全 文 ：书高羊茅单株耐热性相关分子标记的
筛选及其与越夏性的关系研究
陈群１，袁晓君２，何亚丽１
（１．上海交通大学农业与生物学院，上海２００２４０；２．上海大学生命科学技术学院，上海２００４４４）
摘要：筛选与高羊茅单株耐热性和越夏性相关的分子标记有利于建立高效育种体系。以来自于耐热性不同的１２
个高羊茅种质资源的２１６个单株为耐热性分子标记筛选的基础群体，在人工高温（４０℃／３５℃，昼／夜各１２ｈ）和夏
季田间自然条件下分别进行了耐热性和越夏性鉴定。运用简单重复序列区间（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）
和随机扩增多态性ＤＮＡ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍＤＮＡ，ＲＡＰＤ）分子标记技术，采用改良的集团分离分析
法（ｍｏｄｉｆｉｅｄｂｕｌｋｅｄｓｅｇｒｅｇａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ，ＢＳＡ），从８００个ＲＡＰＤ和１００个ＩＳＳＲ分子标记中筛选与耐热性相关分子
标记，并研究其与单株越夏性的关系。结果表明，单株的耐热性与越夏性的相关程度较低（决定系数为３．４％）；引
物３５１扩增的７５０ｂｐ条带（３５１Ｔ７５０）与耐热性显著相关，而引物１３８扩增的９５０ｂｐ条带（１３８Ｔ９５０）则与耐热性
和越夏性均显著相关。可以推论，耐热性强和／或越夏性强单株材料需要分别在人工高温和夏季田间自然条件下
加以鉴定筛选；３５１Ｔ７５０可应用于耐热性强单株的辅助选择，而１３８Ｔ９５０则可以用于耐热性强与越夏性强单株的
辅助选择。
关键词：高羊茅；耐热性；越夏性；简单重复序列区间分子标记（ＩＳＳＲ）；随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）；集团分离分
析法（ＢＳＡ）
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４０．１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１３）０５００８４１２
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０５１０　　
　　高羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）又称苇状羊茅，多年生冷季型和丛生型禾草［１］，是温带地区广泛应用的草坪草
和牧草［２］。高羊茅为异花授粉植物，由３个染色体组组成的异源六倍体（ＰＰＧ１Ｇ１Ｇ２Ｇ２，２狀＝６狓＝４２），基因组包
含约５０亿个碱基对，大小为（５．２７～５．８３）×１０６ｋｂ［１］。在多个冷季型草种中，虽然高羊茅的耐热性最强，周年绿
色期最长，但其适宜的地上部生长温度为１５～２４℃，根系为１０～１８℃［３］，在我国温带和亚热带的夏季也常会遭受
高温胁迫，使生长迟缓或停滞，抗病虫害能力下降，从而造成牧草产量减产，草坪质量下降。因此，改良高羊茅耐
热性，培育耐热新品种，成为高羊茅育种中的当务之急。
在常规育种工作中，鉴于高羊茅是以种子繁殖为主的异花授粉植物，一般通过对不同种源材料杂交所得的后
代进行连续几代的随机授粉和选择达到群体改良的目的，因而其品种多为异质杂合群体［４］。品种群体内存在的
大量变异严重阻碍了基于表型性状的品种鉴定方法的应用。传统品种、品系（含杂交亲本、自交系及供无性繁殖
用的营养体）的鉴定方法是基于对农艺性状表型的识别，须耗费大量的时间和人力，而且常常会受到环境因素影
响，从而造成对多基因性状选择的干扰［４，５］。而耐热性作为一个耐逆性状，往往受到多基因的控制，其表现出的
复杂性使得对其进行形态选择变得非常困难［６］。分子标记辅助选择（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ＭＡＳ）
被认为是目前改良植物抗逆性的一个有效方法，这一方法应用的关键在于首先需要找到与耐热性相关基因或数
量性状基因座（ＱＴＬｓ）紧密连锁且能稳定检测的理想分子标记。这些分子标记的获得不但有利于推动高羊茅耐
热性性状的育种进程，同时也将为揭示耐热性性状的分子遗传规律提供信息。近年来随着禾草转基因和表达研
究的不断深入［７９］，开发出更多的和耐逆性状相关的分子标记也有助于相关基因的定位和克隆。
８４－９５
２０１３年１０月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２２卷　第５期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
收稿日期：２０１２１２０３；改回日期：２０１３０２２１
基金项目：国家自然科学基金面上项目（３０９７２１３４）资助。
作者简介：陈群（１９８６），男，江西鹰潭人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｃｑ２１９１４＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｈｅｙａｌｉ＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
在众多的分子标记中，随机扩增多态性ＤＮＡ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍＤＮＡ，ＲＡＰＤ）分子标记技术
操作简单、快速、省时、ＤＮＡ用量少、设计引物无需预先知道序列信息，但是实验的稳定性和重复性较差。简单重
复序列区间（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）分子标记技术实验操作简单、快速、高效、模板用量少，稳定性和
多态性高，标记为显性标记，符合孟德尔遗传规律，广泛地运用到分子标记工作当中［１０１４］。一般来说，在筛选与目
的基因紧密连锁的分子标记研究中，首先要通过多年回交和筛选建立近等基因系，工作量非常大［１５］。Ｍｉｃｈｅｌ
ｍｏｒｅ等［１６］发展的集团分离分析法（ｂｕｌｋｅｄｓｅｇｒｅｇａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ，ＢＳＡ）首先从一对具有目标基因的表型差异的亲
本所产生的任何一种分离群体中，根据目标基因的表型分别选取一定数量的植株，构成２个亚群或集团，将每群
的ＤＮＡ等量混合，形成２个相对性状的“基因池”（ｇｅｎｅｐｏｏｌ），然后用合适的分子标记对２个基因池进行分析，
在两群间表现多态性的分子标记遗传上与目标性状基因座位相连锁。由于ＢＳＡ法构池过程中２个基因池中所
要标记的差异突出出来，而其他基因或位点的分布基本相同，使得２个ＤＮＡ池总体表现出来的遗传背景近似相
等，这样大大提高了检测出与目的基因紧密连锁的分子标记的可能性［１５］。
本研究在人工高温和田间夏季自然条件下，对来自于１２个耐热性不同的种质资源的２１６个高羊茅单株进行
耐热性和越夏性鉴定，以极端耐热和不耐热单株分别建立耐热与不耐热基因池（拟ＢＳＡ法），在８００个ＲＡＰＤ和
