全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月 1081
野生种马铃薯PHYA 基因cDNA 的克隆与表达分析
张易 郭建林 卢其能 杨清*
南京农业大学生命科学学院，南京 210095
提要 采用 RT-PCR 技术从野生种马铃薯(Solanum pinnatisectum Dun.)中克隆到 1 个光敏色素基因 PHYA，其 cDNA 全长为
3 466 bp，含有一个 3 372 bp 的完整开放阅读框，编码一条长 1 123 个氨基酸的蛋白，分子量为 125 kDa，等电点为 5.8。
该基因编码的蛋白序列与栽培种马铃薯、番茄和烟草基因编码的氨基酸序列同源性分别为96%、94%和91%。半定量RT-
PCR 分析表明，PHYA在根、茎和芽中的表达量较高；光对PHYA表达的作用在地上部器官中表现为抑制，而在地下部器
官中则促进。
关键词 野生种马铃薯；光敏色素；PHYA；克隆；表达
Cloning and Expression Analysis of PHYA cDNA from Wild Potato (Solanum
pinnatisectum Dun.)
ZHANG Yi, GUO Jian-Lin, LU Qi-Neng, YANG Qing*
College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract The full-length cDNA of PHYA gene was cloned from wild potato (Solanum pinnatisectum Dun.) by
RT-PCR. The cDNA was 3 466 bp long and had a open reading frame (ORF) of 3 372 bp, and the ORF encoded
1 123 amino acid residues with a predicted molecular weight of 125 kDa and an isoelectric point of 5.8. The
protein sequence comparison showed that the predicted protein had higher identities to those from Solanum
tuberosum, Lycopersicon esculentum and Nicotiana tabacum (96%, 94% and 91%). Semi-quantitive RT-PCR
indicated that the expression of PHYA was different in each organ and higher in roots, stem and shoots. The
influence of light on the expression of PHYA depended on the space position of organs and was promotive in the
underground organ and was restrained in the aboveground organs.
Key words wild potato (Solanum pinnatisectum Dun.); phytochrome; PHYA; cloning; expression
收稿 2006-07-24 修定 　2006-11-13
资助 国家转基因植物研究与产业化开发专项(JY03-A-11)。
*通讯作者(E-mail: qyang19@njau.edu.cn, Tel: 025-
84395221)。
光敏色素是植物体内感受光信号的一类光受
体蛋白，与光形态建成密切相关(Furuya 1993；
周波和李玉花2006)。自 1983年分离到完整的光
敏色素蛋白质以来(Vierstra和Quail 1983)，人们
相继对光敏色素的分子种类、生理机制、生物合
成与调控展开了广泛深入的研究(彭业芳 1995)。
在拟南芥中，已发现有光敏色素 PHY 蛋白家族的
存在，它们由基因 PHYA、PHYB、PHYC、PHYD
和 PHYE 编码(Somers 等 1991; 顾雪松等1997)。
其中， PHYA 在植物整个生命过程中起作用。在
许多双子叶植物的黄化苗中，持续的远红光(far-
red-light, FR)会抑制植物生长，并导致花青苷合成
积累倍增(Parks和Quail 1991)。将燕麦的PHYA接
上组成型的 CaMV35S 启动子，转入番茄和烟草
中，在白光下转基因植物均显示出为持续性的FR
所诱导的生长受抑现象，即 PHYA 表达导致植物
严重矮化(Boylan和Quail 1989)。此外，PHYA过
表达还可抑制寄主植物下胚轴及其细胞伸长，顶
端优势减少，叶呈暗绿色，叶绿素含量增加，延
缓叶片衰老和诱导 cab 基因表达等(Yanovsky 等
1998；Kong 等 2004)。目前，由 PHYA 的表达
所产生的上述现象其机制还不十分清楚。
野生种马铃薯(Solanum pinnatisectum Dun.)是
光敏型的材料，在光照条件下，茎块由白色变成
红色，PHYA 可能在花青苷的积累中起促进作用
(Parks和Quail 1991)。本研究以S. pinnatisectum
为材料，根据栽培种马铃薯、番茄和烟草的
cDNA 全长序列比对结果设计引物，通过半定量
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RT-PCR 克隆 PHYA 全长序列，并对其进行结构
和表达分析，为进一步研究PHYA 在花青苷合成中
的作用和野生种马铃薯光反应分子机制建立基础。
材料与方法
野生种马铃薯(Solanum pinnatisectum Dun.) 由
美国国家马铃薯种质资源库提供。LA Taq DNA
聚合酶、pMD 1 8 - T 载体、大肠杆菌 DH5a 和凝
胶回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。
从GenBank上分别搜索4倍体栽培型马铃薯(S.
