全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 6期，2008年 12月1120
丹参胁迫诱导基因 SmSIP1的表达特征分析
赵燕燕, 王 之 *
陕西师范大学生命科学学院, 教育部药用植物资源与天然药物化学重点实验室, 西安 710062
提要: 从丹参 EST库中筛选到一个胁迫诱导蛋白基因, 命名为 SmSIP1, 其序列全长 296 bp, 编码 80个氨基酸。生物信息学
预测表明SmSIP1是一个亲水的, 不具有跨膜结构域, 包含一个N-端信号肽和多个可能的磷酸化位点的蛋白。实时荧光定
量PCR分析显示, SmSIP1在根中的表达量高于茎和叶, 并且受ABA和干旱的诱导, 推测其可能参与根部的胁迫应答反应。
关键词: 胁迫诱导蛋白; 丹参; 生物信息学; 基因表达
Expression Characteristics of SmSIP1 in Salvia miltiorrhiza Bunge
ZHAO Yan-Yan, WANG Zhe-Zhi*
Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry, College of Life Sciences,
Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China
Abstract: A stress induced gene was selected from EST library of Salvia miltiorrhiza Bunge. The cDNA
sequence named SmSIP1 is 296 bp long, encoding a protein of 80 amino acid residues. Bioinformatics analysis
showed that the deduced SmSIP1 was a hydrophilic, non-transmembrane protein with a N-terminal signal
peptides and several probable phosphorylation sites. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect
the expression pattern of SmSIP1 in different organs of S. miltiorrhiza. The results showed that the expression
level of SmSIP1 was higher in the roots than that in the stems or in the leaves. The expression of SmSIP1 could
be induced by ABA and drought, which indicated that it might be involved in the stress response of roots.
Key words: stress-induced protein; Salvia miltiorrhiza Bunge; bioinformatics; gene expression
收稿 2008-09-08 修定 2008-11-07
资助 “十一五 ” 科技支撑计划(200 6BAI06A12)。
* 通讯作者(E-ma il : zzwa ng@snnu .edu .cn; Tel: 0 29 -
8 5 3 1 0 2 6 0 )。
植物在生长发育过程中会遭遇各种不利环境
因子如干旱、高盐、高温、低温、有毒化学物
质等。当植物感受这些逆境信号后会通过信号转
导过程调节细胞内抗逆相关蛋白的表达, 进而调整
自身的生理状态或形态的改变, 来适应不利环境(阮
松林等 2007)。
丹参为唇形科(Labiatae)鼠尾草属植物, 分布广
泛, 具有普遍的逆境耐受性, 探明其抗逆机制对经
济作物抗逆品种的培育是有意义的。本文采用
Blast分析从丹参 EST库中得到了一条与拟南芥、
水稻、杨树、云杉中胁迫诱导蛋白(stress-induced
p r o t e i n )基因有较高同源性的序列 , 命名为
SmSIP1。Sharma和Davis (1995)早前从拟南芥中
克隆到此基因, 此种基因受外界胁迫的诱导, 它和
一些防御性相关基因如PAL和GST的诱导表达模
