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植物抗真菌蛋白的抗菌机制



全 文 :植物生理学通讯 第 44卷 第 5期,2008年 10月 989
植物抗真菌蛋白的抗菌机制
郑灿伟 1,2, 宾金华 1,*
1华南师范大学生命科学学院, 广东省植物发育生物工程重点实验室, 广州 510631; 2广东广雅中学, 广州 510160
Action Mechanism of Antifungal Proteins Derived from Plants
ZHENG Can-Wei1,2, BIN Jin-Hua1,*
1Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Sciences, South China Normal
University, Guangzhou 510631, China; 2Guangya High School of Guangdong, Guangzhou 510160, China
提要: 文章就植物抗菌蛋白抑制真菌生理代谢、降解细胞壁聚合体、改变细胞膜通透性和形成穿膜小孔、破坏细胞的核
糖体和降解细胞中的核酸机制的研究进展作介绍。
关键词: 植物; 抗菌蛋白; 抗菌机制
收稿 2008-04-07 修定 2008-09-04
资助 国家自然科学基金(30671338)和广东省自然科学基金
( 3 1 5 3 1 )。
* 通讯作者 ( E-ma i l : b i n j h@ sc nu . ed u . cn ; T e l : 0 2 0 -
8 52 11 37 5 -8 03 3)。
植物在其生长过程中常常受到各种真菌的侵
害。据报告, 已知真菌大约有 100 000种, 其中侵
害植物的种类不超过 10% (Knogge 1996), 却引起
80%以上的植物病害(张福丽等2006), 造成世界粮
食作物减产约 20% (Knight等1997)。另一方面, 真
菌在侵染植物的过程中, 释放出来的代谢产物——
真菌毒素(mycotoxins), 对农作物以及人类的健康也
造成极大的危害(Bennett和Klich 2003)。黄曲霉毒
素(aflatoxin)就是由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄
生曲霉(Aspergillus parasiticu)产生的一种特剧毒性
的真菌毒素, 其毒性比砒霜大68倍, 比氰化钾大10
倍; 它同时还是目前发现的最强的致癌物质, 它主
要诱使动物发生肝癌(Henry等 1999)。
面对众多真菌的威胁, 植物并不是束手无策, 植
物含有较多的蛋白质, 特别是在种子中, 一些蛋白
质已证明具有抗真菌的作用 , 称为抗菌蛋白
(antifungal protein, AFP), 如蛋白酶抑制剂(protease
inhibitor, PI)、几丁质酶、葡聚糖酶、核糖体失
活蛋白(ribosome-inactivating protein, RIP)等, 有些
抗菌蛋白是植物本身所固有的, 有些则是在植物发
生系统获得抗性过程中产生的, 这类蛋白称之为病
程相关蛋白(pathogenesis-related protein, PR), 到目
前为止所发现的病程相关蛋白有 17种。
除了抗菌蛋白以外, 植物中还有一些具有抗菌
活性的小分子量蛋白类物质, 称为抗菌肽(antifungal
peptides), 如防御素、硫堇等。人们通常把氨基
酸含量在 50个以下、分子量小于 5 kDa的多肽称
