全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月 729
葡萄体细胞胚的保存
王雅梅 1, 刘媛 1, 马绍英 1,2, 张真 1,2, 李胜 1,2,*
1甘肃农业大学生命科学技术学院, 兰州 730070; 2兰州汇通生物科技有限公司, 兰州 730000
提要: 研究干化对酿酒葡萄品种 ‘神索’体细胞胚保存效应的结果表明, 葡萄体细胞胚失水量在40%~50%之间的萌发率较
高, 达58%左右, 比未经干化的萌发率高9.4%; 在较高相对湿度的情况下, 体细胞胚失水速度变慢, 干化处理时间延长, 可以
提高体细胞胚的存活率和萌发率; 相对湿度70%的情况下干化15 d的效果最好, 其萌发率从未经干化处理的33.5%提高
到56.2%。
关键词: 葡萄; 体细胞胚; 干化; 保存
Preservation of Somatic Embryo from Grape (Vitis vinifera L.)
WANG Ya-Mei1, LIU Yuan1, MA Shao-Ying1,2, ZHANG Zhen1,2, LI Sheng1,2,*
1College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2Lanzhou Huitong Biological
Science & Technology Ltd., Lanzhou 730000, China
Abstract: The effect of desiccation on embryoid preversation of grape (Vitis vinifera) cv ‘Sinsaut’ was studied.
The results showed that when the water loss of somatic embryos reached 40%–50%, the germination rate was
about 58%, and higher than that of undesiccated 9.4%. Under higher relative humidity, water loss of somatic
embryos slowed, as the duration of desiccation prolonged, the embryo survival and germination rates increased.
And the effect of 70% relative humidity and the desiccation duration for 15 d were best, its germination rate
raised from 33.5% (control) to 56.2%.
Key words: Vitis vinifera; somatic embryo; desiccation; preservation
收稿 2008-03-13 修定 2008-06-06
* 通讯作者(E-mail: lish@gsau.edu.cn; Tel: 0931-7631547)。
人工种子技术在快速繁殖优良品种与株系、
固定杂种优势、简化育种程序, 特别是与基因工程
和脱病毒生物技术相结合时的应用潜力很大。干
化处理是超低温种质保存和人工种子技术应用中的
关键问题。据报道, 干化处理对延长种质保存、
人工种子贮藏时间、提高体细胞胚萌发率、植株
再生率以及幼苗活力都有明显的效果(伊华林和邓
秀新 1999; 吴立东等 1993)。有关人工种子或体胚
干化研究的植物主要有胡萝卜(Daucus carota var.
sativa)、紫苜蓿(Medicago sativa)、芹菜(Apium
graveolens var. dulce)、葡萄(Vitis vinifera)、鸭
茅(Dactylis glomerata)、大豆(Glycine max)、黄
连(Pistacia chinensis)等(柯善强等 1989; 侯嵩白等
1991; 李修庆 1990; 孙敏和陈安和 1995)。有试验
表明, 葡萄体胚经过 7 d和 21 d干化处理后, 植株
再生率分别为28%和20% (崔凯荣和戴若兰2000);
1989年, Gray在进一步研究葡萄体胚干化处理对体
胚 “休眠 ”、静止和萌发的影响中, 观察到干化处
理能增强葡萄体胚幼苗活力。本文研究干化处理
对酿酒葡萄体细胞胚提高体胚存活率的影响, 以期
为葡萄体细胞胚的长期种质保存提供理论参考。
材料与方法
试验材料是甘肃农业大学组织培养室保存 2
年的葡萄(Vitis vinifera L.)品种 ‘神索(Sinsaut)’体
细胞胚。胚状体保持培养基为NN69+0.5 mg·L-1 6-
BA+0.03 mg·L-1 NAA (NN2培养基), 分化培养基
GS+0.2 mg·L-1 IAA+0.015 g·L-1青霉素(GS1培养
基)。2种培养基均附加 3.0%蔗糖和 4.0 g·L-1 琼
脂。pH调为 5.8, 在 50 mL三角瓶中装入 20 mL培
养基, 于 121 ℃下高压灭菌 20 min。
测定体细胞胚失水量和萌发率, 操作程序为:
(1)包扎三角瓶并灭菌; (2)灭好菌的三角瓶放入 80
℃烘箱中烘 24 h后, 自然冷却至室温; (3)用电子天
平准确称取三角瓶的重量(W0); (4)于超净工作台上
将胚状体迅速从固体分化培养基中取出, 置入无菌
干燥的三角瓶中, 测定三角瓶+体胚的重量(W1); (5)
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在超净工作台上取掉棉塞后, 快速干化(0~10 h); (6)
测定经灭菌烘干过的三角瓶重量(W2); (7)每隔 1 h,
将干化的胚状体转入称过重量的三角瓶(6)中迅速
称三角瓶+干化过的体细胞胚的重量(W3); (8)将干
