全 文 ：应用与环境生物学报　2002 , 8(2):190～ 194 　 　
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 　 2002-04-25
　发根农杆菌转化海边香豌豆及
转化体的体细胞胚胎发生＊
王江波#　贾敬芬＊＊
(西北大学生物技术省重点实验室　西安　710069)
摘　要　将海边香豌豆无菌苗的子叶和下胚轴切段在附加 ρ(2 , 4-D)=1 mg L-1 , ρ(6BA)=0.5 mg L-1的 MS 培养
基上预培养 3 d , 然后与发根农杆菌 A4 菌液共培养 30 min.洗涤之后 , 在附加羧苄青霉素的无激素的 MS 培养基上培
养.7 ～ 10 d 后 ,外植体切面处长出许多毛状根.继代培养时生长旺盛 ,且产生许多侧根和分枝.毛状根的诱导频率与无
菌苗培养天数和外植体来源部位有关.子叶切块的诱导率明显高于下胚轴.16 d龄无菌苗的子叶切块诱导毛状根的频
率最高.乙酰丁香酮处理菌液可以有效提高子叶外植体的毛状根诱导频率.将毛状根切段培养在含有 ρ(2 , 4-D)=1.0
mg L -1的 MS 培养基上可诱导出愈伤组织.该种愈伤组织转移到含有ρ(2 , 4-D)=0.3 mg L-1的 MS 培养基上培养时 ,
诱导出了许多早期体细胞胚.检测的转化组织均含有农杆碱和甘露碱.图 2 表 1 参 19
关键词　海滨香豌豆;发根农杆菌;毛状根;转化体;体细胞胚发生
CLC　Q813.12 Q939.1
AGROBACTERIUM RHIZOGENES-MEDIATED TRANSFORMATION
OF LATHYRUS MARITIMUS AND SOMATIC
EMBRYOGENESIS OF TRANSFORMED TISSUES
WANG Jiangbo
# &JIA Jingfen＊＊
(Provincial Key Laboratory of Biotechnology , Northwest U niversity , Xi an , Shaanxi　710069 , China)
Abstract　The segments of co tyledons and hypocoty ls of Lathyrus mari timus were precultured for 3 d on
MS medium supplemented w ith ρ(2 ,4-D)=1.0 mg L-1 and ρ(6BA)=0.5 mg L -1 , and then coincu-
bated wi th Agrobacterium rhizogenes A4 for 30 min.After being cultured for 7 ～ 10 d on M S medium
without any phy toho rmone , numerous hai ry roots were induced on the cut ting si tes of the explants.They
grew vigorously and produced lots of branches and lateral roots.The frequency of hai ry root induction w as
closely related to the age of seedlings and explant resources.The induction frequency of hairy roots f rom
coty ledons w as higher than that f rom hypocoty ls.The highest induct ion f requency w as obtained from
coty ledon segments of 16 d old seedling s.Pretreatment of A .rhezogenes A4 suspension w ith AS(acetosy-
ringone)remarkebly enhanced the hairy roo t induction f rom coty ledon segments.When the hairy roots
were cut into segments and cultured on MS medium containing ρ(2 ,4-D)=1 mg L-1 for tw o weeks , the
calli w ere induced.These calli could dif ferentiate into somatic embryos on MS medium plus ρ(2 ,4-D)=
0.3 mg L-1 for another two weeks.Both ag ropine and mannopine could be detected in the transformed
tissues.Fig 2 , Tab 1 , Ref 19
Keywords　Lathyrus mari timus , Agrobacterium rhizogenes;hairy roots;t ransformed tissues;somatic
embryogenesis
CLC　Q813.12 Q939.1
　　自 1983 年第一个转基因植物———烟草问世以
收稿日期:2001-06-25　　接受日期:2001-07-03
＊国家自然科学基金资助(No.030070366)　Supported by the National
Natural Science Foundation of China(No.30070366)
＊＊通讯作者　Corresponding author
#Address at present:The Graduate College of Marine S tudies , University of
Delaw ave , Lew es , Delawave , USA
来 ,植物遗传转化研究进展十分迅速.在迄今发展起来的
转基因技术中 ,农杆菌(Agrobacterium)介导的遗传转化
仍占主导地位[ 1] .具有 Ti质粒的根癌农杆菌(A .tume-
faciens)转化植物产生冠瘿瘤 ,而具 Ri质粒的发根农杆
菌(A .rhizogenes)转化植物产生毛状根.毛状根具有激
素自主型生长 ,易再生植株 ,转化的植株是纯合体等特
征[ 2] .因此 ,以 Ri质粒作为基因工程新载体的研究已越
来越受到人们的重视.据统计 ,目前已有百余种植物感染
Ri质粒后产生毛状根[ 3] ,其中有一些豆科植物已由毛状
根获得了转化植株[ 4] .