为抗菌肽; 而把氨基酸含量在 50个以上、分子量
大于 5 kDa的称为抗菌蛋白。植物在与病原真菌
长期斗争过程中所形成的抗菌蛋白或抗菌肽种类非
常多, 迄今发现的就有好几百种, 而且种类还不断
地增加。本文中着重介绍植物的抗菌蛋白是如何
起抑菌作用的。
1 抑制真菌的生理代谢
植物病原菌在侵染植物过程中, 分泌多种酶分
解植物细胞, 以获得生长和繁殖所需的碳源和氨基
酸。植物则通过其体内多种酶抑制剂抑制这些酶
的活性, 以阻止病原菌降解植物细胞, 病原菌也因
营养不足而生长、增殖、侵染和扩展受阻, 因此
抗病力增强。
蛋白酶抑制剂分为两类: 丝氨酸蛋白酶(如胰蛋
白酶、胰凝乳蛋白酶)抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑
制剂。从玉米中纯化出来的一个分子量为 14 kDa
的胰蛋白抑制剂(trypsin inhibitor, TI)能破裂黄曲霉
孢子和抑制黄曲霉菌丝的生长, 以致菌丝变得粗短
(Chen等 1998)。通过基因重组, 过表达这种 TI后,
其重组蛋白能抑制多种植物病源真菌的生长, 表明
TI是植物抵抗多种病源真菌侵染的物质(Chen等
1999a)。这种TI能通过抑制胞外α-淀粉酶的活性
专题介绍 Special Topics
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期,2008年 10月990
而削弱黄曲霉对糖类的利用(Chen等 1999b)。花
生在栽培过程中和收获后都容易受到黄曲霉侵染,
PI可以抑制黄曲霉的生长(宾金华等2000), 表明PI
是花生抵抗黄曲霉侵染的物质。
除了蛋白酶抑制剂外, 有些凝集素活性的抗菌
蛋白也具有酶抑制剂活性。AILP (α-amylase in-
hibitor from Lablab purpureus)是分离自扁豆(Lablab
purpureus)的一种分子量为 36 kDa的 α-淀粉酶竞
争性抑制剂, 这种蛋白抑制几种真菌 α-淀粉酶活
性, 但对动物和植物的α-淀粉酶则几乎不起作用。
抑菌实验表明, AILP抑制黄曲霉孢子萌发和菌丝生
长。这种AILP不具有胰蛋白酶抑制剂活性, 却表
现出凝集素活性, 氨基酸序列分析表明, AILP与豆
科中的凝集素 -表壳蛋白 -α-淀粉酶抑制剂(lectin-
arcelin-α-amylase inhibitor)家族的凝集素相似, 是植
物抵抗病虫害的一种物质(Fakhoury和Woloshuk
2001)。
除此之外, 一些蛋白酶抑制剂同时还具有抑制
肿瘤和人类免疫系统缺陷病毒(human immunodefi-
ciency virus, HIV)的能力。从花生中纯化出来的一
种与凝集素类似的抗菌蛋白, 不仅能抑制HIV-1逆
转录酶的活性, 还能抑制与HIV侵染过程相关的一
些酶的活性(Ye等 2001)。从蚕豆(Vicia faba)中分
离出的一种分子量为 13 kDa的胰凝乳蛋白酶抑制
剂, 不仅对花生球腔菌(Mycosphaerella arachidicola)
和梨轮纹病菌(Physalospora piricola)有抑制作用, 而
且可以激发小鼠脾脏细胞的促有丝分裂反应, 抑制
HIV-1逆转录酶的活性(Ye和Ng 2002b)。
植物中蛋白酶抑制剂的作用机制尚需要进一
步探讨, 有些蛋白酶抑制剂的抑菌作用与其浓度有
关, 如低浓度的TI能抑制黄曲霉α-淀粉酶的分泌,
高浓度(200 µg·mL-1)的 TI反而能促进其分泌(Chen
等 1999b)。除此之外, 单纯通过抑制一种酶活性
