全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第2期，2006年4月 293
优化萝卜基因组DNA RAPD-PCR 反应体系的正交设计法
张建军 司龙亭* 姜晶
沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110161
Orthogonal Design Method for Optimal RAPD Reaction System in Radish
Genomic DNA
ZHANG Jian-Jun, SI Long-Ting*, JIANG Jing
College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China
提要 以 CTAB 微量提取方法提取 10 个红萝卜雄性不育系 A 单株的基因组 DNA，等浓度混合成基因池。以其为模板，用
正交设计方法论定 RAPD-PCR 反应体系的各影响因子，用随机引物 S42 (5 GGACCCAACC 3)优化萝卜雄性不育系 A 基
因组 DNA RAPD-PCR 反应体系，16 次试验即可获得最佳的 RAPD-PCR 反应体系。
关键词 红萝卜；随机扩增多态性 DNA (RAPD); 正交设计；反应体系
收稿 2005-09-27 修定 　2006-02-14
*通讯作者(E-mail: zjj20062004@163.com, Tel: 024-
88493070)。
自上个世纪70年代起，我国选育了大量的萝
卜雄性不育系，并对其进行了遗传学研究，但分
子水平上的研究甚少(赵双宜等 1994；董庆华等
1996；张丽等 2002)，与国外 Ogu CMS 相关的不
育基因和恢复基因的研究存在很大差距(Yamagishi
和 Terachi 1997, 2001；Murayama等 1999)。
随机扩增多态性DNA (random amplified poly-
morphic DNA，RAPD)是 1990年 Williams、Welsh
和 McClelland 同时创建的一种 DNA 分子标记技
术。这种技术因检测效率高、样品用量少、灵
敏度高等优点而得到迅速推广。RAPD 主要用于
动植物种属鉴定、基因定位以及导入外源基因的
追踪等(惠东威和陈受宜1992；Clark 1998)。但
是 RAPD 技术并不十分完美，特别是易受外界因
素的影响，试验的重复性和稳定性较差。因此，
必须建立一个解决这些问题的稳定而最佳的反应体
系。一般来说，传统的 P C R 体系优化方法，不
仅试验次数多、工作量大以及浪费试剂，而且忽
略了 PCR 体系反应中的各个因子存在动态的交互
作用，最终不一定能获得较佳效果的反应体系。
正交设计是用正交表来安排试验，用统计学原理
来研究各因子试验的一种设计方法。它所安排的
试验具有整齐可比和均衡分散的特点，可以全面
了解试验的情况和各因子之间相互影响的规律(俞
渭江 1999)。
本文以萝卜基因组 D N A 为模板进行优化
RAP D - P C R 反应体系，将正交试验用于 RAP D -
PCR 条件优化试验中，以求最终获得优良反应体
系，为今后从分子水平上研究萝卜雄性不育的遗
传机制建立基础。
材料与方法
1 材料
红萝卜(Raphanu sativus L.)雄性不育系A由本
校园艺学院蔬菜育种组提供。于2005年7月20日
温室育苗，长到 4~5 片叶时采幼叶，用冰壶带回
实验室，置于 -75℃冰箱中保存，留待提取DNA。
2 方法
2.1 模板DNA的提取 DNA的提取采用微量CTAB
的提取方法(王灏等2001)。
2.2 DNA纯度的检测及基因池的构建 用紫外分光
光度计(美国瓦里安公司 Cray100)测定，以经过纯
水仪(Millipore Q-R)过滤的双重水为对照。测定波
长260 和 280 nm 的吸光度(OD 值)。经过计算将
10个样品等量混合，DNA的终浓度为300 ng·mL-1。
2.3 正交试验设计方案 以引物(上海生工生物工程
有限公司Sango)、dNTPs (上海生工生物工程有限
公司Sango)、Mg2+ (大连宝生物工程有限公司)、
Taq 酶(大连宝生物工程有限公司)酶量、DNA 模
板浓度为5个因子，每个因子设4个浓度水平(表
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1)。根据正交设计试验表L16 (45)安排试验方案(表2)。
2.4 RAPD-PCR 试验的优化 根据表2的试验方
案，各个试验的每管PCR 反应体系为15 mL。按
正交表加入各成分，然后用灭过菌的双重水补至
终体积为15 mL；再以 PCR 仪(PE2400)扩增。热
循环参数经改良为：第一循环为94℃变性5 min，
36℃退火 1 min，72℃延伸 2 min；然后进行39
个循环，每个循环 94℃变性 1 min，36℃退火 1
min，72℃延伸 2 min；最后 72℃延伸 6 min (汪
志伟等2004)。扩增产物在1.3% 琼脂糖凝胶中电