海边香豌豆是一种多年生海边盐渍土生长的野生豆
科植物 ,具有耐盐性 、抗逆性强 ,营养丰富等特点 ,对于发
展畜牧业 ,改良盐碱地 ,丰富遗传育种材料具有重要作
用[ 5] .我们曾从该种植物下胚轴离体培养诱导了愈伤组
织和体细胞胚[ 6] .本研究在此基础上 ,利用发根农杆菌
A4菌株对海边香豌豆进行了转化 ,产生了毛状根 ,进而
从毛状根诱导出新的愈伤组织和大量早期体细胞胚 ,从
而为该植物进一步的细胞遗传操作奠定了技术基础.
1　材料与方法
1.1　细菌菌株及其培养
将低温保存的发根农杆菌 A4菌株室温下活化 2 d
后 ,接种于 YMB 固体培养基上暗培养.长出菌落后 ,接
种于 YMB液体培养基中 ,同时加入 100 mmol L-1的乙
酰丁香酮(acetosy ringone ,简称 AS).于 28 ℃,120 r/min
振荡培养 24 h供感染用.CK菌液不加乙酰丁香酮.
1.2　无菌苗的获得
海边香豌豆〔Lathyrus mari timus (L.)Bigel〕的种
子由山东省东营市农牧局提供.种子经 98%浓硫酸处理
5 min后 ,于 75%酒精中浸 1 min ,然后用 0.1% HgCl2
溶液灭菌 15 min ,无菌蒸馏水冲洗5次 ,接种于无激素的
MS培养基[ 7] 上.暗培养 3 d 后 ,在每天 14 h 光照 、Ev2
000 lx 、25 ℃下生长成无菌苗.无菌苗的生长天数以种子
接种于无激素的 MS培养基中时开始算起.
1.3　毛状根的诱导和培养
将生长 8 d 、10 d 、12 d 、14 d 、16 d 、18 d的海边香豌
豆子叶切成面积约 0.5 cm2的小块 ,下胚轴切成长约0.5
cm 长的切段 ,在附加 ρ(2 ,4-D)=1 mg L-1 , ρ(6BA)=
0.5 mg L -1的 MS 培养基上预培养 3 d ,然后浸入加有
AS的发根农杆菌 A4 菌液中处理 30 min.CK 则在不加
AS的菌液中处理 30 min.取出之后 ,用滤纸吸干多余菌
液 ,然后放回原培养基进行共培养 3 d.每个处理重复 3
瓶 ,每瓶接种 15 ～ 20个外植体.再取出经共培养的外植
体 ,无菌蒸馏水冲洗 3次 ,滤纸吸干后转入附加 500 mg
L-1羧苄青霉素的 MS 培养基上诱导毛状根.切下毛状
根置于 MS加 250 mg L -1羧苄青霉素的培养基中进一
步除菌培养.选择无菌的毛状根在无激素的 MS 培养基
上保存和繁殖.本部分实验均在暗中进行 , θ=25±1 ℃,
以未经农杆菌菌液处理的子叶切块和下胚轴切段为
CK.
1.4　从毛状根诱导愈伤组织和体细胞胚胎发生
将毛状根切成约 0.5 cm 的切段 ,转到含有 ρ(2 , 4-
D)=1.0 mg L-1的 MS 培养基上诱导愈伤组织.2 wk后
将诱导出的愈伤组织转到含有 ρ(2 , 4-D)=0.3 mg L-1
的 MS 培养基上诱导体细胞胚.另将一部分愈伤组织转
到无激素的 MS 培养基上进行培养.每天 14 h 光照 , Ev
=2 000 lx , θ=(25±1)℃.
1.5　冠瘿碱的检测
参考 Petit 的方法[ 8]检测转化组织和未转化的无菌
苗根内的农杆碱和甘露碱的存在.电泳条件:E =40 V/
cm , A =1.5 mA/cm , t=1.5 h.