似乎并不能完全起到抑菌作用, 如低浓度的TI在抑
制α-淀粉酶的同时也促进了黄曲霉的另一种代谢
酶——淀粉葡萄糖苷酶的活性(Chen等1999b), 单
一的蛋白酶抑制剂并不能完全抑制真菌全部的生理
代谢活动, 因此推测蛋白酶抑制剂通过与其它抗菌
蛋白的相协调而发挥抑菌作用。
2 降解真菌细胞壁聚合体
真菌细胞壁位于真菌最外围一层, 大约占真菌
干重的20%~30%, 不仅维持真菌细胞的形态, 免受
外界的物理伤害, 同时还在生殖、黏着和疏水性起
作用。与植物细胞壁不同, 真菌细胞壁主要由三种
不同的多聚糖组成, 即几丁质、β-(1,3)葡聚糖和
β-(1,6)葡聚糖。许多抗菌蛋白就是以真菌细胞壁
中的不同成分作为其作用靶点, 通过破坏真菌细胞
壁以此抵抗病原真菌的侵染。
2.1 几丁质结合蛋白 几丁质结合蛋白(chitin-bind-
ing protein, CBP)是一种可以通过与新生几丁质结合
而影响真菌生长的蛋白质, 植物中的PR-4蛋白属于
几丁质结合蛋白, 分子量在 13~14.5 kDa之间。几
丁质结合蛋白分为两个亚类, 其中 I类是蛋白的N
端几丁质结合域(chitin-binding domain, CBD)与
hevein (一种几丁质结合多肽)的氨基酸序列非常相
似, 是几丁质结合凝集素的超家族。II类是蛋白缺
乏与 hevein相似的结构域。虽然在植物中并未发
现几丁质, 但却存在几丁质结合蛋白, 由于大部分
真菌的细胞壁和许多无脊椎动物包括线虫和昆虫外
壳中均含有几丁质, 因此普遍认为几丁质结合蛋白
是植物防御体系中的一部分。
几丁质结合蛋白之所以能抑制真菌的生长则
在于它们与真菌细胞壁几丁质的结合能力。真菌
生长的同时常伴随着菌丝细胞壁的组装, 其几丁质
暴露在外面, 容易为几丁质结合蛋白结合。真菌细
胞的极性是生长所必需的, 抗菌蛋白可以结合到萌
发中的孢子表面和生长着的菌丝的顶端——表明
其抗菌活性是抗菌蛋白与真菌细胞壁几丁质结合的
结果, 因此细胞极性受到破坏, 造成孢子和菌丝的
涨大以及出现不规则的菌丝分支, 从而抑制真菌细
胞的生长(Bormann等 1999)。
有些凝集素抗菌蛋白也具有与几丁质结合的
能力。天麻抗真菌蛋白(gastrodia antifungal protein,
GAFP)是从天麻(Gastrodia elata)中纯化出来的一种
分子量为 10 kDa抗菌蛋白, 能抑制多种真菌菌丝
的生长, N端氨基酸序列分析表明, GAFP属于凝
集素的一类, 但不能引起经胰岛素处理过的兔红细
胞凝集(Xu等 1998)。经荧光试剂 FITC标记的
GAFP蛋白处理绿色木霉菌(Trichoderma virid), 其
菌丝周围有荧光出现, 以菌丝横隔和菌丝顶端较强,
表明GAFP对木霉的作用位点在菌丝的细胞壁上;
而经GAFP处理后的孢子并未观察到明显的荧光,
这可能是未萌发时的胞子还处于休眠封闭状态, 其
胞壁结构和成分很少变化所致(徐荣华和刘小烛
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期,2008年 10月 991
2003)。由于GAFP并不具有几丁质酶和 β-(1,3)葡
聚糖苷酶活性, 但却有结合甘露糖、N-乙酰葡萄
糖胺和几丁质能力(Xu等1998), 于是推测它是通过
结合细胞壁上的多种结构物质(如几丁质等), 引起
细胞壁极性的改变而起抗菌作用的。
2.2 几丁质酶 尽管植物并不含有几丁质, 但几丁质
酶是在高等植物中普遍存在的, 它分为 I~V型, 大
部分属于植物的 PR-3蛋白, 分子量在 26~43 kDa