１００个ＩＳＳＲ引物中筛选与耐热性相关的分子标记，并研究其与越夏性的相关性，为提高高羊茅的耐热性和越夏
性育种提供有效的辅助选择工具。
１　材料与方法
１．１　供试材料
本试验的植物材料是由上海交通大学草坪草抗逆育种课题组经多年多点试验鉴定为耐热性强、中、差的３个
商业品种［１７］和９个间接引自中国草种质资源中期库未经人工选择干预和未经耐热性鉴定的野外种质资源，其编
号与来源见表１。
１．２　植株准备
试验于２０１０年１０月初，在上海交通大学农业与生物学院人工气候室内，将上述１２个材料的种子播于盛满
园艺介质（上海孙桥农业技术有限公司生产，草炭∶珍珠岩＝７∶３＝ｖ∶ｖ）的１０ｃｍ直径底部带出水口的育苗盆
中，浇水保持湿润使种子发芽与幼苗生长。播种２１ｄ后，从每个材料中随机抽取１８株长势长相相似的种子萌发
苗，移栽至３个６×１２穴的秧盘（又称“穴盘”）中，即每盘１２行，每行６穴，每穴孔栽种１株。对于不同种质资源
材料的耐热性比较采用的是随机区组试验设计，重复３次，每材料在每重复（区组，穴盘）中６个单株。每穴容积
为２ｃｍ×２ｃｍ×３ｃｍ。栽了植株的秧盘置于底部平铺基质的托盘内，以保证秧盘平放和水分均衡供应。人工气
候室内温度设置为２５℃／２０℃（昼／夜各１２ｈ），光照强度为５４０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ）、相对湿度７０％。每周每穴施１次
５０ｍＬＨｏａｇｌａｎｄ营养液，隔天浇水１次，每７ｄ修剪１次。育苗期间喷施甲基托布津／代森锰锌混合药液防治褐
斑病２次。热胁迫开始前２ｄ将植株修剪到５ｃｍ高。每天目测检查介质中湿度，保持充足但不过量的水分供应。
１．３　热胁迫处理与单株耐热性排序和评分
２０１１年３月２９日将人工气候室温度调至４０℃／３５℃（１２ｈ／１２ｈ），光强５４０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），相对湿度７０％，
对材料进行热胁迫。试验期间每天浇水１次，严格控制水量，使水分均衡供应。每周每穴施１次 Ｈｏａｇｌａｎｄ营养
液，５０ｍＬ。为了降低不同部位受到的光照强度与温度的不同影响带来的试验误差，每天横向平移交换秧盘所在
位置，３ｄ为１个平移周期，然后将秧盘反转１８０°后进行同样的平移处理。热胁迫期间每天考察植株在高温胁迫
下的表现，以目测法判定植株耐受热胁迫的天数，即自热胁迫当天开始至植株表现为叶色发黄和失水萎蔫严重的
天数 （下简称“耐受天数”）。在植株出现这种极度热伤害症状后，从热胁迫的人工气候室中取出，移栽到新的装
有园艺介质的秧盘中，置于常温下恢复生长。
同批取出的植株耐受热胁迫的天数相同，但不同单株间仍然能够目测区分出伤害程度不同，依热胁迫伤害最
重至相对最轻排序。例如热胁迫２８ｄ有首批１１株出现萎蔫症状，其受害最重的为耐热性最差的植株，不耐热性
排名第１，其余依次排名至第１１。第２批取出的植株中最不耐热的排第１２，依次类推，总共２１６株植株的不耐热
性从１排至２１６位，第２１６位植株为最耐热的植株。
５８第２２卷第５期 草业学报２０１３年
表１　供试材料来源及特性
犜犪犫犾犲１　犜犺犲狊狅狌狉犮犲狊犪狀犱犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳狋犺犲狋犲狊狋犲犱犿犪狋犲狉犻犪犾狊
材料编号
Ｍａｔｅｒｉａｌｓｅｎｔｒｙ
产地或商品名称
Ｐｌａｃｅｏｆｏｒｉｇｉｎｏｒｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｎａｍｅ
类型和特点
Ｔｙｐｅａｎｄｍａｉｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
来源
Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｏｒ
ＴＦ０１ 日本Ｊａｐａｎ 国外野生资源 Ｗｉｌｄｒｅｓｏｕｒｃｅｓａｂｒｏａｄ 国家草种质资源中期库ＳｔａｔｅＭｅｄｉｕｍ
ｔｅｒｍＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙｆｏｒＧｒａｓｓＧｅｒｍｐｌａｓｍｓ
ＴＦ０２ 阿根廷Ａｒｇｅｎｔｉｎａ 国外野生资源 Ｗｉｌｄｒｅｓｏｕｒｃｅｓａｂｒｏａｄ 国家草种质资源中期库ＳｔａｔｅＭｅｄｉｕｍ
ｔｅｒｍＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙｆｏｒＧｒａｓｓＧｅｒｍｐｌａｓｍｓ
ＴＦ０３ 宁夏回族自治区 ＮｉｎｇｘｉａＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓ
ＲｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＨｕｉＮａｔｉｏｎａｌｉｔｙ
国内野生资源Ｄｏｍｅｓｔｉｃｗｉｌｄｒｅｓｏｕｒｃｅｓ 国家草种质资源中期库ＳｔａｔｅＭｅｄｉｕｍ
ｔｅｒｍＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙｆｏｒＧｒａｓｓＧｅｒｍｐｌａｓｍｓ
ＴＦ０４ 新疆伊犁昭苏 ＹｉｌｉＺｈａｏｓｕｏｆＸｉｎｊｉａｎｇ
ＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎ
国内野生资源Ｄｏｍｅｓｔｉｃｗｉｌｄｒｅｓｏｕｒｃｅｓ 国家草种质资源中期库ＳｔａｔｅＭｅｄｉｕｍ
ｔｅｒｍＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙｆｏｒＧｒａｓｓＧｅｒｍｐｌａｓｍｓ
ＴＦ０５ 新疆博勒赛里木湖ＢｏｌｅｒＳａｉｌｉｍｕＬａｋｅ
ｏｆＸｉｎｊｉａｎｇＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎ
国内野生资源Ｄｏｍｅｓｔｉｃｗｉｌｄｒｅｓｏｕｒｃｅｓ 国家草种质资源中期库ＳｔａｔｅＭｅｄｉｕｍ
ｔｅｒｍＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙｆｏｒＧｒａｓｓＧｅｒｍｐｌａｓｍｓ
ＴＦ０６ 新疆谢家沟 ＸｉｅｊｉａｇｏｕｏｆＸｉｎｊｉａｎｇＡｕ
ｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎ
国内野生资源Ｄｏｍｅｓｔｉｃｗｉｌｄｒｅｓｏｕｒｃｅｓ 国家草种质资源中期库ＳｔａｔｅＭｅｄｉｕｍ
ｔｅｒｍＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙｆｏｒＧｒａｓｓＧｅｒｍｐｌａｓｍｓ
ＴＦ０７ 甘肃黄羊镇 ＨｕａｎｇｙａｎｇＴｏｗｎｏｆＧａｎ
ｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ
国内野生资源Ｄｏｍｅｓｔｉｃｗｉｌｄｒｅｓｏｕｒｃｅｓ 国家草种质资源中期库ＳｔａｔｅＭｅｄｉｕｍ
ｔｅｒｍＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙｆｏｒＧｒａｓｓＧｅｒｍｐｌａｓｍｓ
ＴＦ０８ 新疆塔城ＴａｃｈｅｎｇｏｆＸｉｎｊｉａｎｇＡｕｔｏｎｏ
ｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎ
国内野生资源Ｄｏｍｅｓｔｉｃｗｉｌｄｒｅｓｏｕｒｃｅｓ 国家草种质资源中期库ＳｔａｔｅＭｅｄｉｕｍ
ｔｅｒｍＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙｆｏｒＧｒａｓｓＧｅｒｍｐｌａｓｍｓ
ＴＦ０９ 新疆乌市南戈壁ＳｏｕｔｈｅｒｎＧｅｂｉｏｆＵｒｕ
ｍｑｉＣｉｔｙｏｆＸｉｎｊｉａｎｇＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎ
国内野生资源Ｄｏｍｅｓｔｉｃｗｉｌｄｒｅｓｏｕｒｃｅｓ 国家草种质资源中期库ＳｔａｔｅＭｅｄｉｕｍ
ｔｅｒｍＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙｆｏｒＧｒａｓｓＧｅｒｍｐｌａｓｍｓ
ＴＦ１０ 家园ＣＶ．Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ 耐热和越夏性中等品种Ｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｒｓｍｅｄｉ
ｕｍｔｏｌｅｒａｎｔｔｏｈｅａｔａｎｄｓｕｍｍｅｒｓｔｒｅｓｓ
中国种子集团公司ＣｈｉｎａＮａｔｉｏｎａｌＳｅｅｄ
ＧｒｏｕｐＣＯ．，ＬＴＤ．
ＴＦ１１ 强劲ＣＶ．Ｉｎｆｅｒｎｏ 耐热和越夏强品种 Ｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｒｓｓｔｒｏｎｇｌｙ
ｔｏｌｅｒａｎｔｔｏｈｅａｔａｎｄｓｕｍｍｅｒｓｔｒｅｓｓ
北京 布 莱 特 草 业 有 限 公 司 Ｂｅｉｊｉｎｇ
ＢｒｉｇｈｔＧｒａｓｓＩｎｄｕｓｔｒｙＬＴＤ．
ＴＦ１２ 辉煌ＢｒａｎｄＨｕｉｈｕａｎｇ 商品组合Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｂｌｅｎｄ 北京 布 莱 特 草 业 有 限 公 司 Ｂｅｉｊｉｎｇ
ＢｒｉｇｈｔＧｒａｓｓＩｎｄｕｓｔｒｙＬＴＤ．
　　采用改进的９分制评分方法对２１６株的耐热性进行评分。把首批取出的耐受天数为２８ｄ的１１株（犖＝１１）
中最不耐热植株的评分定为１分，最后一批取出的耐受天数为５２ｄ的３８株植株中最不耐热的植株评为７分。
由于首尾２批植株的耐受天数相隔２４ｄ，且２期最差植株的评分相差６分，则平均每延长４ｄ取出的批次的最差
植株加１分［（５２－２８）／（７－１）＝４］，而同一批次内各植株的评分首尾相差０．２５分，这样，不耐热性排序每滞后１
位加上０．２５／（狀－１）分。根据上述评分方法，总结出单株的评分（Ｋ）公式为：
犓＝１＋犱－２８４ ＋０．２５×
狀－１
犖－１
其中，犱为热胁迫耐受天数，狀为同一耐受天数中植株的不耐热性排序位次，犖 为同一耐受天数的植株数。例如，
第１批移出人工气候室的植株，为热胁迫耐受天数２８ｄ（犱＝２８）的单株，小计有１１株（犖＝１１），其中最不耐热的
植株评分为１，排序第２的不耐热植株的评分则为１．０２５。又例如，第３批取出的，耐受天数为３２ｄ的植株有１１
株，其排序第５的植株的评分则为２．１００分。以此类推，各耐受天数植株数与其评分标准列于表２中。
１．４　单株越夏性鉴定
把热胁迫处理后植株置于室内常温下恢复生长１个月，于２０１１年秋季把２１６株中能够恢复生长的１９３株移
栽到大田。株行距３５ｃｍ×４５ｃｍ，每月修剪１次，剪草高度１２ｃｍ。适时施肥和进行病、虫、草害管理。经过
６８ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
２０１２年夏季自然高温和干旱胁迫后，于２０１２年８月２２日按改进的９分制对田间单株进行评分，进行越夏性鉴
定。夏季高温干旱胁迫后枯死的植株评为１分，尚有１～２个成活茎蘖的单株给２分，６分为可接受的植株，８分
为分蘖多、长势依然旺盛的植株，９分为没有出现受害症状的植株。
表２　单株耐热性排序与评分方法
犜犪犫犾犲２　犚犪狀犽犻狀犵犪狀犱狉犪狋犻狀犵狊狅犳犺犲犪狋狋狅犾犲狉犪狀犮犲犳狅狉狊犻狀犵犾犲狆犾犪狀狋狊
植株停止热胁迫批次
Ｂａｔｃｈｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｐｌａｎｔｓｅｎｄｉｎｇ
ｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ
热胁迫耐受天数
Ｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｄａｙｓｏｆ
ｐｌａｎｔｓｃｏｕｌｄ
ｓｕｒｖｉｖｅ（ｄ）
批次内株数
Ｐｌａｎｔｓｎｕｍｂｅｒ
ｗｉｔｈｉｎｔｈｅ
ｂａｔｃｈ（Ｎ）
各批次内最不耐热植株评分
Ｒａｔｉｎｇｇｒａｄｅｆｏｒｔｈｅｍｏｓｔ
ｈｅａｔｓｅｎｓｉｔｉｖｅｐｌａｎｔｓ
ｗｉｔｈｉｎｔｈｅｂａｔｃｈ
批次内植株耐热性排序每滞后１位增加
的评分单位Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｒａｔｉｎｇｕｎｉｔｆｏｒ
ｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｅａｃｈｏｎｅｌａｇｉｎｒａｎｋｉｎｇ
ｏｆｈｅａｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｗｉｔｈｉｎｂａｔｃｈ
１ ２８ １１ １．００ ０．０２５
２ ３０ １２ １．５０ ０．０２３
３ ３２ １１ ２．００ ０．０２５
４ ３８ ３４ ３．５０ ０．００８
５ ３９ １６ ３．７５ ０．０１７
６ ４０ ２２ ４．００ ０．０１２
７ ４２ １４ ４．５０ ０．０１９
８ ４３ １９ ４．７５ ０．０１４
９ ４５ ５ ５．２５ ０．０６３
１０ ４７ １４ ５．７５ ０．０１９
１１ ５０ ２０ ６．５０ ０．０１３
１２ ５２ ３８ ７．００ ０．００７
１．５　ＤＮＡ提取和拟ＢＳＡ法构建基因池
在耐热性鉴定后，分别取各单株叶片约０．２ｇ，采用十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）法［１８］提取基因组ＤＮＡ。
用０．８％的琼脂糖凝胶电泳检测，并结合紫外分光光度仪检测所提取ＤＮＡ的完整性和浓度。再将所提ＤＮＡ用
ｐＨ８．０的ＴｒｉｓＥＤＴＡ缓冲液稀释成相同浓度（２０ｎｇ／μＬ），－２０℃保存备用。选取最耐热和最不耐热的各１１个
单株的ＤＮＡ等量混合，分别构建耐热基因池（ＨＴ，ｈｅａｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ）和不耐热基因池（ＨＳ，ｈｅａｔｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）。
