全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月 445
黄体素和 β-胡萝卜素清除超氧阴离子和羟自由基能力的比较
黄红英 1,2，邓斌 2，苏丽娟 1，何笃贵 2，彭长连 1,*
1华南师范大学生命科学学院，广东省高等学校生态与环境科学重点实验室，广州 510631；2湘南学院化学与生命科学
系，湖南郴州 423000
提要：利用抑制邻苯三酚自氧化法和番红花红漂白法分别检测离体条件下黄体素和β-胡萝卜素(从紫苜蓿叶片中提取的)
对超氧阴离子(O2－· )、羟自由基(·OH)清除作用的结果表明：黄体素清除 O2－· 能力为 β-胡萝卜素的 2.78倍，清除 ·OH-的能
力是 β-胡萝卜素的 3.46倍。
关键词：黄体素；β -胡萝卜素；活性氧；抗氧化剂
Comparison on Capacities of Scavenging for O2·¯ and ·OH by Lutein and β-
Carotene
HUANG Hong-Ying1,2, DENG Bin2, SU Li-Juan1, HE Du-Gui2, PENG Chang-Lian1,*
1Key Laboratory of Ecology and Environmental Science in Guangdong Higher Education, College of Life Sciences, South China
Normal University, Guangzhou 510631, China; 2Department of Chemistry and Life Science, Xiangnan College, Chenzhou, Hunan
423000, China
Abstract: Capabilities of scavenging for O2·¯ and ·OH by lutein and β-carotene (from the leaves of Medicago
sativa L.) were determined by the inhibition of pyrogallol auto-oxidation and monitoring the bleaching of
safranine T by hydroxyl radical generated from the Fenton reaction in vitro, respectively. The results indicated
that the capacity of scavenging for O2·¯ by lutein was 2.78 times of that by β-carotene. The capacity of scaveng-
ing for ·OH by lutein was 3.46 times of that by β-carotene.
Key words: lutein; β-carotene; reactive oxygen species (ROS); antioxidative substances
收稿 2008-02-03 修定 2008-03-28
资助 国家自然科学基金(30 7 70 1 7 3)。
* 通讯作者(E-mai l：pengchl@scib .ac .cn；Tel：0 20 -
8 5 2 1 7 6 1 2 )。
类胡萝卜素(carotenoid)是一类具有多个共扼
双键的萜烯基团类化合物，广泛分布于绿藻和高
等植物中，根据其结构差别可区分为胡萝卜素类
和叶黄素类(xanthophyl)。前者仅由 C和H原子组
成，后者至少含 1个氧原子，是 α-和 β-胡萝卜
素的氧化衍生物。类胡萝卜素作为光合作用的辅
助色素，参与光能的吸收与传递，同时也能清除
光合电子传递过程中产生的活性氧自由基，防止
光合器官的氧化损伤。绿藻和高等植物中类胡萝
卜素主要是黄体素、β-胡萝卜素、紫黄质和新黄
质，以黄体素含量为最多，占类胡萝卜素总量的
50%以上(Pogson等 1998)，且是藻类和高等植物
进化中保守的组分。黄体素[(3R, 3R)-β,ε-caro-
tene-3,3-diol]是玉米黄质的一种同分异构体，分
子式为 C40H56O2，链末端含有羟基基团。可通过
环氧化黄体素循环耗散过剩激发能(Goss 2003)，
亦可直接或间接介导非光化学猝灭(NPQ)的快速诱
导，耗散过量激发能，防止叶绿体受光氧化伤害
(Niyogi等 1997)。而 β-胡萝卜素则是类胡萝卜素
家族的另一个重要成员，分子式为 C40H56，是目
前公认的一种有效的抗氧化剂，能清除活性氧自
由基。本文以从紫苜蓿叶片中提取的黄体素为材
料，用化学方法检测离体条件下黄体素对O2－· 及
·OH的清除作用，并对其与β-胡萝卜对O2－· 及 ·OH
的清除能力进行了比较，为进一步阐明黄体素的
光保护作用和抗光氧化特性提供新的参考。
材料与方法
紫外可见分光光度计为美国Perkin Elmer有限
公司产品，β-胡萝卜素(β-carotene)和黄体素[从紫