之间。几丁质酶先将几丁质水解为寡聚糖, 然后再
进一步水解为N-乙酰氨基葡萄糖, 破坏真菌细胞壁
的结构完整, 从而抑制一些真菌孢子的萌发和菌丝
生长, 因此一直被看作是植物抗真菌病害的潜在物
质。几丁质酶会促使真菌细胞壁变得脆弱, 随后引
起细胞溶解(Sela-Buurlage等 1993), 而有些植物则
通过胞外分泌的几丁质酶将残留在植物细胞间的真
菌杀死(Sela-Buurlage等1993; Zareie等2002), 表明胞
外分泌的抗菌蛋白也是植物抵抗真菌的一条途径。
催化几丁质水解能力并不是几丁质酶发挥抗
菌作用所必需的。烟草中 I型几丁质酶的N端有
一个富含Cys的几丁质结合域, 其催化能力比缺少
此种结合域的突变蛋白高出许多; 虽然此种结合域
在抗菌作用中并不是必需的, 但在有几丁质结合域
时, 抑菌活性可提高 3倍(Iseli等 1993), 由于几丁
质是不溶的, 所以具有几丁质结合域的几丁质酶都
能吸附在几丁质上, 因而其在局部的底物浓度增高,
几丁质与酶催化中心之间的距离拉近, 进而其分解
真菌细胞壁的能力提高。栗子富含一种 I型几丁
质内切酶, 有研究表明, Glu122和Glu144是其催化
作用的2个氨基酸, 并且Glu173、Thr175和Asn144
的突变也对酶活性有影响; 但缺少几丁质分解活性
的突变几丁质酶却和野生的几丁质酶一样也有抑菌
活性(Garcia-Casado等1998), 这表明它并不是通过
水解活性, 而是N端的几丁质结合域直接干扰真菌
菌丝顶端几丁质的合成和分解起作用的。由此可
以看出, 几丁质酶可以通过与几丁质结合而起到抑
制菌活性的作用。
从菜豆(Phaseolus vulgaris)中分离出一种几丁
质酶 Phaseins A (28 kDa)和一种新的抗菌蛋白
Phaseins B (32 kDa), 这两种蛋白可以抑制HIV逆
转录酶活性, 还能引起鼠类巨嗜细胞亚硝酸盐的分
泌增强(Ye等 2002a), 由于一些有活性的氮的中间
产物(如亚硝酸盐)能抑制肿瘤细胞呼吸的作用, 因
此认为, 这两种抗菌蛋白具有潜在的抗癌作用。
2.3 葡聚糖酶 葡聚糖是真菌细胞壁的第 2种组成
成分。除了 β-(1,3)葡聚糖这种基本葡聚糖以外,
还发现有 α-(1,3)、β-(1,4)和 β-(1,6)等连接方式,
因此认为可以水解不同葡聚糖的葡聚糖酶有潜在的
抗菌能力。植物体内的PR-2蛋白具有β-(1,3)葡聚
糖酶活性, 其分子量约为33或36 kDa, 其作用机制
有直接和间接作用两个方面。
(1)直接抑菌作用: β-(1,3)葡聚糖酶可以由病
原或植物信号因子(如乙烯或水杨酸等)诱导产生, 经
过一系列的反应后, 植物β-(1,3)葡聚糖酶(包括胞内
积累的碱性类型和胞间积累的酸性类型)大量合成
β-(1,3)葡聚糖酶。同几丁质酶一样, β-(1,3)葡聚糖
酶通过水解真菌细胞壁中的β-(1,3)葡聚糖结构, 特
别是作用于葡聚糖中暴露比较薄弱的菌丝体顶端,
从而导致脆弱细胞的裂解和死亡(Selitrennikoff
2001)。另外, 几丁质酶可以协同其效应, 共同水
解葡聚糖和几丁质。葡聚糖酶与几丁质酶可协同
抑菌的原因可能是这两种酶都可水解真菌菌丝, β-
(1,3)葡聚糖苷酶可水解真菌菌丝外围的葡聚糖成
分, 而将菌丝内部的几丁质暴露出来, 因而几丁质
酶更容易作用于菌丝, 抑制真菌的作用于是增强所
致。
(2)间接抑菌作用: β-(1,3)葡聚糖酶在降解病
原物细胞壁的同时, 其释放出来的寡糖还能作为植
物多种抗病反应(如过敏反应)的激发子, 诱导植物
的全面抗病反应(Klarzynski等 2000)。