１．６　ＰＣＲ反应体系和产物的检测
采用的ＲＡＰＤ和ＩＳＳＲ引物，均根据加拿大大不列颠哥伦比亚大学（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＢｒｉｔｉｓｈＣｏｌｕｍｂｉａ）公布的
编号和序列，由上海生工生物技术服务有限公司合成，其中ＲＡＰＤ引物编号１～８００，ＩＳＳＲ引物编号８０１～９００。
聚合酶链式反应（ＰＣＲ）在９６孔板上进行。采用１０μＬ反应体系：５单位（Ｕ）／μＬＴａｑ聚合酶１μＬ，１０×缓冲液
（Ｍｇ２＋ Ｐｌｕｓ）１μＬ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ引物０．５μＬ，２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ混合液０．２μＬ，２０ｎｇ／μＬＤＮＡ模板１μＬ，５０％
甘油２μＬ，双蒸水４．３μＬ。Ｔａｑ酶、１０×缓冲液、ｄＮＴＰ混合液均购自中国大连Ｔａｋａｒａ公司。ＰＣＲ扩增条件为
９４℃下预变性３ｍｉｎ；进入循环，９４℃下变性１０ｓ，复性温度（Ｔ＝Ｔｍ－２℃）下复性３０ｓ，７２℃下延伸４５ｓ，共３５
个循环；最后在７２℃下延伸６ｍｉｎ，结束后于４℃下保存。
扩增产物加入４μＬ１∶１混合的１×ＳＹＢＲ? ＧｒｅｅｎＩ（北京鼎国生物有限公司）和溴酚蓝（Ｔａｋａｒａ公司）混合
溶液，静置１０ｍｉｎ，取６μＬ混合液，用２％的琼脂糖凝胶电泳分离。用自动凝胶成像系统（Ｔａｎｏｎ３５００，上海天能
科技有限公司）进行紫外观察并拍照记录。上述所有反应均重复２次。
１．７　数据分析
数据用 ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ２００７统计分析软件进行方差分析、平均数的多重比较（ＬＳＤ法）、χ
２ 独立性检
验和相关分析等处理。
７８第２２卷第５期 草业学报２０１３年
２　结果与分析
２．１　耐热性排序与评分和构池单株的确定
各批次取出（不同热胁迫耐受天数）的植株数目见
表２。最不耐热的植株可以耐受２８ｄ热胁迫，最耐热
的单株可以耐受５２ｄ及以上的热胁迫强度，而一半植
株耐受热胁迫的天数为４２ｄ。结合耐受天数和热伤害
的形态，按最耐热到最不耐热的顺序编号为１～２１６，１
为最不耐热单株，２１６为最耐热单株，从而得到２１６个
单株的耐热性排序。在恢复生长的过程中，有２３个单
株死亡。在幸存的１９３株单株中，选取最耐热和最不
耐热的单株各１１株构成不耐热基因池（ＨＳ）和耐热基
因池（ＨＴ）的植株（表３）。
对单株的耐热性评分结果（图１）表明最早受到热
伤害，且伤害程度最大的植株（即最不耐热植株）的评
分最低，为１分。形态上出现热伤害症状最晚，且伤害
程度最轻的植株（即最耐热植株）的得分最高，为７．２５
分。全部单株的平均得分为４．６３分，标准差１．８１，峰
度系数为－０．８３，偏度系数为－０．１９６，为略微左偏的
趋近正态分布（图１）。１９３株中，评分大于等于７分的
耐热单株有３７株，占１９％，而评分小于等于３分的不
耐热单株为２１株，占１０．９％。
表３　不同材料的耐热性与构池单株来源
犜犪犫犾犲３　犎犲犪狋狋狅犾犲狉犪狀犮犲狅犳狋犺犲犿犪狋犲狉犻犪犾狊犪狀犱狋犺犲狅狉犻犵犻狀
狅犳狊犻狀犵犾犲狆犾犪狀狋狊犮狅犿狆狅狊犲犱狋狅犇犖犃狆狅狅犾狊
材料编号
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ
ｅｎｔｒｙ
质量评分
Ｖｉｓｕａｌ
ｑｕａｌｉｔｙ
耐热基因池植株数
Ｐｌａｎｔｓｃｏｍｐｏｓｅｄ
ｔｏｈｅａｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ
ＤＮＡｐｏｏｌ
不耐热基因池植株数
Ｐｌａｎｔｓｃｏｍｐｏｓｅｄ
ｔｏｈｅａｔｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ＤＮＡｐｏｏｌ
ＴＦ０９ ５．８７ａ ５
ＴＦ１１ ５．４４ａｂ １ １
ＴＦ０８ ５．２５ａｂｃ １
ＴＦ０７ ５．１８ａｂｃ ３
ＴＦ０１ ５．０７ａｂｃｄ ２
ＴＦ１２ ４．７７ａｂｃｄ １ ２
ＴＦ０５ ４．５４ｂｃｄｅ
ＴＦ０２ ４．３４ｂｃｄｅ
ＴＦ１０ ４．１７ｃｄｅ ２
ＴＦ０４ ４．０２ｄｅ
ＴＦ０３ ３．５１ｅ １
ＴＦ０６ ３．４６ｅ ３
　不同字母表示显著差异（犘＜０．０５），ＬＳＤ０．０５＝１．１１７。
　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５，ＬＳＤ０．０５＝
１．１１７．
　　对不同材料的耐热性评分进行方差分析结果表
图１　单株耐热性评分分布
犉犻犵．１　犇犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀狅犳狉犪狋犻狀犵犵狉犪犱犲狅犳
犺犲犪狋狋狅犾犲狉犪狀犮犲狅犳狊犻狀犵犾犲狆犾犪狀狋狊　
明，不同材料间耐热性差异显著。对不同材料耐热性
评分的平均数多重比较结果（表３）表明，ＴＦ０９（新疆
乌市南戈壁）的耐热性最强，单株平均分为５．８７，显著
高于评分为４．５４及以下的ＴＦ０５等材料。与ＴＦ０９的
耐热性没有显著差异的材料有ＴＦ１１，ＴＦ０８等５个，
均标有字母ａ。最不耐热的材料为 ＴＦ０６（新疆谢家
沟），与其没有显著差异的有ＴＦ０３（宁夏），ＴＦ０４等５
个材料，它们的平均数均标记有字母ｅ。
耐热基因池植株大多来自于标有字母ａ的较耐热
种质资源，其中５／１１来自于最耐热的ＴＦ０９。不耐热
基因池植株主要来源于标有字母ｅ的材料。耐热的材
料中选到最耐热的单株较多，不耐热的材料中选到不
耐热单株较多，耐热中间型的材料中则能选到２种类型的植株。
２．２　越夏性评分
单株越夏性评分最低为１分（枯死植株），占４２．４％。把越夏性评分小于等于２的植株（有１～３蘖存活）作
为极端越夏性差的植株有１３０株，占６７．４％。越夏性评分大于等于７的植株有１９株，占５．７％。平均２．６３，标准
差２．１５，峰度０．５６，偏度１．３４（图２）。
对不同材料的越夏性评分进行方差分析结果表明，不同材料间差异显著。对不同材料越夏性评分平均数的
多重比较结果（图３）表明，越夏性最强的材料为ＴＦ０７（甘肃黄羊镇），与之没有显著差异的材料有ＴＦ０９，ＴＦ１１等
４个材料，均标有字母ａ。越夏性最弱的为ＴＦ０２（阿根廷），与之没有显著差异的有ＴＦ０４，ＴＦ０６，ＴＦ１２，它们均标
８８ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
记有字母ｃ。ＴＦ０１等４个标记有ｂｃ字母的材料越夏
图２　单株越夏性评分分布
犉犻犵．２　犇犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀狅犳狊狌犿犿犲狉狋狅犾犲狉犪狀犮犲
狉犪狋犻狀犵犵狉犪犱犲狊犳狅狉狊犻狀犵犾犲狆犾犪狀狋狊
　
性为中等。
图３　不同材料的越夏性评分的比较
犉犻犵．３　犕狌犾狋犻狆犾犲犮狅犿狆犪狉犻狊狅狀狊狅犳狊狌犿犿犲狉狋狅犾犲狉犪狀犮犲
狉犪狋犻狀犵犵狉犪犱犲犫犲狋狑犲犲狀犲犪犮犺犿犪狋犲狉犻犪犾狊
