全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月424
星星草cDNA 文库构建和金属硫蛋白(MT-1)基因的克隆
刘桂丰* 褚延广 王玉成 侯英杰 杨传平
东北林业大学林学院林木遗传育种教研室，哈尔滨150040
提要 以受 NaHCO3 胁迫后的星星草叶片组织为材料构建了 cDNA 文库，文库的初始滴度为 2.0×106 pfu，重组率为 95%，
平均插入片段长度为 0.8 kb，扩增后文库的滴度为 4.0×109 pfu·mL-1。 文库克隆随机测序获得了星星草的金属硫蛋白(MT-1)
基因的全长 cDNA 序列，显示文库中含有一定量的全长基因。MT-1 基因全长 622 bp，其中 5 非翻译区 57 bp，3 非翻译
区 343 bp，开放读码框长 222 bp，编码 73 个氨基酸，氨基酸序列中具有植物 MT-1 蛋白特有的金属响应元件(MRE)序
列，MT-1 蛋白的分子量为 7.814 kD，理论等电点为 4.72。
关键词 星星草；cDNA 文库；NaHCO3 胁迫；金属硫蛋白
Construction of cDNA Library and Cloning of Metallothionein (MT-1) Gene
from Puccinellia tenuiflora
LIU Gui-Feng*, CHU Yan-Guang, WANG Yu-Cheng, HOU Ying-Jie, YANG Chuan-Ping
Laboratory of Forest Genetics and Breeding, College of Forest, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract cDNA library was constructed from Puccinellia tenuiflora leaves under NaHCO3 stress. A primary
P. tenuiflora library of 2×106 pfu was obtained through testing, and the recombined efficiency of cDNA library
was 95%. The average insert size was 0.8 kb, while the titer of amplified library was 4.0×109 pfu·mL-1. The
metallothionein type 1 cDNA was obtained through sequencing clones picked randomly, suggesting some full-
length cDNAs were contained in the library. MT-1 was 622 bp in length, including 57 bp of 5 untranslated
region and 343 bp of 3 untranslated region. The cDNA had an open reading frame of 222 bp, which contained
a deduced amino acid sequence of 73 residues, and had a plant MT-1 special core sequence of metal responsive
element (MRE). Molecular weight and theoretic isoelectric point of the protein was 7.814 kD and 4.72, respectively.
Key words Puccinellia tenuiflora; cDNA library; NaHCO3 stress; metallothionein
收稿 2004-10-08 修定 　 2004-12-28
资助　 国家“973”计划(G1999016000)和国家转基因植物
研究与产业化专项(JY03A1802)。
*E-mail: liuguifeng@126.com, Tel: 0451-82190607
星星草(Puccinellia tenuiflora)属禾本科碱茅属
植物，是盐碱草甸的优势种和建群种，广泛分布
于我国北方各地，它的耐盐碱和耐干旱特性已受
到人们的广泛关注。范亚文等[1]报道星星草能有
效提高土壤有机质含量和铁、锰可利用性，并降
低全钠、全镁和全钙含量。尹尚军等[2]报道，星