除了β-(1,3)葡聚糖酶之外, 有些植物中还有β-
(1,6)葡聚糖酶、α-(1,3) 葡聚糖酶和 β-(1,3)葡聚糖
结合蛋白, 它们都是通过与真菌细胞壁葡聚糖相互
作用而起抗菌作用的(Theis和 Stahl 2004)。
3 影响细胞膜通透性和穿膜小孔的形成
细胞质膜是真菌的一道重要屏障, 在细胞生理
代谢、物质运输、信号传递、DNA复制中发挥
作用。绝大多种抗菌蛋白均以细胞膜为作用靶点,
破坏真菌细胞膜的结构, 包括改变真菌细胞膜的通
透性, 或形成穿膜小孔, 引起了胞内水溶性物质大
量渗出, 从而最终导致真菌细胞死亡。
植物中的作用于细胞膜的PR-5蛋白是一种类
甜味蛋白(thaumatin-like protein, TLP), 其分子量大
约 22 kDa。玉米中 22 kDa 的 PR-5 抗菌蛋白
Zeamatin可以导致真菌细胞液的外流, 于是细胞很
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期,2008年 10月992
快裂解, 这种裂解通常发生在细胞的尖端区域, 推
测其机制与一些植物的抗菌肽(如防御素等)相似, 它
直接插入细胞膜中, 引起细胞膜穿孔从而导致细胞
破裂(Roberts和 Selitrennikoff 1990)。但晶体结构
的研究表明, Zeamatin并不是形成穿膜小孔, 而是
引起菌丝近端的静电作用的改变导致细胞内水分和
离子的外流(Batalia等 1996)。来源于烟草的一种
PR-5蛋白——渗透蛋白(osmotin)不仅能引起一些
病原真菌孢子的溶解和抑制孢子萌发, 还能降低菌
丝的活力, 其抑菌效果与渗透蛋白引起真菌细胞膜
pH梯度的消失有关(Abada等 1996)。亚麻种子中
一种分子量为25 kDa的PR-5蛋白Linusitin能改变
细胞膜通透性, 其作用机理是通过膜上形成四聚体
蛋白而引起细胞内溶物的外流; 通过增加其负电荷
的磷脂和醇类的含量或者降低内容物的pH而增强
Linusitin的作用效果(Anzlovar等 1998)。后来又有
研究表明, PR-5蛋白的作用与真菌G蛋白介导的信
号通路有关, G蛋白可以影响细胞壁的多孔性和几
丁质的沉淀进而影响 PR-5蛋白的活性(Coca 等
2000)。同时, 质壁分离后的真菌对渗透蛋白也变
得不敏感, 这表明与真菌细胞壁的相互作用仍是渗
透蛋白发挥抑菌作用的一个重要环节(Abada 等
1996); 其后的研究表明, 一些类甜味蛋白可以与细
胞壁上的 β-(1,3)葡聚糖和甘露糖所结合(Trudel等
1998; Ibeas等 2000)。一些无机离子可以调节渗透
蛋白活性, Ca2+通过促进渗透蛋白与细胞表面的结
合而调节其抗菌活性, 这一过程对细胞表面的甘露
糖磷酸是依赖的; 而K+通过竞争性结合到细胞表面
的甘露糖磷酸而阻断这种作用; 渗透蛋白同时还是
一个 Ca2+结合蛋白, 这种结合对 pH和蛋白本身的
酸性区域是依赖的(Salzman等 2004)。因此, 认为
植物中PR-5蛋白的抑菌机制首先是与真菌细胞壁
上的β-(1,3)葡聚糖和甘露糖结合, 而后插入到细胞
膜中, 通过与细胞膜的相互作用改变细胞膜的通透
性, 从而抑制真菌的生长。此外, 从皇帝蕉中分离
出来的一个分子量为 20 kDa的类甜味蛋白不仅能
抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和花生球腔
菌的生长, 而且对HIV-1逆转录酶也有抑制作用(Ho
等 2007)。
2S清蛋白是种子中一种小分子量的富含谷氨
酰胺的储藏蛋白, 油菜和萝卜种子的2S蛋白均有抑