　　　不同字母表示显著差异（犘＜０．０５），ＬＳＤ０．０５＝１．４３５。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓ
ｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５，ＬＳＤ０．０５＝１．４３５．
２．３　耐热性和越夏性的相关性
分别对各材料内单株的耐热性与越夏性的相关分
析结果（表４）表明，只有ＴＦ０１和ＴＦ０６的耐热性和越
夏性之间的相关系数显著不等于零（犘＜０．０５），相关
程度（决定系数狉２）分别为３２％和２９％。对各材料耐
热性评分平均数与越夏性评分平均数的相关分析结果
表明相关性显著（犘＜０．０５），相关程度达４３％。虽然
对所有１９３株的耐热性与越夏性的相关性分析结果也
表明相关显著，但相关程度极低，决定系数仅为３．４％。
２．４　池间多态性分子标记
用８００个 ＲＡＰＤ引物对２个基因池进行多态性
筛选的结果表明，能扩增出条带的引物有６３２个，占总
引物数的７９％，平均每个引物能扩增出２．７条清晰的
条带，但最终获得池间具有多态性的引物仅有６个，为
５４，６８，７８，１３８，３５１和５１１引物（图４）。用１００个
ＩＳＳＲ对２个基因池进行多态性的筛选，能扩增出清晰
条带的引物有６２个，占引物总数的６２％，平均能扩增
出５．２条清晰的条带，最终获得池间具有多态性的引
物有２个，为８４３和８５６引物（图４）。这８个引物的碱
基序列及退火温度与其在耐热和不耐热池间的特异性
条带见表５。
２．５　池间多态性分子标记在构池单株中的验证
上述筛选出的多态性条带根据引物序号及其片段
大小，分别命名为５４Ｓ５５０、６８Ｓ１０００、７８Ｔ８００、７８Ｔ９００、
１３８Ｔ９５０、３５１Ｔ７５０、３５１Ｔ５００、５１１Ｓ７００、５１１Ｓ９００、
５１１Ｓ１１００、８４３Ｓ６５０，存在亮度差异的２个条带命名为８５６Ｓ９５０、８５６Ｓ３００。对从耐热、不耐热ＤＮＡ池中筛选出
来的６个ＲＡＰＤ和２个ＩＳＳＲ引物，用建成耐热、不耐热ＤＮＡ池的各１１个单株进行验证。结果在池间扩增出的
多态性条带和构池单株扩增结果相符的引物只有１３８（图５）和３５１（图６）。将耐热性强弱和目标条带的有无进行
卡方独立性测验，结果表明，３５１Ｔ７５０和耐热性有显著相关（χ
２＝４．９１，犘＜０．０５），而１３８Ｔ９５０标记和耐热性虽
没有显著相关（χ
２＝２．５４，犘＞０．０５），但在不耐热基因池的１１个单株中没有该条带的吻合度也达到８２％。
２．６　池间多态性分子标记在基础群体单株中的验证
把在池间与构池单株间多态性表现一致的２个标记“１３８Ｔ９５０”和“３５１Ｔ７５０”在１９３个基础群体单株中进行
扩增。结果（表６）表明，在３７株耐热性强（评分≥７）单株中，１３８Ｔ９５０标记扩增出条带的有１７株单株，占
４５．９％，而在不耐热的２１株（评分≤２．２５）中扩增出条带的植株数为３株，仅占１４．３％，卡方独立性检验结果显
示该标记与耐热性显著相关（χ
２＝４．６３，犘＜０．０５）。同样，３５１Ｔ７５０标记与耐热性也显著相关（χ
２＝１１．７９，犘＜
０．０５），在耐热单株中扩增出条带的单株占５９．５％，显著高于在不耐热单株的９．５％。此外，１３８Ｔ９５０标记与群
体单株的越夏性具有显著相关（χ
２＝４．９４，犘＜０．０５），在越夏性强单株（评分≥７）中扩增出条带的单株比例为
５７．９％，显著高于越夏性弱（评分≤２）的２９．２％，但３５１Ｔ７５０标记与群体单株的越夏性未表现出显著相关性
（χ
２＝０．０２，犘＞０．０５）（表６）。
９８第２２卷第５期 草业学报２０１３年
表４　耐热性与越夏性的相关系数和决定系数
犜犪犫犾犲４　犆狅狉狉犲犾犪狋犻狅狀犪狀犱犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀犮狅犲犳犳犻犮犻犲狀狋狊犫犲狋狑犲犲狀犺犲犪狋犪狀犱狊狌犿犿犲狉狋狅犾犲狉犪狀犮犲
变异来源
Ｓｏｕｒｃｅｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ
简单相关系数
Ｓｉｍｐｌｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
决定系数
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ（狉２）
自由度
Ｄｅｇｒｅｅｏｆｆｒｅｅｄｏｍ
最小显著相关系数
狉０．０５
概率
犘
ＴＦ０１ ０．５７ ０．３２ １５ ０．４８２ ＜０．０５
ＴＦ０２ ０．３１ ０．１０ １５ ０．４８２ ＞０．０５
ＴＦ０３ ０．２１ ０．０５ １３ ０．５１４ ＞０．０５
ＴＦ０４ ０．０１ ０．００ １４ ０．４９７ ＞０．０５
ＴＦ０５ ０．２０ ０．０４ １３ ０．５１４ ＞０．０５
ＴＦ０６ ０．５４ ０．２９ １３ ０．５１４ ＜０．０５
ＴＦ０７ －０．１４ ０．０２ １４ ０．４９７ ＞０．０５
ＴＦ０８ ０．１３ ０．０２ １５ ０．４８２ ＞０．０５
ＴＦ０９ ０．０２ ０．００ １３ ０．５１４ ＞０．０５
ＴＦ１０ ０．０３ ０．００ １４ ０．４９７ ＞０．０５
ＴＦ１１ ０．１１ ０．０１ １６ ０．４６８ ＞０．０５
ＴＦ１２ －０．３４ ０．１２ １４ ０．４９７ ＞０．０５
材料平均数 Ｍｅａｎｏｆｍａｔｅｒｉａｌｓ ０．６６ ０．４３ １０ ０．５７６ ＜０．０５
所有单株Ａｌｐｌａｎｔｓ ０．１８ ０．０３ １９１ ０．１３８ ＜０．０５
图４　由６个犚犃犘犇（５４，６８，７８，１３８，３５１和５１１）和２个犐犛犛犚（８４３和８５６）引物在耐热植株犇犖犃组成的
耐热基因池（犜）和不耐热植株犇犖犃组成的不耐热基因池（犛）间犘犆犚扩增产物的多态性
犉犻犵．４　犘狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿狊犳狉狅犿犘犆犚犪犿狆犾犻犮犪狋犻狅狀狑犻狋犺６犚犃犘犇（５４，６８，７８，１３８，３５１犪狀犱５１１）犪狀犱２犐犛犛犚（８４３犪狀犱８５６）
狆狉犻犿犲狉狊犫犲狋狑犲犲狀犫狌犾犽犲犱犇犖犃狆狅狅犾狊犳狉狅犿犺犲犪狋狋狅犾犲狉犪狀狋犻狀犱犻狏犻犱狌犪犾狊（犜）犪狀犱犺犲犪狋狊犲狀狊犻狋犻狏犲犻狀犱犻狏犻犱狌犪犾狊（犛）
　
３　讨论和结论
３．１　单株耐热性鉴定的可靠性
改良植株耐热性的一个主要挑战是确定可靠的筛选方法和选择有效的耐热性评价指标来检测植株的耐热
性。一般而言，田间的环境变异大，不适合评价和选育耐热单株或群体。人工气候室中温度可控，理论上可以从
苗期鉴定到生殖生长期。在耐热性鉴定指标的选择上，人们往往更倾向于把热胁迫后植株的形态与多个生理指
标相结合的综合评价方法，比用单一指标的评价结果更可靠［１９，２０］。但这种多指标的评价方法往往需要进行破坏
性取样，需要较大的处理群体，而且耗时费力，一般只适用于对少数几个品种或处理的植株群体的耐热性评价。
本研究是要对２１６个单株进行耐热性评价，以便获得构建ＢＳＡ法研究体系的耐热与不耐热基因池所需要的极端