星草在盐(NaCl)、碱(Na2CO3)胁迫下，其体内有
机酸含量随着胁迫程度的增大而明显上升，但含
水量、总氮和叶绿素含量则随之明显下降。以往
星星草的抗逆研究主要集中在田间和室内实验材料
的抗性生理特征与其对盐碱土壤条件的适应能力测
定，而对星星草抗盐碱分子机制的研究及相关基
因的克隆尚未见报道。另外，金属硫蛋白
(metallothionein, MT)是一类广泛存在于动物、微
生物与高等植物中的低分子量(6~7 kD)的金属结合
蛋白或多肽，其硫醇和金属离子的含量极高，二
者约占总分子量的10%[3]。 尽管人们对它已进行
了数十年的研究，但对其确切的生理功能尚不完
全清楚。基于 MT 的金属结合特性，人们结合实
验推测MT除了具有基本的金属离子转运与存储作
用外，还能消除细胞内活性氧，增强对外界胁迫
的适应性和调节生长[4,5]。基于以上事实，本文通
过对 NaHCO3 胁迫下星星草 cDNA 文库的构建和
cDNA 克隆的随机测序，获得星星草 MT-1 基因的
研究报告 Original Papers
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全长 cDNA，并对此种基因的基因序列、蛋白结
构位点进行了分析。由于植物抗盐性为数量性
状，涉及大量基因的表达，因此，系统抗盐机
制的研究需要选择可同时对大量基因表达进行研究
的高通量技术，本文中星星草 cDNA 文库的构建
可供高通量的基因表达分析(如EST技术、基因芯
片技术)时参考。
材料与方法
温室中盆栽的星星草(Puccinellia tenuiflora)用
0.4 mol·L-1 的 NaHCO3 溶液浇灌，进行胁迫处理，
在胁迫 72 h 后取星星草的健康叶片用双蒸水清
洗，迅速置于液氮中冷冻，- 8 0℃下保存备用。
cDNA 文库构建试剂盒为ZAP-cDNAÒ Synthe-
sis Kit and ZAP-cDNAÒ GigapackIIIÒ Gold Cloning Kit
(Stratagene公司)。mRNA分离试剂盒PolyATtractÒ
mRNA Isolation System IV为 Promega公司产品。
ExTaq购自宝生物工程(大连)有限公司。T3 引物 /
T7 引物由北京赛百盛生物技术公司合成，M13-20
引物 /M13反向引物由上海生工生物技术服务公司
合 成 。
采用CTAB法[6]提取星星草总RNA，取0.6 mg
总RNA，用PolyATtractÒ mRNA Isolation System IV
分离 mRNA，具体步骤参照试剂盒用户手册进行。
构建cDNA 文库和检测滴度时，取5 mg 星星
草 mRNA，用ZAP-cDNAÒ Synthesis Kit合成 cDNA
第 1 链和第 2 链，双链 cDNA 经末端补平后连接
上EcoRI接头，再经XhoI酶解后用Sepharose CL-
2B 柱分离收集大于400 bp 的片段，连接于Uni-
ZAPÒ XR 载体上。用GigapackIII Gold Packaging
Extract 对连接产物进行体外包装，包装产物转染
SOLRTM 后铺于含 X-gal 和 IPTG 的平板，根据噬
菌斑数计算文库的滴度和重组率。
采用PCR 方法检测文库插入片段长度。分别
用移液器吸取 6 mL 无菌水，在平板上选取 10 个
白斑吸打数次，将菌液转入 PCR 管中。于 90℃
下灭活噬菌体10 min，以其为模板，用载体两端
的测序引物 T 3、T 7 为引物，PCR 检测文库插入
片段长度。PCR 反应体系为：10×PCR 缓冲液 2
mL、dNTP 200 mmol·L-1、ExTaq 1 U、引物 T3
和 T7 各1 mmol·L-1、模板2 mL。PCR反应条件为：
94℃ 预变性1 min； 94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃
1 min，30 个循环；72℃ 保温 7 min。PCR 产物
的长度用 0.8% 的琼脂糖凝胶电泳技术检测。
cDNA 文库的扩增及重组克隆筛选均按 ZAP-
cDNAÒ GigapackIIIÒ Gold Cloning Kit用户手册进
行操作。文库克隆的随机测序获得金属硫蛋白 1
(MT-1)基因的序列，运用 BLASTX 与 NCBI 的 NR
数据库进行同源性比对，并对不同物种来源的
MT基因进行多序列联配。用Prosite软件在线分
析该蛋白质的基本结构域。采用NCBI的开放读码
框寻找程序(ORF founder)确定该基因的开放读码
框。用Clustal X1.83对 15个物种的17个 MT基