制真菌生长的作用, 电镜和K+外流测定表明, 其作
用机制与硫素(一种抗菌肽)相似, 它依靠增加细胞
膜的透性而抑制真菌的生长(Terras等 1993)。从
大果西番莲(Passiflora quadrangularis)中分离得到
的2S清蛋白同源的蛋白Pf1和Pf2可以抑制啤酒酵
母(Saccharomyces cerevisiae)的生长, 从而影响细胞
膜的通透性, 并引起真菌表型、细胞壁、芽孢、
内部细胞器的改变(Agizzio等 2007)。
磷脂转运蛋白(lipid-transfer protein, LTP)是一
种小分子量(约 8.7 kDa)的蛋白, 约含 90个氨基酸,
其有一个由4个二硫键固定的中央隧道状疏水蛋白
区域, 在细胞膜间有转运磷脂的功能。Ha-AP10是
一种磷脂转运蛋白, 它通过改变细胞膜的通透性来
杀死真菌, 致死效应与其剂量呈相关性, 这是最早
证明磷脂转运蛋白具有细胞毒性作用的工作, 也是
合理解释LTP能可直接抑制真菌生长的实验依据;
磷脂转运蛋白的细胞毒性并不伤害植物细胞本身,
说明磷脂转运蛋白靶分子仅存在于真菌细胞膜上
(Regente等 2005)。
抗菌蛋白与真菌细胞膜相互作用与其自身结
构有关, PaAMP是一种从美洲商陆(Phytolacca
americana)中分离得到的抗菌蛋白, 定点突变体和
GFP-PaAMP融合蛋白的研究表明, PaAMP通过疏
水表面与真菌细胞膜的相互作用而发挥抗菌活性功
能(Peng等 2005)。除此以外, 一些以细胞内靶目
标为作用位点的抗菌蛋白必然要穿过细胞壁和细胞
膜进入细胞内, 这就涉及到抗菌蛋白与细胞避和细
胞膜之间的相互作用, 因此, 很难分清楚一些与细
胞壁或细胞膜相互作用的抗菌蛋白究竟是以细胞壁
或细胞膜为作用位点, 还是以细胞内的靶目标为作
用位点。过去有些报道认为是与细胞膜相互作用
的抗菌蛋白, 后来又发现其作用靶点在细胞内(Theis
和 Stahl 2004)。另外, 不以细胞膜为作用靶点的
抗菌蛋白, 它在引起真菌细胞死亡的同时还会引起
细胞膜的通透性改变(Chadha和Das 2006)。
4 破坏细胞的核糖体
核糖体失活蛋白(RIP)是一种以细胞内的物质
为作用靶点的抗菌蛋白, 它通过破坏核糖体的功能
而抑制蛋白质的生物合成, 其在植物中广泛存在。
RIP分为 3类: 单链的 1型RIP、双链的 2型RIP和
小分子的 3型 RIP; 其作用方式有 2种: RNA水解
酶型和 RN A N - 糖苷酶型, 作用位点都是 28 S
rRNA。
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期,2008年 10月 993
RNA水解酶型: RIP专一水解 28S rRNA第
G4325~A4326位间的磷酸二酯键, 在 28S rRNA的
3 C端切下一个长约 500个核苷酸片段, 因而核糖
体失活, 蛋白质合成受抑制(Endo和Wool 1982), 这
类 RNA水解酶型 RIP一般只见于真菌曲霉属。
RNA N-糖苷酶型: 植物中的RIP主要属于N-
糖苷酶型, 其专一水解真核细胞核糖体 28S rRNA
第A4324位腺苷酸的N-C键, 释放出一个腺嘌呤碱
基(Endo等 1988), 因此它使其不能结合延长因子,
从而阻止蛋白的合成, 造成靶细胞由于缺少必要的
蛋白而死亡。随着 RIP研究的深入, 人们发现 RIP
不仅能从核糖体RNA的第A4324 位上释放腺嘌呤,
而且能从核糖体RNA的多个位点和从不同来源的
RNA或DNA核酸分子上释放腺嘌呤, 称为RIP的