tuberosum Linn.)、番茄(Lycopersicon esculentum
Mill.)、烟草(Nicotiana tobacum Linn.)的PHYA基
因序列，利用DNAssist 进行比对，应用 Primer
5.0设计全长基因扩增引物: P1 (5 AGCTTCTGAAA-
GATTTGAGTC 3)和 P2 (5 TAAGAGGGTCCTG-
AAATCATC 3)。
采用Trizol试剂(北京天为时代有限公司)从叶
片中提取总RNA。 参照 Promega 公司 AMV First
Strand cDNA Synthesis Kit制备cDNA。在此基础
上进行 PCR 扩增，反应体系(50 mL)中含：2 mL
cDNA模板、各1 mL引物 P1和 P2 (10 pmol·L-1)、
5 mL PCR缓冲液(10×)、8 mL dNTPs (2.5 mmol·L-1)、
5 mL MgCl2 (25 mmol·L-1)、0.5 mL LA Taq DNA聚
合酶及 27.5 mL 无菌双蒸水。PCR 扩增条件为：
94℃预变性3 min；94℃ 30 s，49℃ 30 s，72℃
4 min，循环 30 次；72℃延伸 10 min 扩增产物
以1% 琼脂糖凝胶进行电泳分离，用 TaKaRa 公司
试剂盒回收扩增产物。将扩增产物连接到
pMD18-T 载体上。通过热激转化将克隆载体转入
大肠杆菌 DH 5a 感受态细胞中，然后提取质粒，
鉴定，挑选单克隆送上海博亚生物工程公司进行
序列测定。
P H Y A 组织表达分析时，取马铃薯的根、
茎、叶、花、芽和块茎，提取总 R N A ，供组
织表达分析。分别取在25℃的黑暗和光照(8 h)中
培养 30 d 的马铃薯的新鲜根、茎、叶、芽、块
茎，提取总 R N A，供作光、暗诱导 P H Y A 的表
达分析。根据克隆的 PHYA 全长序列设计 P3 (5
TTCTGGTACAGGTCACACACT 3)，与 P2 组成
引物对，用半定量 RT-PCR 进行 PHYA 基因表达
分析。PCR扩增条件同1.2，循环数为26。 内参
采用组成型表达的 G A P D H 基因，引物分别为
GAPDH1 (5 CAAGGACTGGAGAGGTGG 3)和
GAPDH2 (5 TTCACTCGTTGTCGTACC 3)，循
环数为 26。取 5 mL PCR 产物点样，经 1% 的琼
脂糖凝胶电泳检测扩增产物，拍照。
结果与讨论
1 PHYA 基因的 cDNA 克隆及其编码蛋白的结构
通过 RT-PCR，1 次扩增获得到 PHYA cDNA
全长片段。由扩增结果可以看出，目的片段在3.4
k b 左右，与预期大小一致。将该片段回收，连
接到 pMD18-T 载体上，测序，cDNA 的确切长度
为3 466 bp。
对获得的 cDNA 序列进行结构分析发现，该
序列5端的第52位存在起始的密码子ATG，3端
的第 3 421 位存在终止密码子 TGA，含有一个开
放阅读框(open reading frame, ORF)，其长度为
3 369 bp (图1)，编码一个含1 123 个氨基酸的多
肽，分子量为125 kDa，等电点为5.8。 对推导
的氨基酸序列分析发现，在第 323 个氨基酸处存
在光敏色素的生色团连接位点Cys323，其两边的
序列(Leu317和Met328)在所有光敏色素中高度保
守，但在第 322 位上存在氨基酸的变异，野生种
马铃薯与其它茄科相似，在此位置上为酪氨酸(图
2)，而其他物种如水稻、小麦和拟南芥等中为丝
氨酸(Heyer等 1995)。
在 NCBI 上的氨基酸序列比对结果显示，野
生种马铃薯 PHYA 与栽培种马铃薯、番茄及烟草
PHYA 一致性分别达到 96%、94% 和 91%，说明