因进行分子进化分析。
实验结果
1 cDNA文库的构建及插入片段长度的检测
将合成的cDNA 第 1、第 2 链产物用0.8% 的
琼脂糖凝胶进行电泳检测，发现它的最大转录长
度远超过1 kb，平均长度集中于1 kb左右(图1)。
滴度测定的结果表明，所建立的星星草cDNA 文库
初始滴度为2×106 pfu ，重组率为95%。用 PCR
法检测文库克隆插入片段长度，结果如图 2。经
PCR检测，10个克隆的PCR产物长度在0.4~1.4 kb
之间，抛除载体序列0.12 kb，插入片段的平均长
度约为0.8 kb。文库经扩增后，其滴度为4.0×109
pfu·mL-1。
图 1 cDNA 第 1、第 2 链合成产物的电泳图谱
Fig.1 Electrophoretogram of products of first
and second strand cDNA synthesis
1: cDNA 第 1链; 2: cDNA 第 2链; M: 100 bp 分子量标准。
2 MT-1 基因全长cDNA 的获得及序列分析
通过对文库克隆的随机测序和运用 BLASTX
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与NCBI 的 NR 数据库进行同源性比对，获得了星
星草 MT-1 基因的 cDNA 序列，去除载体和 polyA
后该序列长571 bp。
从图 3 和图 4 可见：
(1)用 ORF Finder 寻找 cDNA的开放读码框，
结果发现该序列开放读码框位于第58~279 bp 之
间，长 222 bp，共编码 73 个氨基酸(图 3)。
从本文中克隆的星星草MT-1基因 cDNA 和推
导的氨基酸序列图中可以看出，此种基因的5非
翻译区(5-UTR)第13~23 bp处有一个明显的金属响
应元件(metal responsive element, MRE)，它包含
一个11碱基的核心序列(tgc cga ttc gg) ；该基因
的开放阅读框中共含有12个半胱氨酸(C)残基，组
成了C-x-C-x(3)-C-x-C-x(3)-C-x-C, C-x-C-x(3)-C-
x-C 和C-x-C三部分结构(x为除半胱氨酸外的其它
氨基酸)。这些都是已发现的植物 MT-1 基因所具
有的典型特征[7]。
(2)通过ExPASY 网站(http://us.expasy.org/tools/
pi tool.htm) 的在线分析，推测该基因编码蛋白的
分子量为7.814 kD，理论等电点为 4.72。
用 BLASTX 对 MT-1 基因序列的同源性分析和
对9种不同植物来源的MT-1基因所编码蛋白质序
列的联配分析的结果(图4)表明，所分析的9种植
物 MT-1 基因所编码的蛋白质序列在其 N 末端、C
末端以及第40~50位氨基酸之间存在3个高度保守
的区域，其中前两部分也是富含 C 的区域。分析
结果表明，星星草 M T - 1 基因与来源于紫羊茅
(Festuca rubra)和大麦(Hordeum vulgare)的MT-1基
因的同源性最高，分别为 9 0 % 和 8 9 %，与来源
于豌豆(Pisum sativum)和番薯(Ipomoea batatas)的
MT- 1 基因的同源性最低，分别为 39% 和 34%。
从Prosite 数据库(http://us.expasy.org/prosite/)
分析 MT-1 蛋白的结构位点中发现，其 53~64 位
氨基酸之间含有一个醛脱氢酶( a l d e h y d e
dehydrogenase)的半胱氨酸激活位点，同时含有3
个肉豆蔻酰基化(myristyl)位点(分别位于第6~11、
10~15和 59~64 位氨基酸之间)和第 61~64 位氨基
酸之间的一个酪氨酸激酶Ⅱ(CK2)的磷酸化位点(图
5 )。
图3 MT-1 基因的cDNA序列分析
Fig.3 MT-1 cDNA sequence analysis
下划线部分为 MT-1 基因 cDNA 序列核心部分(core region), 终止密码子处用“*”表示。
图2 cDNA 文库插入片段的PCR检测
Fig.2 PCR detection of insert sizes in cDNA library
M: DL2000 分子量标准; 1~10: PCR 产物。
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另外，根据星星草 MT-1 蛋白的 BLASTX 分
析结果，结合GenBank 的其它数据，选取来源于
15种植物的17个不同的MT蛋白序列(包括8种MT-