多核苷酸: 腺苷糖苷酶(polynucleotide: adenosine
glycosidase, PAG)活性(Barbieri等 1997)。有研究
表明, 缺少酶活性的突变体蛋白对病原菌没有任何
作用效果, 因而推测N-糖苷酶活性在RIP抑菌作用
中起作用(Kirsten等 2001)。另外, RIP的抑菌作用
还涉及到其是如何进入细胞内的过程, 有些具有N-
糖苷酶活性的RIP并不能单独起抑菌作用, 只有在
有几丁质酶和葡聚糖酶同时存在的情况下才能发挥
抑制真菌生长的作用(Park等 2002)。这表明抗菌
蛋白并不是独立起作用, 它们之间往往有密切的协
同作用。
TRIP是一种来自烟草的RIP, 它表现出强烈的
N-糖苷酶活性, 能抑制蛋白的翻译过程, 对里氏木
霉( T r i c h o d e r m a r e e s e i )和青枯假单胞杆菌
(Pseudomonas solancearum)表现出强烈的抑菌活性,
但TRIP对于核糖体的破坏能力比其它的RIP低得
多; 氨基酸序列测定表明, 其与烟草中的Fe-SOD内
部序列有15个氨基酸是完全相同, 而且来自大肠杆
菌的Fe-SOD也有RIP活性, 因此推测TRIP可能具
有 RIP 活性和 Fe-SOD 双重酶活性(Sha rma 等
2004)。
同一 R IP 对不同病原菌的作用方式并不相
同。玉米种子中含有丰富的 RIP, 其 RIP1 (分子
量32 kDa)能引起构巢曲霉(Aspergillus nidulans)菌
丝顶端的溶解, 从而抑制构巢曲霉菌丝的增殖; 同
时这种RIP1还能抑制黄曲霉菌丝的生长, 导致黄曲
霉菌丝的不正常分支(Kirsten等 2001)。有研究还
表明, 西洋参(Panax quinquefolium)中提取出的一
种RIP具有抑制HIV-1逆转录酶的活性(Wang和Ng
2000)。
5 降解细胞中的核酸
5.1 降解RNA 通过细胞膜进入细胞以降解 RNA
的抗菌蛋白主要是 PR-10蛋白。PR-10蛋白是小
分子的酸性蛋白, 这类蛋白不含信号肽序列, 说明
这些蛋白应该是位于细胞质中的胞内蛋白中, 这与
多数PR蛋白不一样, 其它PR蛋白大多都是位于胞
外。许多实验都证明 PR-10 蛋白具有核酸酶活
性。
分离自安第斯块茎和酢浆薯(Oxalis tuberosa)
的Ocatin是一种分子量为18 kDa的储存蛋白, 属于
PR-10蛋白家族, 体外实验发现, Ocatin具有抑制多
种植物病原菌的作用, 如尖孢镰刀菌和立枯丝核菌
(Rhizoctonia solani) (Flores等 2002)。CaPR-10是
存在于辣椒中的一种分子量为 17.3 kDa的细胞内
在蛋白, 它能抑制南瓜疫病菌(Phytophthora capsici)
菌丝的延伸, 推测核酸酶在其中起作用(Park等
2004)。玉米种子中的一种分子量为 16.9 kDa的
PR-10蛋白——ZmPR-10具有核酸酶活性, 它通过
抑制菌丝的生长而抗黄曲霉菌(Chen等 2006)。从
刺茄中纯化出来的 SsPR-10表现出对刺茄叶中总
RNA有核酸酶活性, 同时也能抑制稻瘟病霉菌
(Pyricularia oryzae)的菌丝生长; 这种由胁迫和病原
菌诱导的SsPR-10蛋白不仅在防御和抗胁迫反应中
表现出核酸酶和抗菌活性, 在植株的生长、发育和
衰老过程中都表现出这一活性(Liu等 2006)。
从种子萌发6 d长出的花生根中纯化出一种分
子量为20 kDa的AhPR10蛋白, 重组蛋白的抑菌实
验表明, AhPR10蛋白对花生病原菌尖孢镰刀菌和
