(1)暗培养下，胚性愈伤
组织的可溶性蛋白含量显著高于非胚性愈伤组织
和经过几次继代的褐色愈伤组织，光照下绿色愈
伤组织的可溶性蛋白含量略低于暗培养下的胚性愈
伤组织(P<0.05)(图 1) ；(2)球形胚(培养 7 d)的可溶
性蛋白含量低于胚性愈伤组织，心形胚时期(培养
14 d)显著增加，且高于胚性愈伤组织，以后随
着发育时间的延长可溶性蛋白含量又表现为下降趋
势，子叶形胚时期(培养 30 d)达到最低值(P<0.05)
(图 2 )。
花楸胚性愈伤组织的可溶性蛋白含量显著高
于非胚性愈伤组织，表明前者的代谢比后者活
跃，这与高述民等(2001)和向太和等(1997)的结论
一致。球形胚时期(培养 7 d)的可溶性蛋白含量低
图 2 体细胞胚发生过程中可溶性蛋白含量变化
Fig.2 Changes of soluble protein contents during somatic
embryogenesis
图 1 不同类型愈伤组织中可溶性蛋白含量变化
Fig.1 Changes of soluble protein contents in different
types of calli
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于胚性愈伤组织，表明胚性细胞的分化和发育过
程是极其复杂的。从球形胚时期到心形胚时期，
可溶性蛋白含量有所升高，这为体细胞胚的进一
步发育提供了物质基础。此后，随着体细胞胚的
分化和发育，分化代谢活跃，可溶性蛋白含量下
降，至子叶形胚时期，胚的大小接近成熟胚且分
化停止，可溶性蛋白含量最低。
2 SOD酶活性变化
如图 3和图4所示，(1)光照和黑暗条件下，非
胚性愈伤组织中的SOD活性均显著高于其他类型
的愈伤组织(P<0.05)，而其他类型愈伤组织之间
的 SOD活性则相差不大(图 3) ；(2)体细胞胚发生
和不同发育时期的体细胞胚 SOD活性均有变化
(P<0.05)，随着体细胞胚的出现，SOD活性开始
下降，心形胚时期(培养 14 d)的 SOD活性下降至
最低，其后 SOD 活性持续增加，到子叶胚时期
(培养 30 d)的 SOD活性增加为最高(图 4)。
花楸非胚性愈伤组织的SOD活性高于其他类
型愈伤组织，说明非胚性愈伤组织的氧自由基含
量比较高。在培养过程中，为了诱导细胞的脱分
化和再分化，必须在培养基中加入各种激素等物
质，而这些物质多为富含氧化还原化合物，这就
使细胞可能处于较严重的氧化胁迫中，从而导致
愈伤组织丧失分化能力。胚性细胞分裂形成球形
胚的过程中 SOD 活性下降，这提示我们，SOD
活性下降似可作为判断花楸胚性细胞分化以及胚胎
早期发育的一个指标。　　　　
3 POD酶活性变化
如图 5和图 6所示，(1)不同类型愈伤组织中
POD活性的变化规律与SOD相似。在所有的愈伤
组织中，非胚性愈伤组织中的 POD活性最高，胚
性愈伤组织的 POD活性最低，前者是后者的 58
倍。光照下绿色愈伤组织的POD活性高于胚性愈
伤组织(图 5) ；(2)在胚性愈伤组织转化为体细胞胚
过程中，球形胚(培养 7 d)的 POD活性下降，至
心形胚时期(培养 14 d)下降最低，随着体细胞胚
的不断发育和分化，鱼雷形胚时期(培养 21 d)和
子叶形胚时期(培养 30 d)时 POD活性又回升(图
6)，但始终低于胚性愈伤组织。
图 3 不同类型愈伤组织 SOD活性变化
Fig.3 Changes of SOD activity in different types of calli
图 4 体细胞胚发生过程中 SOD活性变化
Fig.4 Changes of SOD activity during somatic embryogenesis
图 5 不同类型愈伤组织中 POD活性变化
Fig.5 Changes of POD activity in different types of calli
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St Clair等(1994)认为 SOD、POD和 CAT的
活性变化与O2－·和H2O2有关系并决定着体细胞胚分
化。在枸杞体细胞胚发生中，SOD、POD和CAT
相互配合调节胚性细胞的分化和发育(崔凯荣等
1998)。本文结果显示，3种抗氧化酶活性在体细
胞胚发生中有明显变化，而随着胚性细胞的分化
和发育，SOD和POD均表现为先下降后升高这样
一个曲线变化且变化趋势基本一致，而CAT活性变
化则相反。这提示我们 3种抗氧化酶活性与O2－·和
H2O2的关系可能决定着胚性细胞的分化。
已有报道认为，适当浓度的H2O2对体细胞胚
的发生有很好的诱导作用(崔凯荣等 1998)，但对
其中机制却并不清楚。H2O2可能作为一种细胞信
号传递物质，通过细胞的信号传递系统影响基因
的调控表达。从本质上讲，胚性细胞的形成过程
也就是细胞的分化过程，这一过程的核心就是基
因的差别表达过程，因此H2O2可能是在分子水平
上诱导胚胎发生的(崔凯荣等 1998)。关于外源
H2O2和内源H2O2对花楸体细胞胚发生的影响及其
与花楸体细胞胚发生和发育的关系还有待进一步研
究。
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4 CAT活性变化
如图7和图8所示，(1)暗培养下非胚性愈伤组
织的CAT活性显著高于胚性愈伤组织和褐色愈伤
组织，是胚性愈伤组织中的 17倍，光照下绿色
愈伤组织中CAT活性低于暗培养中的胚性愈伤组
织的 CAT活性，4种愈伤组织之间CAT活性差异
显著(P<0.05)(图 7) ；(2)不同发育时期体细胞胚的
CAT活性间差异显著(P<0.05)，胚性愈伤组织转
移到分化培养基上后 CAT活性开始下降，球形胚
时期(培养 7 d)至心形胚时期(培养 14 d)回升并达
到最高，然后急剧下降，鱼雷形时期降到最低，
子叶胚期时活性又略有升高(图 8)。
图 6 体细胞胚发生过程中 POD活性变化
Fig.6 Changes of POD activity during somatic embryogenesis
图 7 不同类型愈伤组织中CAT活性变化
Fig.7 Changes of CAT activity in different types of calli
图 8 体细胞胚发生过程中CAT活性变化
Fig.8 Changes of CAT activity during somatic embryogenesis
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