全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 6期，2007年 12月1020
野生种马铃薯 SpPHYB基因的克隆与表达分析
张易，杨清 *，王全逸，郭建林，梁峰
南京农业大学生命科学学院，南京 210095
提要：采用 RT-PCR技术从野生种马铃薯中克隆到一个光敏色素基因 PHYB，其 cDNA全长为 3 470 bp。含有一个 3 393
bp的完整开放阅读框，编码一条长 1 130个氨基酸的蛋白，分子量为 125 kDa，等电点为 5.6。该基因编码的蛋白序列与
栽培种马铃薯、番茄和烟草同源基因编码的氨基酸序列一致性分别为98%、95%、92%，命名为SpPHYB。半定量PCR分
析表明，根、茎、叶和芽中 SpPHYB表达水平较高且相似，但在花和块茎成熟器官中表达量稍低。
关键词：野生种马铃薯；SpPHYB；克隆；表达
Cloning and Expression Analysis of SpPHYB Gene from Solanum pinnatisectum
Dunal
ZHANG Yi, YANG Qing*, WANG Quan-Yi, GUO Jian-Lin, LIANG Feng
College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: The full-length cDNA of SpPHYB gene was cloned from wild potato (Solanum pinnatisectum) by
RT-PCR. The cDNA was 3 470 bp long with an open reading frame (ORF) of 3 393 bp and encoded 1 130 amino
acid residues with a predicted molecular weight of 125 kDa and an isoelectric point of 5.6. The protein se-
quence comparison showed that the predicted protein had higher identities to those from Solanum tuberosum,
Lycopersicon esculentum and Nicotiana tabacum (98%, 95% and 92%). Semi-quantitive RT-PCR indicated that
the expression level of SpPHYB was higher and similar in roots, stem, leaves and sprouts, and lower in flowers
and tubers.
Key words: Solanum pinnatisectum; SpPHYB; cloning; expression
收稿 2007-07-09 修定 　2007-09-25
资助 国家转基因植物研究与产业化开发专项(J Y0 3-A-11 )。
* 通讯作者(E-mail：qyang19@njau.edu.cn；Tel：025-
8 4 3 9 5 2 2 1 )。
光敏色素是植物体内感受光信号的一类大小
约 124 kDa的光受体蛋白，包含光敏色素A、B、
C、D和 E 5个成员(Nagatani等 1991；Somers等
1991；Lopez-Juez等 1992)，其在植物种子萌发、
幼苗生长、茎的伸长、子叶伸展、开花控制和
花色苷合成等生长发育过程中均起作用(Furuya
1993；周波和李玉花 2006)。光敏色素 B (PHYB)
参与植物开花调节和对光周期的识别，虽然迄今
为止与其相关的机制还不很清楚(Thiele等 1999；
Scohfield和 Paliyath 2005)，但近年来有报道认
为，PHYB的表达受抑制后，无论在短日照还是
长日照条件下马铃薯均能结薯，而作为短日照植
物的马铃薯，在通常情况下，只有短日照诱导下
才能结薯，这表明长日照条件下 PHYB对薯块形
成起抑制作用(Aksenova等 2002；Boccalandro等
2003)。但其抑制机制仍不清楚(Jackson 1999)。
马铃薯是无性繁殖植物，块茎是其繁殖器
官，也是产品器官。采用基因工程技术抑制
PHYB基因在植株体内的表达可能有调节马铃薯对
光周期敏感性的作用，因而对培育栽培适应性广
的品种似乎有一定的潜在理论和应用意义。马铃
薯Solanum pinnatisectum是一个花色苷合成光敏感
的野生马铃薯，用其研究马铃薯中光信号转导可
能是一个适宜的植物材料。我们以前曾从此种马
铃薯中克隆了 PHYA基因(张易等 2006)，本文报
道克隆 PHYB基因的结果。
材料与方法
野生种马铃薯(Solanum pinnatisectum Dunal)
由美国国家马铃薯种质资源库提供。植株分别盆
植在塑料大棚(自然光照)和具有温光控制的人工生
长室(8 h·d-1光照或黑暗，开花前 1个月进行光、
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暗处理 30 d)内，常规管理。于生长旺盛期(现蕾
前)从大棚栽培的植株上取幼嫩叶片提取RNA，用
于 SpPHYB基因 cDNA全长的克隆；开花期取根、
茎、叶、花、芽和块茎提取 RNA，用于组织表
达实验；用于光、暗诱导表达分析提取 RNA的
根、茎、叶、花、芽和块茎取自人工生长室培
养的植株。试验中使用的 LA Taq DNA聚合酶、
pMD18-T载体、大肠杆菌DH5α和凝胶回收试剂
盒购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)。
叶片总RNA的提取按照Trizol试剂盒提供的
方法进行，根据从GenBank搜索到的四倍体栽培
型马铃薯、番茄、茄子的 PHYB基因的序列，设
计SpPHYB扩增引物：P1 (5 TGTGTGGAGGAGA-
GAGAAATG 3和P2 (5 GTAAGCTCCTAGCCAA-
CACTC 3。参照 Promega公司AMV First Strand
cDNA Synthesis Kit制备 cDNA。PCR扩增体系 25