式不同, 推测其可能是一类新的胁迫诱导蛋白, 但
其明确的生理功能至今尚不清楚。本文对 SmSIP1
的结构和编码蛋白的组成以及特征作了分析, 并用
实时荧光定量 PCR检测了丹参的不同器官以及
ABA和干旱处理后 SmSIP1的表达特征, 为此类基
因的进一步研究和利用提供参考。
材料与方法
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)种子萌发后, 幼
苗移栽至含蛭石的营养钵中, 于人工气候箱中培养,
温度 25 ℃, 湿度 70%, 光暗 16 h/8 h, 光照强度 216
µmol·m-2·s-1, 2 d浇灌一次 1/3MS营养液, 6周后分
别取整株、根、茎和叶, 以液氮速冻 5 min后置
于-80 ℃冰箱中冻藏备用。
采用杭州博日BIOZOL总RNA提取试剂提取
丹参总RNA, 1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质
量。cDNA的合成按照MBI公司的反转录试剂盒
说明进行。丹参总 D N A 的提取采用 C TAB 法
(Saghai-Maroof等 1984)。
以丹参 SmSIP1的EST作为基础序列, 设计特
异 PCR引物进行扩增, 引物序列为 SmSIP1S: 5-
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TGGGAGTGAAAAATGTCGG-3; SmSIP1A: 5-
TTATCATGGGGGCAGAGC-3 。以丹参总DNA
为模板进行PCR反应, 扩增程序为94 ℃10 min; 94 ℃
30 s, 53 ℃45 s, 72 ℃ 1 min, 30个循环; 72 ℃延伸
10 min。
扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后, 用安徽优
晶胶回收试剂盒回收。将回收 DNA片段连接到
Promega公司的 pGEM-T Easy载体上, 并转化大肠
杆菌DH5α中, 菌落PCR验证确认含有插入目的片
段后送到上海生物工程技术公司测序。SmSIP1的
cDNA和 gDNA序列用DNAMAN软件进行分析。
将SmSIP1的cDNA序列及推导的氨基酸序列
用DNAstar、http://www.ncbi.nlm.nih.gow/、http:/
/www.ebi.ac.uk/和 http://cn.expasy.org/等网站提供
的各种生物信息学软件进行在线分析。核酸及氨
基酸序列的组成成分分析, 理化性质分析, 开放阅
读框的查找和翻译利用DNAstar软件及ProtParam
在线软件完成。蛋白质亲水性 /疏水性的分析、跨
膜结构域分析分别用在线工具 P r o t S c a l e 和
TMHMM 2.0 Server进行; 蛋白质二级结构的预测
用 SOPMA在线工具完成。
6周龄的丹参幼苗浇灌100 µmol·L-1的ABA溶
液后, 分别于 2、4、6、12 和 24 h取样; 干旱
处理的丹参幼苗置于滤纸上, 分别于 1 0、3 0、
60、100和 120 min取样。以不作处理的丹参幼
苗为对照。所有样品经液氮速冻后于 -80℃中保
存备用。
根据 SmSIP1的基因序列, 按照荧光定量 PCR
引物设计原则设计 PCR引物: SmSIP1基因的正向
引物为SmSIP1F: 5- TCTTTTCTGCTTTTGTGGGA-
3 ; 反向引物为SmSIP1R: 5 -AAGTTCTGGCGGCTG-
ATG-3。 产物长度为199 bp; 参照基因polyubiquitin
的正向引物为UBF: 5-ACCCTCACGGGGAAGACC-
ATC-3; 反向引物为UBR: 5-ACCACGGAGACGGA-
GGACAAG-3。产物长度为 207 bp。
根、茎、叶的cDNA样品和不同处理的cDNA
样品分别用上述引物进行定量 PCR反应。反应体
系为20 µL: 内含10 µL SYBR Premix Ex TaqTM (2×),
0.1 µmol·L-1上下游引物, 1 µL cDNA模板, 以无菌
水补足体积。每个样品重复 3次。反应条件为: 94
℃下预变性 1 min; 94 ℃下变性 10 s, 60 ℃下退火
25 s, 40个循环。
结果与讨论
1 丹参 SmSIP1编码的氨基酸序列及同源性分析
经Blast分析丹参cDNA文库EST序列的结果
表明, 一条序列与拟南芥等植物中的胁迫诱导蛋白
SIP基因有较高的同源性, 用ORF Finder在线工具