苜蓿(Medicago sativa L.)叶片中提取]为 Sigma公
司产品。邻苯三酚和番红花红为国产产品。
超氧阴离子自由基的生成与清除的测定为，
取 4.5 mL 0.05 mol·L-1、pH 8.2的 Tris-HCl缓冲溶
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液于试管中，置 25 ℃水浴中预热 20 min，加入
样品 0.1 mL (分别含 50 µg的黄体素和 β-胡萝卜
素，分 2组测定)，0.4 mL 2.5 mmol·L-1邻苯三
酚，混匀后在 25 ℃水浴中准确反应 4 min，立
即用 8 mol·L-1的盐酸 2滴中止反应，并测定波长
200~400 nm处的吸收光谱(以蒸馏水调零)。分别
在上述反应系统中加入 25、50、75和 100 µg的
黄体素或 β-胡萝卜素，测定波长 299 nm处的吸
光值，空白组以 0.1 mL蒸馏水代替样品，并按
“清除率 =[(A空白 -A 样品)/A空白]×100%”公式计算
黄体素或β-胡萝卜素对超氧阴离子自由基清除率。
羟自由基的生成及清除率的测定根据 Fenton
反应原理，参考 Schweikert等(2000)的方法略作
修改。用亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基，
以反应产生的羟自由基可促使番红花红褪色。取
1 mL 0.15 mol·L-1、pH 7.4的磷酸缓冲液，1 mL
40 µg·mL-1番红花红，样品 0.5 mL (分别含 50 µg
的黄体素和β-胡萝卜素，分 2组测定)，1 mL 1.3%
过氧化氢(新鲜配制)，1 mL 0.95 mmol·L-1 EDTA-
FeII (新鲜配制)，混合后在 30 ℃水浴中反应 30
min后，测定波长 400~800 nm处的吸收光谱(以
蒸馏水调零)。从番红花红的吸收光谱中可知其吸
收峰在波长 550 nm处。分别在上述反应系统中加
入 25、50、75和 100 µg的黄体素或 β-胡萝卜素，
在波长 550 nm处测吸收度 A样品。空白以 0.5 mL
蒸馏水代替药品，对照以 1 . 5 mL 蒸馏水代替
EDTA-FeII和样品，并按“清除率 =｛[(A 对照 -
A空白)-(A对照 -A样品)]/(A对照 -A空白)｝×100%”公式
计算清除率 。
实验结果
1 黄体素清除超氧阴离子自由基(O2－· )的作用
在碱性条件下邻苯三酚发生自氧化反应产生
O2－· ，同时生成有色物质红碚酚，根据测定反应
生成红碚酚的量就可以确定产生的O2－· 量。吸收光
谱的结果显示邻苯三酚发生自氧化反应 4 min后，
其中间产物在波长 299 nm处有一个明显的吸收峰
(图 1)。当在邻苯三酚反应体系中分别加入 50 µg
的黄体素或 β-胡萝卜素后，由于它们都属于抗氧
化类物质，能清除 O2－· ，从而阻止中间产物的积
累，波长 299 nm的吸收峰降低(图 1)。同等含量
的黄体素比 β-胡萝卜素抑制邻苯三酚自氧化生成
中间产物能力强，显示其清除 O2－· 的能力高于 β-
胡萝卜素。
进一步加入不同含量的黄体素或β-胡萝卜素
到邻苯三酚自氧化系统中，计算其对 O2－· 的清除
率。以清除率为纵坐标，抗氧化剂含量为横坐标
作图，可得到清除率与不同抗氧化剂含量的相关
图(图 2)。无论是黄体素还是 β-胡萝卜素，其清
除率与含量呈显著直线相关，相关系数 r分别为
0.972和 0.973，直线的斜率就表示单位含量抗氧
化剂的清除O2－· 能力，黄体素清除O2－· 能力明显较
β-胡萝卜素高，为 β- 胡萝卜素的 2.78倍。
图 1 黄体素和 β-胡萝卜素抑制邻苯三酚自氧化吸收光谱
Fig.1 Absorption spectrums of inhibition of pyrogallol auto-
oxidation by lutein and β-carotene
图 2 不同含量黄体素和 β-胡萝卜素与其超氧阴离子
清除率的关系
Fig.2 Plot of the capacity for scavenging superoxide radical
with different contents of lutein and β-carotene
2 黄体素清除羟自由基(·OH)的作用
番红花红在波长 550 nm处有最大吸收(图 3)，
这与王巨存等(1994)报导的用番红花红漂白法在波
长 520 nm处测定羟自由基(·OH)的方法不同。由
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于已有的报道中没有测定番红花红的吸收光谱，
所以是否由于药品的原因引起的吸收峰不同还不清
楚，然而，在本文条件下用番红花红漂白法测定
羟自由基(·OH)应该测定 550 nm处的吸光值。图
3中的对照为番红花红吸收光谱，图中的曲线3为
番红花红溶液加入 Fenton反应液后作用的光谱。
这些结果显示 Fenton反应产生的 ·OH可以漂白番