泳，电压为5~6 V·m-1。电泳缓冲液为0.5×TBE，
利用电泳仪电泳1 h后在凝胶成像系统(美国 UVP
公司 Gel Doc2000)上检测结果并摄影。
实验结果
从图1 可以看出，在不同反应体系中出现的
扩增带数目是不同的，有的甚至没有出现扩增
带，2、6、7、8、9、1 0、1 1、1 3、1 4 组合
能扩出条带，其中 9、10、11、13、14 五个组
合扩出的条带清晰。经过重复性试验确认13 号试
验体系重复性好，且带型清晰。所以，确定 1 3
号试验体系为萝卜雄不育系A 基因组DNA RAPD-
PCR 反应体系。总反应体系为15 mL，含 ddH2O
10.72 mL、10×缓冲溶液1.5 mL、引物0.4 mmoL·L-1、
dNTPs 100 mmoL·L-1、Mg2+ 1.5 mmol·L-1、酶 1 U·
(15 mL)-1、DNA模板 45 ng·(15 mL)-1。
表1 各因素水平的L16 (45)正交设计
水平数 引物/ dNTPs/ Mg
2+/ Taq 酶/ 模板DNA/
mmol·L-1 mmol·L-1 mmol·L-1 U·(15 mL)-1 ng·(15 mL)-1
1 0.1 100 2.5 0.4 15
2 0.2 80 0.5 1.0 60
3 0.3 200 1.0 1.2 45
4 0.4 160 1.5 1.5 30
讨　　论
根据DNA 电泳条带的有无、清晰度和带的条
数分析，引物在第一水平的处理不能有效扩增，
只有在 2 的组合中出现一条带。可见，浓度较低
的引物不能有效将基因组 RAPD 的位点有效测出，
说明在这个15 mL反应体系中引物第一水平的处理
浓度0.1 mmol·L-1已经不能再低了。这与Smith等
(1994)认为在引物浓度较低时因为引物之间的竞争
作用，基因组 RA P D 的位点有时不能全部测出，
图1 正交设计的RAPD扩增结果
0：空白；M：Marker (100 bp Ladder); 1~16：不同因子的处理组合。
表2 L16 (45)正交试验表
实验号 引物 dNTPs Mg2+ Taq酶 模板DNA
1 1 1 1 1 1
2 1 2 2 2 2
3 1 3 3 3 3
4 1 4 4 4 4
5 2 1 2 3 4
6 2 2 1 4 3
7 2 3 4 1 2
8 2 4 3 2 1
9 3 1 3 4 2
10 3 2 4 3 1
11 3 3 1 2 4
12 3 4 2 1 3
13 4 1 4 2 3
14 4 2 3 1 4
15 4 3 2 4 1
16 4 4 1 3 2
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甚至造成差异假象的观点一致，与传统试验筛选
的结果基本上相同。根据我们分析，浓度为 0.4
mmol·L-1 的引物在反应体系中扩增效果较好；这
与通常反应体系中含0.5 mmol·L-1的引物扩增效果
较好的结论较为接近。
传统的筛选试验认为dNTPs 的浓度过低会导
致无扩增产物或扩出来的条带不清晰；浓度过
高，错误掺入率增强。但我们在 16 个组合的处
理分析中，基本上都有条带扩出，看不出 dNTPs
浓度对扩增效果有影响。这与有些物种(如烟草)
进行 RAPD 时，dNTPs 的浓度影响不大的结论(何
川生等 2001)一致。
Mg2+ 浓度对扩增反应的影响受其它反应成分
的影响，根据我们分析，Mg2+ 浓度为0.5 mmol·L-1
时基本上没有扩增产物，这可能是 Mg2+ 浓度过低
而导致对 Taq 酶激活作用不强的缘故；在 Mg2+ 浓
度为1.5 mmol·L-1时，基本上都能扩增出条带，且
较为清晰，这与一般材料中采用1.5和2.0 mmol·L-1
Mg 2+ 时扩增效果较为理想的条件基本一致。
据报道，T a q 酶用量少会使扩增的条带变
弱，用量过大，则非特异扩增产物含量会增加。
一般认为Taq酶的用量通常以1 U左右扩增效果的
较好，这在本文中也得到验证。
一般认为，D N A 浓度过低，会导致扩增结
果不稳定；过高则导致引物或 dNTPs 过早耗尽，
出现扩增条带不稳定的现象。本文中 DNA 模板的
最低水平处理浓度为15 ng·(15 mL)-1时即不能有效
扩增，说明 DNA 模板浓度过低可能会扩不出条带
或扩带模糊。
总之，R A P D 分子标记技术具有快速、简
捷、对 D N A 模板的质量要求低等优点，一经问
世就得到青睐而迅速推广，但由于其稳定性和可
重复性较差，在某种程度上限制了这一技术的应
用。因此在作 RAPD 试验之前都要先作反应体系
优化考察。RAPD 体系的传统优化一般采用多次
单因素设计方法，由于各因素之间的动态交互作
用影响，不容易快速得到优化反应体系，即使得
到某一优化体系，有时也会出现不稳定的现象。
而正交设计是从多因素试验结果中得到优良的反应
体系，从不同反应体系中扩增带数的不同，可以
看出该体系既体现了各个影响因素的动态交互作
用，同时又避免了传统的繁琐优化过程。
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