查找其开放读码框和编码的氨基酸序列(图1), 此序
列全长 296 bp, 命名为 SmSIP1, 其推导的编码蛋白
包含 80个氨基酸, 命名为 SmSIP1。
将丹参SmSIP1蛋白与GenBank中所有的氨基
酸序列进行Blast比对(Altschul等1997)的结果显示,
SmSIP1 蛋白与水稻的 BAA9272 8、拟南芥的
NP_171625和NP_191995在响应臭氧胁迫中的蛋
白的氨基酸序列同源性较高, 分别为78%、79%和
图 1 丹参 SmSIP1基因的核酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig.1 The DNA sequence and deduced amino acid sequence of SmSIP1 in S. miltiorrhiza
方框中为起始密码子和终止密码子, 下划线的序列为内含子。
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68%。与杨树(ABK93193)、云杉(ABK21434)和葡
萄(CAO46571)的一种未知功能蛋白也有较高同源
性, 分别为 81%、63%和 62%。氨基酸序列较高
的同源性表明这些蛋白在植物体内可能有相似的功
能。
2 丹参 SmSIP1蛋白的生物信息学分析
用生物信息学分析SmSIP1所推导的氨基酸序
列的结果表明, 此蛋白分子量为 8.86 kDa, 等电点
为 8.85, pH 7.0时的电荷为 1.878, 碱性氨基酸(K、
R) 8个, 酸性氨基酸(D、E) 6个, 疏水氨基酸(A、I、F、
W、V) 31个, 极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y) 23个。
用 SOPMA (Geourjon和Deléage 1995)预测丹
参 SmSIP1蛋白的二级结构的结果表明, 此种蛋白
含约 50%的 α-螺旋、16.25%的 β-折叠、2.5%
的 β-转角和 31.25%的不规则卷曲。用 ProtScale
(Kyte和Doolittle 1982)预测丹参 SmSIP1蛋白氨基
酸序列的疏水性 /亲水性的结果(图2)表明, 多肽链
第 52位的谷氨酰胺(Gln)具有最低的分值-1.911,
第 13位的丝氨酸(Ser)具有最高的分值 2.167。依
据氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越
强(参考软件 ProtScale)的规律, 在第 52位的Gln亲
水性最强, 第 13位的 Ser疏水性最强, 而从整体来
看, 疏水性氨基酸主要分布在肽链的前 22个氨基
酸, 而后的大部分序列则以亲水性氨基酸为主, 此
蛋白为一个亲水性的蛋白质。这与拟南芥
ATOZI1的蛋白特征完全一致(Sharma和 Davis
1995)。
采用TMHMM软件(Ikeda等2002)分析蛋白跨
膜结构的结果显示, SmSIP1含有 1个疏水区域, 但
不含跨膜结构。
此外, 信号肽是一段引导新合成的肽链进入细
胞器的识别序列。预测和分析信号肽对了解蛋白
质的亚细胞定位和功能, 以及作用途径和机制有一
定的意义(韩立敏和王喆之 2006)。本文以 SignalP
3.0 Server预测丹参 SmSIP1氨基酸序列的信号肽
的结果表明, 该蛋白具有信号肽序列, 推测信号肽
的切割位点位于第19个氨基酸丙氨酸(Ala)和第20
个氨基酸半胱氨酸(Cys)之间, 这说明 SmSIP1的成
熟蛋白质可能是由 61个氨基酸组成。ATOZI1也
具有 18个氨基酸的信号肽序列(Sharma和Davis
1995)。据此推测该类蛋白属于分泌蛋白或是构成
质膜骨架的蛋白。
众所周知, 蛋白质磷酸化(protein phosphorylation)
是一种生物界最普遍, 也是最重要的蛋白质翻译后
修饰(post translational modifications, PTMs)方式, 对
许多生物的细胞功能起开关调控作用, 是一种普遍
的重要调节机制。分析蛋白质磷酸化和鉴定磷酸
化位点是目前蛋白质组学研究的焦点之一。本文
采用 PROSITE分析丹参 SmSIP1蛋白的结果表明,
其可能含有 3类磷酸化位点, 在第 2到第 4、第 39
到第 41、第 47到第 49位氨基酸的位置处分别是
3个蛋白激酶 C磷酸化位点, 在第 39到第 42、第
77到第 80位为 2个酪蛋白激酶 II磷酸化位点, 第