2　结果与分析
2.1　毛状根的诱导和培养
无论是海边香豌豆无菌苗子叶切块还是下胚轴切段 ,
均在发根农杆菌 A4菌液(AS处理)感染后约 5 d ,在部分
伤口部位出现白色突起.7 d后 ,这些突起已发育成毛状
根.海边香豌豆的毛状根诱导频率与无菌苗的生长天数和
外植体的来源不同有密切的关系.如图 1所示 , 生长 8 d
的子叶切块毛状根诱导率为 17.5%,而 16 d龄的无菌苗
子叶毛状根诱导率达45.3%.苗龄 8 ～ 10 d的下胚轴切段
诱导不出毛状根 ,而 16 d龄的下胚轴的毛状根诱导频率也
很低 ,仅有11.5%.
图 1　无菌苗生长时间对发根农杆菌 A4诱导
海边香豌豆不同外植体生根能力的影响
F ig 1　Effect of culturing time of asepticseedings on
rooting abilities of Lathyrus maritimus cotyledon and
hypoco ty l explants transformed by Agrobactrium rhizogenes A4
　　未用菌液感染的对照材料自始至终没有产生根.
由子叶诱导出的毛状根除菌彻底后 ,转入无激素的
191　2期 王江波等:发根农杆菌转化海边香豌豆及转化体的体细胞胚胎发生 　　
MS培养基上后表现出旺盛的生长 ,并形成许多侧根以
及侧根的分枝 ,从而迅速蔓延整个瓶底(图 2A).
由表 1可见 ,菌液添加乙酰丁香酮(AS)可以明显促进
海边香豌豆毛状根的诱导频率.未用 AS 处理的菌液 ,子叶
切块毛状根产生频率为 18.4%.而用 AS 处理后 ,其频率
提高到 45.3%.同一苗龄的下胚轴切段的毛状根诱导频率
在 AS处理组虽有提高 ,但不明显.
表 1　乙酰丁香酮对发根农杆菌 A4 诱导海边香豌豆子叶和下胚轴外植体产生毛状根的影响
Tab 1　Effect of acetosy ringone on rooting abilities of Lathyrus maritimus
cotyledon and hypocotyl explants transformed by Agrobacterium rhizogenes A4
外植体
Explants
菌株
Bacterium st rains
菌液处理
T reatment of bacteria
外植体数
Number of explants
生毛根的外植体
Explants w ith hai ry root s
毛状根产生频率
Frequency of hai ry root induction(%)
下胚轴
Hypocotyl
CK 47 0 0
53 0 0
A4 -AS 49 5 10.2
+AS 52 6 11.5
子叶
Cotyledon
CK 45 0 0
51 0 0
A4 -AS 59 11 18.4
+AS 53 24 45.3
2.2　毛状根愈伤组织的诱导和体细胞胚胎发生
旺盛生长的毛状根切段接入含有 ρ(2 , 4-D)=1.0
mg L-1的 MS 培养基上 , 2 d后整体膨大 ,1 wk后即诱导
出白色松软的愈伤组织.2 wk后 ,这些愈伤组织趋于浅
黄色.此时 ,将部分愈伤组织转入无激素的 MS 培养基
上 ,再继续培养 10 ～ 12 d后 ,这些愈伤组织表面分化出许
多白色毛状根 ,而愈伤组织本身保持较慢的生长.20 d
后 ,毛状根已长满瓶底(图 2B),其状态与第一代培养在
MS无激素培养基上的毛状根非常相似.然而 ,转入到含
有ρ(2 ,4-D)=0.3 mg L -1的MS 培养基上的另一部分愈
伤组织培养 2 wk 后 ,其表面分化出较多球状结构 ,为早
期球形体细胞胚(图 2C1).3周后 ,一些球形胚发育成心
形胚(图 2C2),但未能得到进一步发展.
2.3　冠瘿碱的检测
本试验选择初生毛状根 ,由毛状根诱导出的愈伤组
织上又长出的毛状根 ,以及由愈伤组织中挑出的体细胞
胚为纸电泳的样品.电泳之后 ,经 AgNO3 染色 ,发现这 3
种材料均可以合成甘露碱和农杆碱 ,而对照根没有检测
到甘露碱和农杆碱(图 2D).