µL：1 µL cDNA 模板、0.5 µL引物 P1和 P2 (10
pmol·L-1)、2.5 µL PCR 缓冲液(10×)、4 µL dNTPs
(2.5 mmol·L-1)、2.5 µL MgCl2 (25 mmol·L-1)、0.3
µL LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)及13.7 µL无
菌双蒸水。PCR扩增条件为：94 ℃预变性 3 min；
94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，循环 30
次；72 ℃延伸 10 min。扩增产物在 1%琼脂糖凝
胶上电泳分离。用TaKaRa公司试剂盒回收扩增产
物。将扩增产物连接到 pM D1 8T- Vec tor 载体
(TaKaRa公司)上。通过热激转化方法将克隆载体
转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并在含氨苄
青霉素和X-gal的平板上筛选白色菌落，然后提取
质粒，鉴定，从中挑选单克隆送上海博亚生物工
程公司测序。
作 SpPHYB组织表达和光、暗诱导表达分析
时，按照 Trizol试剂盒提供的方法，从根、茎、
叶、花、芽、块茎中分别提取总 RNA，根据克
隆的 PHYB 开放阅读框(O RF )序列设计 P3 (5
ATTTGCTGTTGATGTTGAAGG 3)，与 P2组成
引物对，用半定量 RT-PCR 进行 PHYB基因表达
分析。PCR扩增条件同前，循环数为 26。采用
GAPDH基因为内参，引物分别为 GAPDH1 (5
CAAGGACTGGAGAGGTGG 3)和GAPDH2 (5
TTCACTCGTTGTCGTACC 3)，循环数为 26。取
5 µL PCR 产物点样，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩
增产物，并拍照。
实验结果
1 SpPHYB基因的 cDNA克隆及其编码蛋白的结
构
通过 RT-PCR， 一次扩增获得长度在 3.4 kb
左右的 PHYB cDNA片段，与预期的大小一致。
该片段回收后，连接到 T-载体上，送上海博亚生
物工程公司测序。cDNA序列的确切长度为 3 470
bp，结构分析表明，该序列 5端的第 29位存在
起始密码子ATG，3端的第3 419位存在终止密码
子 TAG，ORF的长度为 3 393 bp，编码一个 1 130
氨基酸多肽，分子量为 125 kDa，等电点为 5.6。
图 1显示的为其 ORF序列与结构。
在NCBI上的氨基酸序列比对结果显示，野
生种马铃薯克隆序列与栽培种马铃薯、番茄及烟
草 PHYB一致性分别达到 98%、95%、92%，表
明该序列为光敏色素 PHYB，并且在茄科植物内
是高度保守的(图 2)，此种编码 PHYB的克隆序列
命名为 SpPHYB。
2 SpPHYB的系统进化
采用 CLUSTAL程序，对 SpPHYB和相似性
较高的其他代表性物种的PHYB编码蛋白序列进行
了系统发育分析，图 3的结果显示，SpPHYB与
同科植物栽培种马铃薯和番茄在进化树上属于同一
分支，表明在进化上茄科 SpPHYB是同步的。
3 SpPHYB的组织表达
采用半定量 RT-PCR 的方法分析的结果显
示，根、茎、叶和芽中 SpPHYB 表达水平较高
且相似，但在花和块茎成熟器官中表达量稍低(图
4)。
4 SpPHYB的光和暗诱导表达
采用半定量RT-PCR的方法分析了SpPHYB在
光、暗条件下野生马铃薯植株不同组织的表达(图
5)。结果显示，无论在光照还是黑暗条件下，各
组织 SpPHYB都能表达，处理间稍有差异，但不
很明显。
讨 论
本文从野生种马铃薯中克隆到 SpPHYB 基
因，其编码的氨基酸序列与栽培种马铃薯有很高
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的一致性(98%)，显示 PHYB蛋白是保守性的。
在正常光照生长条件下，S p P H Y B 在根、
茎、叶、芽、块茎和花中都能表达，尽管在块
茎和花的表达量稍低于其他器官，这表明
SpPHYB不具有组织表达特异性，这与 Heyer和
Gatz (1992)在栽培种马铃薯中观察到的结果是相
图 1 SpPHYB的 cDNA序列
Fig.1 cDNA sequence of SpPHYB
下划线处分别为起始密码子和终止密码子。
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图 2 SpPHYB与其他植物同源蛋白氨基酸序列比对
Fig.2 Comparison on amino acid sequences between SpPHYB and its homologous proteins from other plants
S p：野生马铃薯；S t：栽培型马铃薯；N p：烟草；L e：番茄。
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似的。
本文的结果表明，经 8 h短光照和黑暗处理
的马铃薯植株，其 SpPHYB 在块茎中的表达较
低，且处理间的差异不很明显，这表明尽管光照
对 SpPHYB的表达量有影响，但 SpPHYB的表达
与否并不依赖于光照条件。
图 4 SpPHYB在不同组织的表达
Fig.4 Expression of SpPHYB in different tissues
图 5 光和暗诱导下野生型马铃薯 SpPHYB的组织表达
Fig.5 Expression of SpPHYB in different tissues of
S. pinnatisectum under light and dark conditions
1 ~ 5 为光照处理的根、茎、叶、块茎、芽；1 ’ ~ 5 ’ 为黑暗
处理的根、茎、叶、块茎、芽。
参考文献
张易, 郭建林, 卢其能, 杨清(20 06 ) . 野生种马铃薯(S ola nu m
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图 3 SpPHYB的系统发生分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of SpPHYB