红花红，导致番红花红溶液褪色，波长 550 nm
的吸光度显著下降。此时分别加入 50 µg的黄体
素或 50 µg的 β-胡萝卜素抗氧化剂，由于抗氧化
剂可以及时清除 Fenton反应产生的羟自由基，抑
制番红花红的漂白，使波长 550 nm处吸光度降低
程度减弱，抑制漂白的能力更加增强，这说明其
清除 ·OH能力也增强。同等含量的黄体素抑制番
红花红漂白的能力明显强于 β-胡萝卜素，显示其
清除 ·OH能力也很强。
进一步加入不同含量的黄体素或β-胡萝卜素
(25、50和 75 µg)抑制 ·OH对番红花红的漂白，并
计算其清除率。以清除率为纵坐标，不同含量的
抗氧化剂为横坐标作图也能得到很好的直线关系图
(图 4)，相关系数 r分别为 0.995和 0.991，直线
的斜率就表示单位含量抗氧化剂的清除O2－· 能力，
黄体素清除 ·OH能力远高于β-胡萝卜素，为β-胡
萝卜素的 3.46倍。
讨　　论
一些体外模式系统的研究中已初步证明黄体
素具有猝灭单线态氧(1O2)和清除自由基的抗氧化
的功能。Iannone等(1998)用电子自旋波谱技术首
次证明黄体素可清除过氧自由基(ROO·和 RSO2·)，
防止脂质过氧化。Mortensen等(1997)以脂质体为
模式系统利用脉冲辐射作用研究几种类胡萝卜素，
包括茄红素、玉米黄质、黄体素和虾青素等清除
NO2·、RS·和 RSO2·的速率及其作用机制。他们
的结果表明：这几种类胡萝卜素皆具有清除上述
3种自由基的功能，其清除作用的顺序是NO2·＞
RS·＞ RSO2·。但植物中黄体素对 ·OH和O2－· 的清
除作用未见报道。我们的实验结果表明：在离体
条件下黄体素作为抗氧化剂能直接清除活性氧。
从黄体素和 β-胡萝卜素对活性氧的清除率来看，
黄体素的清除O2－· 为 β-胡萝卜素的 2.78倍，清除
·OH是 β-胡萝卜素的 3.46倍。黄体素清除能力强
于 β-胡萝卜素，可能与它们的分子结构不同有直
接的关系。一方面，根据 Pogson等(1998)的报
道，与 β-胡萝卜素分子两端各有一个 β-碳环不
同，黄体素分子结构的两端分别是一个带有羟基
的 β-环和 ε-环，其 β-环上的羟基能与环上的碳
碳双键形成 P-π共轭效应，表现出烯醇式活泼羟
基的性质，因而具有较强的酸性，脱氢作用容
易，与 ·OH、O2－· 等活性自由基结合的能力也强
(Husain等 1987)，抗氧化性好；另一方面，黄
体素分子中的氧原子由于电负性较强，对共轭长
链上的碳原子表现出强的吸电子作用，致使直链
不饱和键更加容易打开，从而增强分子与自由基
的结合能力。上述两方面的共同作用，可能是黄
体素清除 ·OH和O2－· 自由基能力比β-胡萝卜素强的
原因。事实上，这一现象也与不饱和醇的化学活
图 4 不同含量黄体素和 β- 胡萝卜素与其羟自由基
清除率的关系
Fig.4 Plot of the capacity for scavenging hydroxyl radicals
with different contents of lutein and β-carotene
图 3 黄体素和 β-胡萝卜素抑制 ·OH漂白番红花红的
吸收光谱
Fig.3 Absorption spectrums of inhibition of bleaching of
safranine T from ·OH by lutein and β-carotene
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性比不饱和烃强相类似，而不饱和醇的抗氧化能
力又与其分子中所含羟基的数量和结构有关(陈琪
等 2003)，即分子中羟基数目越多，抗氧化能力
越强；羟基能与不饱和碳链形成共扼效应的分子
较不能形成共扼效应的强。此外，Zhao和 Zou
(2002)研究小麦的光合作用的结果也表明，羟基
的数目和位置可直接影响它们的抗氧化活性。
近年来不少研究证明：黄体素与它的同分异
构体玉米黄质一样可直接或间接介导非光化学猝灭
(NPQ)，耗散过量吸收的光能，从而防止叶绿体
受光氧化伤害(Niyogi等 1997)。非光化学猝灭
(NPQ)与黄体素含量有较大相关性(r=0.87) (Eggink
等 2001)。彭长连和林桂珠(2003)亦认为黄体素可
能以某种方式参与非光化学猝灭(NPQ)的形成。
Matsubara等(2003)提出：植物中存在一个新的与
热耗散有关的环氧化黄体素 -黄体素循环，植物
可能是通过环氧化黄体素-黄体素循环作为叶黄素
循环的补充，耗散过剩激发能而起光保护功能
的。一般来说，植物中的 ·OH都是在极端的逆境
条件下产生的(van Breusegem等 2001)，因此认
为，黄体素可能对植物在极端逆境条件下清除
·OH和 O2－· ，从而实现光保护作用功能的。这个
结论也可以用以解释低温高光的极端条件下，拟
南芥核基因突变体 lut2比 npq1对逆境损伤具有更
高的敏感性的原因(Peng和Gilmore 2003)。
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