０９ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
表５　池间多态性引物与犘犆犚扩增条带
犜犪犫犾犲５　犅犪狀犱狊狅犳狆狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿狊犪犿狆犾犻犳犻犲犱犫狔犘犆犚狑犻狋犺狆狉犻犿犲狉狊犫犲狋狑犲犲狀狋犺犲犇犖犃狆狅狅犾狊
引物编号
Ｐｒｉｍｅｒｅｎｔｒｙ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
耐热基因池扩增条带
ＢａｎｄｓｉｎＴ（ｂｐ）
不耐热基因池扩增条带
ＢａｎｄｓｉｎＳ（ｂｐ）
５４ ５′ＧＴＣＣＣＡＧＡＧＣ３′ ４１．００ － ５５０
６８ ５′ＧＡＧＣＴＣＧＣＧＡ５′ ４１．００ － １０００
７８ ５′ＧＡＧＣＡＣＴＡＧＣ５′ ３６．９０ ８００，９００ －
１３８ ５′ＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴ５′ ３６．９０ ９５０ －
３５１ ５′ＣＴＣＣＣＧＧＴＧＧ５′ ４５．１０ ７５０，５００ －
５１１ ５′ＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧ５′ ３２．８０ － ７００，９００，１１００
８４３ ５′ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＲＡ５′ ５３．８８ － ６５０
８５６ ５′ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＹＡ５′ ５３．８８ ９５０（强Ｓｔｒｏｎｇ） ９５０（弱 Ｗｅａｋ）
３００（弱 Ｗｅａｋ） ３００（强Ｓｔｒｏｎｇ）
　Ｔ，耐热基因池 Ｈｅａｔｔｏｌｅｒａｎｔｇｅｎｅｐｏｏｌ；Ｓ，不耐热基因池 Ｈｅａｔｓｅｎｓｉｔｉｖｅｇｅｎｅｐｏｏｌ．
图５　引物１３８在构池耐热（犎犜）和不耐热（犎犛）单株上的扩增电泳图谱
犉犻犵．５　犘狉狅犳犻犾犲狅犳犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狆狉狅犱狌犮狋狊犫狔狆狉犻犿犲狉１３８犻狀犺犲犪狋狋狅犾犲狉犪狀狋（犎犜）
犪狀犱犺犲犪狋狊犲狀狊犻狋犻狏犲（犎犛）狆犾犪狀狋狊犮狅犿狆狅狊犲犱狋狅犇犖犃狆狅狅犾狊
　
图６　随机多态性引物３５１在构池耐热（犎犜）和不耐热（犎犛）单株上的扩增电泳图谱
犉犻犵．６　犘狉狅犳犻犾犲狅犳犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狆狉狅犱狌犮狋狊犫狔狆狉犻犿犲狉３５１犻狀犺犲犪狋狋狅犾犲狉犪狀狋（犎犜）
犪狀犱犺犲犪狋狊犲狀狊犻狋犻狏犲（犎犛）狆犾犪狀狋狊犮狅犿狆狅狊犲犱狋狅犇犖犃狆狅狅犾狊
　
耐热和不耐热的单株。由于单株多和单株的茎叶量少，不能满足需要破坏性取样的多个生理指标的测定需求。
植物在热胁迫后最明显的伤害症状是叶片发黄和植株失水萎蔫。本研究根据各单株在热胁迫过程中的热伤害症
状出现的先后和不同程度确定各个植株耐受热胁迫的天数和进行９分制评分，得到了２１６株的耐热性排序，方法
简便，快速高效。但是，对于２１６个单株而言，试验中没有重复，试验误差无法估计，这种评价结果的可靠性值得
关注。为了提高单株耐热性比较结果的可靠性，唯有依赖于降低试验误差，尽量使各单株所处的温、光、水、肥等
的环境条件相似。主要采取了以下控制误差的措施：托盘内垫满园艺介质，使置于其上的秧盘内植株处于同样的
水平面上，避免穴盘的高低不平造成介质中水肥含量的差异；定量供应每棵单株的水和营养液；循环平移和１８０°
旋转穴盘，使秧盘在一个热胁迫周期内受到的温、光影响相似。这些控制试验误差的措施对提高试验结果的准确
性的作用可以从１２个不同材料的耐热性比较结果得到反映。对于参试的１２个种质资源材料而言，每材料具有
１９第２２卷第５期 草业学报２０１３年
１８个单株，构成有重复的试验，可以进行统计分析，估计误差，其误差大小可以反映该试验的精确性。统计分析
结果表明，不同材料的耐热性差异显著，说明材料间的平均耐热性差异显著大于由材料内单株基因型和试验误差
引起耐热性差异，误差引起的耐热性差异相对较小。在１２个参试材料中，“强劲（ＴＦ１１）”在本次研究中耐热性位
于第２，越夏性位于第３，分别与位于第１的材料间没有显著差异，这与在田间的草坪群体的越夏性鉴定结果［１７］
和温室中的耐热性鉴定结果（未发表）一致，均名列前茅。“家园”和“辉煌”的试验结果也与先前的研究结果［１７］吻
合。本次试验３个材料单株鉴定结果与多年多点草坪鉴定结果趋势一致也表明了本研究中单株耐热性与越夏性
鉴定结果的可靠性。
表６　“１３８犜９５０”和“３５１犜７５０”在基础群体中耐热性和越夏性两极单株中的检测结果
犜犪犫犾犲６　犞犪犾犻犱犪狋犻狅狀狅犳“１３８犜９５０”和“３５１犜７５０”犿犪狉犽犲狉狊犻狀狆犾犪狀狋狊狅犳犺犲犪狋犪狀犱狊狌犿犿犲狉
狋狅犾犲狉犪狀狋犪狀犱狊犲狀狊犻狋犻狏犲犵狉狅狌狆狊犻狀狋犺犲犫犪狊犻犮狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀
单株来源Ｐｌａｎｔｏｒｉｇｉｎ 耐热性 Ｈｅａｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ
单株（强，弱）
Ｐｌａｎｔｓ（ｔｏｌｅｒａｎｔ，
ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）
１３８Ｔ９５０
ＮＴ ＮＳ
３５１Ｔ７５０
ＮＴ ＮＳ
越夏性Ｓｕｍｍｅｒｔｏｌｅｒａｎｃｅ
单株（强，弱）
Ｐｌａｎｔｓ（ｔｏｌｅｒａｎｔ，
ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）
１３８Ｔ９５０
ＮＴ ＮＳ
３５１Ｔ７５０
ＮＴ ＮＳ
观察值Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ３７，２１ １７ ３ ２２ ２ １９，１３０ １１ ３８ ７ ４６
具有标记植株百分率Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｍａｒｋｅｒｓ（％）
４５．９ １４．３ ５９．５ ９．５ ５７．９ ２９．２ ３６．８ ３５．４
χ２检验χ２ｔｅｓｔ χ２＝４．６３
犘＜０．０５
χ２＝１１．７９
犘＜０．０５
χ２＝４．９４
犘＜０．０５
χ２＝０．０２
犘＞０．０５
　ＮＴ，ＮＳ表示检测到相关标记在耐热性强、弱和越夏性强、弱单株上出现的单株数。
　ＮＴａｎｄＮＳｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔｈｅｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｂａｎｄｏｆｔｈｅｍａｒｋｅｒｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅｈｅａｔｔｏｌｅｒａｎｔ（ＮＴ）ｏｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（ＮＳ）ａｎｄｓｕｍｍｅｒｔｏｌｅｒａｎｔ（ＮＴ）
ｏｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（ＮＳ）ｇｒｏｕｐｓ．
从构建耐热与不耐热基因池的单株来源来看，耐热基因池单株主要来自耐热性强的材料，不耐热单株主要来
自于耐热性差的材料，而耐热性中等的材料中既可筛选出少数耐热性强的单株，也能筛选到耐热性差的单株。这
一现象，既反映了育种上 “优中选优”的单株选择的一般法则，也进一步反映出本研究单株耐热性鉴定结果的可
靠性。
３．２　耐热性与越夏性的关系
本试验中热胁迫温度处理为４０℃／３５℃（１２ｈ／１２ｈ），高羊茅的热胁迫耐受天数最短为２８ｄ，最长为５２ｄ及
以上，这远远超过了我国长江中下游地区夏季高温天数的总和。高羊茅在长江中下游地区会出现越夏困难，显然
不是单纯的高温胁迫所致。本研究中１９３个单株的耐热性评分与越夏性评分的相关性分析表明，因自由度大，显
著水平狉０．０５降低，而测验出相关显著 （显著不为零），但并不能说明相关性好，描述两者相关程度的应为决定系
数。本研究中单株耐热性与越夏性的决定系数为３．４％ （狉２），表明单株的越夏性仅有３．４％与耐热性有关，还有
９６．６％的影响越夏性的因子与耐热性无关。单株耐热性与越夏性无关的实际表现是，耐热强的单株在田间的越
夏性不一定强，而耐热性弱的，在田间自然温度下，越夏性也不一定弱。分析其原因主要是越夏性与耐热性的内
涵不同，夏季胁迫是多种胁迫因素的共同作用，高羊茅越夏性是多种抗性组成的综合抗性，包括耐热性、抗病性、
耐涝性、耐强光照等。此外，越夏性的内涵随各年份夏季气候的不同而异。例如：某些干旱年份的夏季胁迫因子
就是干旱、暴晒和高温，该年植物的越夏性就是指对暴晒、干旱和高温，以及由此条件下带来的生物胁迫的抗性。
而对于夏季多雨的年份，越夏性包含的是植株对高温高湿和由此带来的病虫草害的生物逆境胁迫的抗性。所以
当把越夏性作为考察指标时应关注当年的气候条件，明确越夏性的具体内涵。由于单纯的耐热性鉴定结果不等
同于田间越夏性结果，耐热单株和品种的选择不一定能够提高新品种（系）的越夏性。对于以提高自然条件下综
合抗性为目标的高羊茅育种而言，提高高羊茅的越夏性比提高单纯的耐热性更有实际应用价值。而对于开展耐
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热性机理研究的材料选择，应以人工热胁迫试验结果为依据，选择耐热性强与弱的单株为比较材料，而不应以田
间的越夏性表现为选择依据。
由参试材料的耐热性与越夏性鉴定结果可以看到，来自我国新疆乌市南戈壁的高羊茅野生资源（ＴＦ０９）和来
自甘肃黄羊镇的野生资源（ＴＦ０７）的耐热性和越夏性分别名列前茅，与多年多点试验中表现出色的国外引进品种
“强劲”没有显著差异，说明我国自然界也蕴藏着丰富的优质高羊茅种质资源，值得驯化和开发利用。
３．３　耐热性与越夏性分子标记辅助选择
分子标记辅助育种在我国作物育种上应用的研究相对较多，而在草坪草、牧草上的研究相对较少。对高羊茅
分子标记的研究主要体现在遗传图谱的构建、比较基因组作图、亲缘关系和系统分类、遗传多样性的检测和品种
指纹图谱的绘制及非整倍体和属间杂种鉴定等方面［２１］。Ｘｕ等［２２］利用限制性片段长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇ
ｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）遗传图谱上的数量性状基因座（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓ，ＱＴＬｓ）和相关分子的
紧密连锁，通过 ＭＡＳ技术可以提高高羊茅的重要经济性状。但迄今为止，尚未检索到有关高羊茅耐热性ＤＮＡ
分子标记的研究报道。
本研究得到的与高羊茅单株耐热性和越夏性相关的分子标记分别为３５１Ｔ７５０和１３８Ｔ９５０，其在同一基础
群体内不同样本容量的耐热性两极单株组群中，条带的有无与耐热性的强弱的相关性不同。对耐热性处于两极
的２２个构池单株进行扩增验证，结果仅有３５１Ｔ７５０与单株耐热性显著相关，而１３８Ｔ９５０条带虽在不耐热的１１
株中有８２％的吻合度，但与２２株构池单株的耐热性没有显著相关。当增加验证单株数至５８株（３７株耐热＋２１
株不耐热）后，３５１Ｔ７５０和１３８Ｔ９５０标记均与耐热性显著相关。同样的扩增结果，若以耐热性排序的中位数为
分界点进行耐热性分组，即把排序前９６位的单株归类为耐热性弱单株，排序后９７的为耐热性强单株，相关性分
析结果又与２２株基因池内单株的表现相似，以３５１Ｔ７５０与耐热性呈显著相关（χ
２＝９．２１，犘＜０．０５），而１３８
Ｔ９５０与耐热性分组无显著相关（χ
２＝１．０４，犘＞０．０５）。虽然１３８Ｔ９５０标记与单株的耐热性相关随验证群体的
大小不同而有变化，但在与田间１９３株的越夏性相关分析中表现出稳定的显著相关性。两分子标记与耐热性和
越夏性的相关性变化，可能的原因是高羊茅作为异缘六倍体异花授粉植物，比水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）等常规作物的
基因组更为复杂（约比水稻大１４倍），分子标记在与基因组结合的过程中容易出现随机性的不稳定结合，在试验
过程中表现出池间和单株间的多态性不够稳定。前人在对小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）［１５］和紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅
狊犪狋犻狏犪）［２３］等其他多倍体植物的相关分子标记筛选结果也有类似的现象报道。鉴于该两标记在耐热性和越夏性
鉴定的两极组群单株中具有显著相关性，实际应用中可结合单株的热胁迫与夏季胁迫结果，在表型耐热和越夏强
单株中进一步进行该两分子标记的辅助选择，从而提高单株选择准确率，加快育种进程。
许占友等［２４］认为，ＢＳＡ法的成功运用受到２个因素的影响：１）分子标记与目的基因实际距离的远近影响检
测效率；２）构建每个池所选择的植株数量影响检测能力；索广力［１５］指出在构建基因池的时候，还需要考虑所用材
料的基因组的大小，基因组太大如小麦，建池的株数不宜大，否则虚假多态性太高。与已报道的ＢＳＡ法的研究群
体（Ｆ２）不同，本研究以来自于耐热性不同种质资源的单株为分子标记筛选的基础群体，通过人工耐热性鉴定，以
最不耐热和最耐热性的１１个单株构建了耐热和不耐热基因池（拟ＢＳＡ法），通过ＲＡＰＤ和ＩＳＳＲ筛选池间稳定
的多态性分子标记，也成功得到了３５１Ｔ７５０和１３８Ｔ９５０两个与极端耐热和不耐热单株群体显著相关的分子标
记，其中１３８Ｔ９５０与单株在田间的越夏性也存在显著相关，可用于高羊茅耐热和越夏强单株的辅助选择。研究
结果初步表明，这种改进的拟ＢＳＡ法在性状相关分子标记的筛选上是可行的，有效的。为了提高标记的可重复