3　讨论
在 Ri质粒介导的转化中 ,寄主植物的状态是极为重
要的.许多研究结果表明 ,即使同一菌种在不同植物[ 9] 、
同一植物的不同器官[ 10] , 甚至同一器官的不同接种部
位[ 11]或者不同接种时期[ 12] ,其转化效果都有差异.有学
者认为 ,幼嫩的植物组织一般更容易被根癌农杆菌感染 ,
而太幼嫩的组织可能因为缺乏农杆菌的附着位点而限制
感染率[ 13] .我们的实验表明 ,相对比较幼嫩的海边香豌
豆无菌苗外植体并不适于发根农杆菌 A4的转化 ,只有当
无菌苗的生长达到一定天数时 ,才会得到较为理想的毛
状根诱导率.此外还有许多研究表明 ,植物细胞在 DNA
合成和细胞分裂的高峰期较易整合外源 DNA[ 14 ,15 , 16] .外
植体在含有外源植物激素的培养基上进行预培养 ,可诱
导细胞分裂 ,为外源 DNA 的导入和整合提供了必需条
件.在预培养 3 d后我们发现子叶切块的膨大比下胚轴切
段明显 ,说明其在外源激素诱导下细胞启动分裂快 ,这也
许是海边香豌豆的子叶转化形成毛状根频率高的原因之
一.对农杆菌质粒转化机制的研究表明 ,受乙酰丁香酮等
植物信号分子激活的 vir区基因的活化和高效表达是农
杆菌 T-DNA向宿主细胞核中转移所必须的[ 17 ,18] ,并能
提高农杆菌对宿主的转化率和敏感性[ 19] .我们发现 ,发
根农杆菌 A4更容易感染海边香豌豆无菌苗的子叶外植
体 ,而乙酰丁香酮处理菌液可以显著提高转化效果.另一
方面 ,海边香豌豆的下胚轴外植体似乎对发根农杆菌 A4
很不敏感.显然 ,发根农杆菌转化植物受多种因素的影
响 ,其原因应主要归结于两个方面 ,一是转化植物生理状
态 、内源激素以及基因表达状态的差异;二是被转化植物
细胞产生的酚类物质等活性诱导物的性质 、种类及数量
差异.
我们曾通过海边香豌豆下胚轴来源的愈伤组织诱导
得到了体细胞胚 , 包括大量的球形胚和心形胚以
及少量的鱼雷胚和子叶胚[ 6] ,但未能得到再生植株.
192 　　　　　　　　应 用与 环 境生 物学 报　　Chin J Appl Environ Biol　　　　　　　　　　　　　　 　　　8卷
图 2　发根农杆菌 A4 对海边香豌豆的转化和转化植株的体细胞胚胎发生
F ig 2　Genetic transformation of Lathyrus maritimus by Agrobacterium rhizogenes
A4 and somatic embryogenesis from transfo rmed tissues
A:在MS 无激素培养基上旺盛生长的毛状根系 Hairy root s grow ing on hormone-free MS medium;
B:由毛状根来源的愈伤组织在 MS无激素培养基上分化出的毛状根 New hairy roots produced f rom hairy-root-derived calli on hormone-f ree MS medium;
C:由毛状根来源的愈伤组织表面诱导出早期体细胞胚(C1:示球形胚 ←;C2:心形胚)Hairy-roots-derived callus with somatic embryos at early stages(×8);
D:转化组织冠瘿碱高压纸电泳分析 .R1:初生毛状根;R2:由毛状根诱导出的愈伤组织上又分化出的毛状根;S:由转化愈伤组织中挑出的体细胞胚;C1:
对照根 a.农杆碱;m.甘露碱 Pattern of high voltage paper elect rophoresi s of opine in the t ransformed tissues.R1:original hairy roots;R2:hairy roots f rom hairy
roots derived callus;S:somatic embryos f rom hairy root s derived callus;C1:Cont rol roots;a.agropine.m.mannopine
由转化的毛状根诱导的愈伤组织在添加不同浓度的 2 ,4
-D 的培养基中也可诱导出许多球形胚和部分心形胚 ,
可是并没有得到体细胞胚的进一步发育.由此看来 ,海边
香豌豆的组织培养再生植株十分困难 ,这可能是因为受
基因型的限制 ,或者 ,还需要特殊的因子来刺激其植株再
生.
豆科植物因其特有的固氮功能 ,一直是人们热衷研
究的对象.而海边香豌豆更具有耐盐碱 、营养丰富等优良
性状.发根农杆菌作为一种有效的遗传工程工具 ,可以对
海边香豌豆加以遗传修饰 ,赋予其新的遗传标志 ,有助于
将这种抗逆性强的豆科植物用于体细胞遗传操作.本研
究所获成果 ,将为我们进一步研究并利用这种植物奠定
基础.
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