32到第 37个氨基酸为 1个N-豆蔻酰化位点。这
与前人报道的ATOZI1的结果相似(Sharma和Davis
1995)。
用 Clustal W程序(Thompson等 1994)对丹参、
拟南芥、水稻、杨树、葡萄和云杉的 S I P 蛋白
多序列比对的结果(图 3)可以看出, 不同物种的前
20个氨基酸, 即信号肽序列的同源性很低, 但其后
的成熟蛋白质序列的同源性则相对较高。结合磷
酸化位点分析的结果可以看出, 该类蛋白在一些磷
酸化位点上是保守的(图 3中 a、b位点), 而有一些
虽然氨基酸序列中的同源性较低, 但在功能上则是
相同的(图 3中 c位点)。
3 丹参 SmSIP1的基因结构分析
以丹参基因组DNA为模板, 扩增得到SmSIP1
基因的 DNA序列, 并与 EST序列比对结果表明,
SmSIP1在DNA水平上由2个外显子和1个内含子
构成(图 1), 内含子长为 76 bp, 位于 32位Gly的第
1个和第 2个密码子之间, 且两端具有内含子的保
守序列GT/AG。该结构和拟南芥同源基因ATOZI1
图 2 丹参 SmSIP1蛋白的疏水性 /亲水性预测
Fig.2 Predicted hydrophobicity/hydrophilicity of SmSIP1 in
S. miltiorrhiza
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相同(Sharma和 Davis 1995)。
4 丹参 SmSIP1的表达特征分析
用实时荧光定量PCR方法分析SmSIP1在丹参
不同器官中表达的结果(图 4)表明: SmSIP1在丹参
各个器官中均有表达, 但表达量有差异。根中的表
达量高于茎和叶, 叶中表达量极低。这和 Sharma
和Davis (1995)报道的拟南芥 ATOZI1在不同器官
中表达有差异的结果一致, 这暗示了 SmSIP1可能
在植物根的胁迫应答反应中起作用。
干旱处理的表达量有逐步升高趋势, 处理 120 min
的相对表达量为 2.738, 约是未做处理的 2倍。这
图 3 SmSIP1与杨树、水稻等相关蛋白的同源性分析
Fig.3 Sequence alignment of SmSIP1 with Populus, Oryza and other related proteins
“*”、“: ”、“．” 分别表示保守性极高残基位点、保守性较高残基位点和保守性略低残基位点 3 种情况。杨树: ABK931 93;
水稻: BAA92728; 云杉: ABK21434; 拟南芥: NP_191995; 葡萄: CAO46571。a: N-豆蔻酰化位点; b: 蛋白激酶 C磷酸化位点和酪蛋
白激酶 II 磷酸化位点; c: 酪蛋白激酶 II 磷酸化位点。
图 4 SmSIP1在丹参不同器官中的表达
Fig.4 Expression of SmSIP1 in different organs of S.
miltiorrhiza
从用100 µmol·L-1的ABA和干旱处理后丹参中
SmSIP1的表达模式(图 5、6)可以看出, SmSIP1在
以ABA处理 0 h时的相对表达量为 0.838, 6 h时的
表达量最高, 达 1.282, 为未做处理的 1.5倍, 而经
图 5 ABA处理后不同时间 SmSIP1的表达
Fig.5 Expression of SmSIP1 after ABA treatment
图 6 干旱胁迫后不同时间 SmSIP1的表达
Fig.6 Expression of SmSIP1 after drying treatment
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些结果表明SmSIP1的表达受ABA和干旱胁迫的诱
导。
总之, 植物对逆境胁迫的响应是一个非常复杂
的过程, 其中涉及到植物对逆境的感知、信号的传
递、基因表达的调节和生理、形态的改变
(Mazzucotelli等 2008)。本文从抗逆性较高的植物
丹参的 EST库中筛选得到了一个胁迫诱导蛋白基
因, 它与水稻和拟南芥中胁迫诱导蛋白基因同源性
较高。SmSIP1的蛋白序列分析和基因表达研究表
明 SmSIP1可能参与植物的根部对逆境的应答反
应。迄今, 这类新的胁迫诱导蛋白的研究还较少,
仅在拟南芥中有过报道, 此种蛋白在植物中的确切
功能和机制还有待进一步研究。
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