化的体细胞胚转入GS1培养基中。30 d后统计萌
发率, 并观察体细胞胚失水量对其萌发率的影响。
每 1 h为一个处理, 共 11个处理, 每处理 3次重复,
每重复 10 瓶。
根据Kim和 Janick (1989)以及 Tang (2001)文
中的方法, 以饱和的盐溶液控制稳定的相对湿度
(relative humidity, RH), 即 RH 30%用 CaCl2·6H2O;
RH 40%用 K2CO3·1.5H2O; RH 50%用Ca(NO3)2·4H2O;
RH 61%用NH4NO3; RH 70%用NaCl+KCl; RH 80%
用Na2CO3; RH 87%用K2SO4; RH 90%用 BaCl2。
配制时将盐溶解在煮沸的蒸馏水中, 转入带塞玻璃
瓶后, 放入冰箱中保存待用。实验时挑选体细胞
胚, 在室温 20 ℃下于 RH为 30%、40%、50%、
61 %、7 0%、8 0%、9 0% 中干化 6、12、24、
48、96和 192 h后, 转入 GS1培养基上, 30 d后
统计萌发率, 每处理 10瓶。
在研究体细胞胚干化时间对胚状体萌发的影
响时, 相对湿度设为 70%, 挑选体细胞胚, 干化 0~
40 d, 每 5 d为一个处理, 每处理 10瓶, 然后接种在
GS1培养基上, 30 d后统计萌发率。
数据按以下公式计算, 即: 胚状体鲜重(g)= W1-
W0; 胚状体干重(g)= W3-W2; 失水量=(鲜重-干重)/
鲜重×100%; 采用Microsoft Excel进行数据分析和
作图。
结果与讨论
1 体细胞胚失水量对萌发率的影响
从图1可见, 葡萄体细胞胚失水量和萌发率都
随干化时间的变化而变化, 干化 0、1、2、3、
4、5、6、7、8、9、1 0 h 的体细胞胚失水量
分别为 0、10.3%、26.9%、41.7%、52.5%、59.1%、
67.4%、76.3%、78.5%、79.2%和 79.9%, 在干
化的前4 h, 胚状体失水量差异很大; 4 h以后, 失水
速度开始减慢, 9和 10 h之间的失水量没有多大变
化。失水量从 0~50%之间的体细胞胚萌发率随着
失水量的升高而增大, 其中失水量在 40%~50%之
间的萌发率较高, 也就是说以干化3~4 h效果较好,
但失水量高于50%以后, 体细胞胚萌发率而急剧下
降, 高于 76%以后的体细胞胚就不萌发。在试验
中还观察到适度的干化可以减少畸形苗的生成。
表明葡萄体胚的失水量在一定范围内能提高其萌发
率, 失水量过高后萌发率会降低, 这与Gray (1987)
报道的葡萄体胚干化处理后, 含水量保持在12%, 即
接近天然种子在相同条件下贮藏时的含水量, 体胚
含水量下降且低于这个限度时, 体胚活力急剧下降
的结果基本上一致, 表明葡萄体细胞胚的失水量以
及干化的相对湿度和时间均与其萌发率有密切关
系 。
2 体细胞胚干化过程中的相对湿度对胚状体萌发
的影响
从图 2可以看出: 在一定温度下, 相对湿度高,
体细胞胚失水速度慢, 存活率高, 萌发率也高, 反之
亦然。在RH为 30%时, 干化处理6 h的萌发率最好,
为 30.1%, 与其余干化处理的结果差异达极显著水
平, 在此条件下干化时间大于48 h时胚状体无存活
的; 相对湿度在 61%~90%, 在干化 6~192 h之间,
随着干化时间的增加, 萌发率都呈缓慢上升趋势; 总
体来说, 在 RH为 50%, 干化时间为 48 h的条件下,
胚状体的存活率最高。相对湿度是通过影响体细
胞胚失水速度而起作用的, 在一定温度和较高相对
湿度下干化处理的体细胞胚失水速度变慢, 延长干
化处理时间可提高体细胞胚的存活率和萌发率, 这
与吴立东等(1993)和Janick和Kitto (1989)的结果是
保持一致的, 但干化处理失水速度过快, 对体细胞
胚的组织结构或其内部的物质状态、体细胞胚的
存活和萌发影响如何值得探究。
3 体细胞胚干化时间对胚状体萌发的影响
如图3所示, 体细胞胚不经干化处理的萌发率
图 1 失水量对体细胞胚萌发率的影响
Fig.1 Effect of loss water on germination of somatic embryos
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图 2 不同相对湿度对体细胞胚萌发率的影响
Fig.2 Effects of different relative humidity on germination of somatic embryos
图中小写字母表示差异显著(P<0.05); 大写字母表示差异达极显著(P<0.01)。
为 33.5%; 随着干化时间的增加, 萌发率也逐渐增
加, 干化 15 d 的萌发率最高, 为 56.2%。此后, 随
着干化时间的进程, 萌发率有下降趋势, 干化时间
长于 25 d的萌发率开始急剧下降, 直至干化 40 d时
萌发率为0, 说明在一定的相对湿度和室温(20 ℃)条
件下, 干化一定时间可明显提高胚状体的萌发率。
参考文献
崔凯荣, 戴若兰(2000). 植物体细胞发生的分子生物学. 北京: 科
学出版社, 50~171
图 3 干化时间对体细胞胚萌发率的影响
Fig.3 Effects of desiccation time on
germination of somatic embryos
侯嵩白, 柯善强, 吴玉兰, 李洪林, 桂耀林, 郭仲琛(1991). 黄连体
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柯善强, 桂耀林, 郭仲琛(1989). 植物人工种子的研究. 植物学通
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吴立东, 柯善强, 桂耀林(1993). 植物体细胞胚干化处理研究述
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