性和稳定性，进一步的工作是将特异性条带进行回收、测序，并根据测序结果开发特异性更强的测序扩增区段标
记（ＳＣＡＲ），并应用于单株辅助选择。
４　结论
单株或材料的耐热性与越夏性相关程度较低，耐热强单株越夏性不一定强，常绿草坪草品种的选育应以提高
越夏性为育种目标。１３８Ｔ９５０与耐热性和越夏性均显著相关，而３５１Ｔ７５０标记仅与耐热性显著相关，可分别用
于在热胁迫和夏季胁迫后抗性强单株中的进一步筛选，以提高单株选择效率。
３９第２２卷第５期 草业学报２０１３年
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犛犮狉犲犲狀犻狀犵犿狅犾犲犮狌犾犪狉犿犪狉犽犲狉狊犳狅狉犺犲犪狋狋狅犾犲狉犪狀犮犲犪狀犱犻狋狊狉犲犾犪狋犻狅狀
狋狅狊狌犿犿犲狉狋狅犾犲狉犪狀犮犲犻狀狋犪犾犳犲狊犮狌犲狊犻狀犵犾犲狆犾犪狀狋狊
ＣＨＥＮＱｕｎ１，ＹＵＡＮＸｉａｏｊｕｎ２，ＨＥＹａｌｉ１
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＪｉａｏＴｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２４０，Ｃｈｉｎａ；
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犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｂｒｅｅｄｉｎｇｓｙｓｔｅｍｉｎｔａｌｆｅｓｃｕｅ（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪），ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｒｅ
ｌａｔｅｄｔｏｈｅａｔａｎｄｓｕｍｍｅｒｔｏｌｅｒａｎｃｅｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｆｏｒｍａｒｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｉｎｉｔｉａｌｙ，２１６ｓｉｎｇｌｅ
ｐｌａｎｔｓｆｒｏｍ１２ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓｄｉｆｆｅｒｉｎｇｉｎｈｅａｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｗｅｒｅｕｓｅｄａｓａｂａｓｉｃｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｉｒｈｅａｔ
ｓｔｒｅｓｓ（４０℃／３５℃，ｄａｙ／ｎｉｇｈｔ，１２ｈ／１２ｈ）ｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎａｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｌｉｍａｔｅｃｈａｍｂｅｒａｎｄｔｈｅｉｒｓｕｍｍｅｒｓｔｒｅｓｓ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｆｉｅｌｄｓｉｎＳｈａｎｇｈａｉ．ＲａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍＤＮＡ（ＲＡＰＤ）ａｎｄｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）ｗｅｒｅａｓｓｅｓｓｅｄｗｉｔｈｍｏｄｉｆｉｅｄｂｕｌｋｅｄｓｅｇｒｅｇａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＳＡ）ｔｏｓｃｒｅｅｎｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｍａｒｋｅｒｓａｍｏｎｇｔｈｅ８００ＲＡＰＤａｎｄ１００ＩＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓ．Ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｈｅａｔａｎｄｓｕｍｍｅｒｔｏｌｅｒａｎｃｅ
ａｍｏｎｇｓｉｎｇｌｅｐｌａｎｔｓｗａｓｑｕｉｔｅｌｏｗｗｉｔｈｏｎｌｙ３．４％ｏｆｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ；Ｐｒｉｍｅｒ“３５１”ａｍｐｌｉｆｉｅｄａ
７５０ｂｐｂａｎｄ（３５１Ｔ７５０）ｗｈｉｃｈｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｈｅａｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ｗｈｉｌｅ“１３８”ａｍｐｌｉｆｉｅｄａ９５０ｂｐｂａｎｄ
ｒｅｌａｔｅｄｔｏｂｏｔｈｈｅａｔａｎｄｓｕｍｍｅｒｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｈｅａｔａｎｄｓｕｍｍｅｒｔｏｌｅｒａｎｔｓｉｎｇｌｅｐｌａｎｔｓｓｈｏｕｌｄｂｅｓｃｒｅｅｎｅｄｕｎｄｅｒ
ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｈｅａｔａｎｄｎａｔｕｒａｌｓｕｍｍｅｒｓｔｒｅｓｓｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｂａｎｄ３５１Ｔ７５０ｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｏｎｌｙｆｏｒｈｅａｔｔｏｌｅｒａｎｔ
ｐｌａｎｔｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｌｅ１３８Ｔ９５０ｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｆｏｒｂｏｔｈｈｅａｔａｎｄ／ｏｒｓｕｍｍｅｒｔｏｌｅｒａｎｔｐｌａｎｔｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｔａｌｆｅｓｃｕｅ；ｈｅａｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ｓｕｍｍｅｒｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）；ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉ
ｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍＤＮＡ（ＲＡＰＤ）；ｍｏｄｉｆｉｅｄｂｕｌｋｅｄｓｅｇｒｅｇａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＳＡ
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５９第２２卷第５期 草业学报２０１３年