立枯丝核菌有抑制作用。多肽链的第 54 位点上
Lys突变成Asn的突变体蛋白AhPR10-K54N缺少
核酸酶活性和抑菌活性; 荧光标记的 AhPR10和
AhPR10-K54N均通过细胞膜而进入尖孢镰刀菌和
立枯丝核菌, 但AhPR10-K54N并不具有抑菌活性,
这表明核酸酶活性是抗菌活性所必需的。同时,
AhPR10蛋白通过细胞膜进入敏感真菌菌丝的这种
内化作用(internalization)依赖于温度和能量, 而且细
胞膜也未出现破裂现象, 这表明内化作用是通过细
胞的主动运输进行的(Chadha和Das 2006)。PR-
10蛋白在细胞膜上的受体或靶位点、运输途径以
及细胞内定位尚不十分清楚, 仍需要做进一步的研
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期,2008年 10月994
究。
除了PR-10蛋白和RNA水解酶型核糖体失活
蛋白具有核酸酶活性以外, 从小麦中分离出来的一
种 PR-4蛋白有核酸酶活性, 其与 PR-10蛋白的作
用方式不同, 推测这种PR-4蛋白可能是通过抑制蛋
白质翻译而抑制真菌生长的(Caporale等 2004)。
5.2 降解DNA 有些抗菌蛋白具有DNA酶活性, 它
通过分解病原真菌的DNA而抑制真菌细胞生长。
从石刁柏(Asparagus officinalis)种子中分离出一种
分子量为 30 kDa的蛋白, 虽然具有抑制非细胞系
的翻译活性, 但不同于 RIP蛋白, 它具有典型的脱
氧核苷酸酶N端序列(GIEVKIREL)。它不具有核
酸酶、蛋白酶和HIV-1翻转录酶活性, 只对DNA
起作用。体外抑菌实验表明, 它能抑制灰霉病菌
(Botrytis cinerea)生长(Wang等 2001)。
6 结束语
植物中含有丰富的抗菌蛋白, 如何通过人工诱
导或基因工程的方法, 提高抗菌蛋白在植物中的表
达量, 以提高植物抵抗真菌入侵的能力, 是值得深
入探讨的。
以往人们常着重于从植物中提取出具有抗真
菌活性的多肽或蛋白的研究, 近年来, 其抗菌机制
的研究十分活跃。从真菌外层的细胞壁和细胞膜,
到细胞内的各个组分, 都是植物抗菌蛋白的作用靶
点, 通过亚显微结构观察能直观了解抗菌蛋白的具
体作用效果, 采用荧光素标记蛋白可以对抗菌蛋白
进行细胞内定位, 而结合体内生物学功能的研究开
展体外酶动力学和蛋白晶体结构研究对更深入阐明
抗菌蛋白的抗菌机制也是重要的。
植物并不是通过单一抗菌蛋白起抗菌作用的,
各种抗菌蛋白之间往往有协同作用, 迄今这种协同
作用大多还只停留于理论解释, 而深入探讨其分子
机制尚少, 对于抗菌蛋白与真菌表面受体的相互识
别以及靶位点的相互作用也知之甚少, 抗菌蛋白在
真菌细胞内的具体运输途径以及其中信号转导也不
甚清楚, 未来可就这些方面深入探讨。研究植物抗
菌蛋白抑制或杀灭真菌的内在分子机制, 可以增强
人们对植物与病原微生物之间相互作用的分子生物
学基础的认识, 从而为抗菌蛋白的研究建立基础。
当今医学界面临的两大医学难题是癌症和艾
滋病, 最近的研究发现, 植物抗菌蛋白不仅抑制特
异侵染植物的微生物, 其中有些抗菌蛋白还可以杀
死肿瘤细胞, 甚至起抑制HIV病毒的作用(Wang和
Ng 2000; Ye和Ng 2001, 2002a, 2002b; Ho等2007),
这表明植物抗菌蛋白在医药领域可能有潜在的应用
前景。相信随着植物抗真菌蛋白研究的深入, 其在
植物真菌病害的防治以及医药领域将会发挥更大的
作用。
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