光敏色素在茄科植物内是高度保守的(图 2)。
2 PHYA 基因的系统发育
选择与野生种马铃薯相似性较高的其它物种
PHYA 编码蛋白序列，包括栽培种马铃薯、番茄
以及一些具有代表性的物种如拟南芥、烟草、大
豆、豌豆、水稻等，用 D N A M A N 程序对它们进
行系统发育分析的结果(图3)显示，野生种马铃薯
的PHYA 与栽培种马铃薯的 PHYA 同源性较高，其
次是茄科中的番茄，三者共处一簇。
3 PHYA 基因的组织表达
分别取温室盆栽野生种马铃薯植株的根、
茎、叶、芽、花、块茎，提取总 R N A，以 P 2、
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图1 PHYA的 ORF序列及推导的氨基酸序列
Fig.1 ORF sequence and its amino acid sequence of PHYA
下划线处为分别为起始密码子和终止密码子，加框处为光敏色素生色团连接区域。
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图2 野生种马铃薯PHYA编码的氨基酸序列与番茄及烟草序列比较
Fig.2 Comparison on the amino acid sequence of S. pinnatisectum PHYA with tomato and tobacco
S p ：野生种马铃薯；S t ：栽培种马铃薯；L e ：番茄；N t ：烟草。
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图3 PHYA基因的系统发育分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of PHYA
P3 做为引物，分析 PHYA 在各组织中表达模式的
结果(图 4)显示，在根、茎和芽的 PHYA 表达量
最高，叶中次之，块茎和花中的表达量很低。这
与Heyer和Gatz (1992)在栽培种马铃薯中获得的结
果类似。
4 光、暗诱导的 PHYA 基因表达
将植株分别置于光照和黑暗条件下生长，1
个月后取其植株的根、茎、叶、芽和块茎，提
取总 RNA。以 P2、P3 作为引物，分析 PHYA 在
不同组织表达差异的结果(图5)显示，在黑暗条件
下，茎和芽中 P H Y A 的表达量显著高于光照下
的；在叶中，光、暗对 P H Y A 的表达没有明显
的影响；而在块茎中其表达量极低，几乎检测不
到；在根中则相反，光照条件下 PHYA 的表达量
高于黑暗。以往的研究表明，PHYA 的过表达会
图4 野生种马铃薯PHYA组织表达图谱
Fig.4 Expression analysis of PHYA in the root, stem, leaf,
tuber, flower and sprout of S. pinnatisectum
抑制植株的生长，而光照会降低茎叶中 PHYA 的
表达(Heyer 等 1995)，我们的结果也证实了这一
点。至于黑暗对根中 PHYA 的下调表达，推测可
能是自然进化的结果，根是地下器官，黑暗中
PHYA 的低水平表达有利于根的生长。
参考文献
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图 5 光、暗诱导下野生种马铃薯PHYA组织表达图谱
Fig.5 Expression analysis of PHYA in different organs
of S. pinnatisectum under light and dark
1 ~ 5 ：光照下的根、茎、叶、块茎和芽；1 ’ ~ 5 ’ ：黑
暗中的根、茎、叶、块茎和芽。