1蛋白、4种MT-2蛋白和4种尚未被明确分类的MT
蛋白)，与所克隆的星星草 MT-1 蛋白序列一起在
Clustal X1.83下进行进化分析的结果见图6。
讨 论
M T 是一类能与锌、铜、铁等多种重金属原
子结合的小分子量蛋白质。已有的研究表明，
MT蛋白氨基酸序列的C 残基的数量和所在位置高
度保守，具有C-x-C、C-x-y-C 和 C-C 的序列结
构[7]。已发现的植物体内 MT 基因主要分为 MT-
1、MT-2 两种类型，其中 MT-1 基因所编码蛋白
的氨基酸序列具有典型的C-x-C-x(3)-C-x-C 的特
征[8,9]。本文所克隆的MT基因氨基酸序列的5端
和3端分别有一个C-N-C-G-S-S-C-G-C和C-S-C-
图5 MT-1蛋白结构位点分析
Fig.5 Motif analysis of MT-1 protein
图4 9种植物MT-1基因推测氨基酸序列的联配
Fig.4 Alignment of the deduced amino acid sequences of 9 plants MT-1 family genes
　　9种MT-1基因的来源物种为：星星草Pt(Puccinellia tenuiflora)、大麦Hv(Hordeum vulgare)、小麦Ta(Triticum aestivum)、
紫羊茅Fr(Festuca rubra)、水稻Os(Oryza sativa)、玉米Zm(Zea mays)、大蒜As(Allium sativum)、番薯Ib(Ipomoea batatas)和
豌豆Ps(Pisum sativum)。
G-D-N-C-K-C 的结构，属于 MT-1 类型基因。
MT是逆境条件下植物体抗氧化防卫体系中一
类重要基因。盐胁迫导致植物体产生大量活性
图6 18种植物MT家族蛋白的分子进化树
Fig.6 Phylogenetic tree of MT family genes in 17 plants
　　M T 蛋白来源物种未在图 4 中出现的分别为：大豆 G m
(Glycine max)、番茄 Le(Lycopersicon esculentum)、牵牛 Ph
(Petunia×hybrida)、凤眼莲 Ec(Eichhornia crassipes)、香蒲
Tl(Typha latifolia)和狗牙根 Cd(Cynodon dactylon)。
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氧，对细胞组分造成严重伤害。MT-1 蛋白可通
过与其羟硫基结合的金属原子和活性氧(OH·、O2－· 等)
的反应，使蛋白自身发生氧化或修饰，在释放金
属原子的同时消除活性氧[3]，是一类有效的活性
氧清除剂。研究证明，ZnMT-1 清除 OH · 的能力
是谷胱甘肽(glutathione，GSH)的100倍，并对DNA
有一定的保护作用[10]。
目前，MT 蛋白的抗逆生理功能的研究虽然
在不断深入，但它除抗氧化作用以外的其它功能
尚不完全清楚，加之已知的植物 MT 基因数量不
多，因此，从不同植物的不同发育时期、不同
环境条件下克隆 MT 基因，进一步研究植物体内
这类重要基因的功能就显得极为必要。本研究从
c D N A 文库中分离了星星草 M T - 1 基因的全长
cDNA 并对其序列进行分析的结果，有助于进一
步了解 NaHCO3 胁迫下星星草 MT-1 基因对植株耐
盐性的调节和植物耐盐的分子机制。
盐碱地中除了以 NaCl 为主要盐分的盐渍土
外，以 NaHCO3 为主的苏打土也不占少数。以往
人们研究中性盐( N a C l ) 影响植物时往往忽视
N a H C O 3 等碱性盐危害植物的重要性。一般来
说，碱性盐除了有中性盐的离子毒害和渗透胁迫
作用外，由其所导致的高pH环境也明显降低矿质
元素可利用性[11]。星星草是一种适生于碱地生境
的植物，它能在较高浓度Na+ 和 pH 值的土壤中正
常生长，因此，用 Na H C O 3 对其进行胁迫处理，
诱导星星草中盐、碱胁迫应答基因的表达，进而
研究星星草的抗盐碱机制，这在理论研究和农业
生产应用中都有意义。植物的耐盐性是一种数量
性状，涉及到大量基因的参与和相互作用，所
以，选择一种合适的方法研究植物耐盐性很重
要。实践证明，cDNA 文库技术是高效地对大量
基因同时进行研究的重要手段，也是其它在基因
组水平上研究基因表达的技术(如基因芯片技术、
EST 技术等)的基础。据此，我们认为本文结果
对研究星星草抗盐碱机制和抗逆基因克隆来说，
可能有一定的参考价值。
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