全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月754
一种改良的克隆小麦GLP3基因启动子的TAIL-PCR技术
陈军营，孙佩，王德勤，陈新建 *
河南农业大学农学院，郑州 450002
An Improved TAIL-PCR Method for Cloning of GLP3 Gene Promoter from
Wheat Genomic DNA
CHEN Jun-Ying, SUN Pei, WANG De-Qin, CHEN Xin-Jian*
College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
提要：以小麦基因组 DNA为模板，用一种改良热不对称交错 PCR (thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)技术
克隆到全长为 1 748 bp的小麦GLP3基因的上游侧翼序列。测序结果表明，TATA-box位于基因转录起始位点 CAT-box
上游 -27 bp处；CAAT-box位于 CAT-box上游 -163 bp处；ATG位于 CAT-box下游 94 bp处，5UTR (非编码区)序列全
长 93 bp，表明该序列为小麦GLP3启动子序列。
关键词：TAIL-PCR；GLP3基因；启动子
收稿 2007-03-19 修定　 2007-05-24
资助　 国家转基因植物研究与产业化专项基金(JY03-B-19-2)
和河南省杰出人才创新基金(N o.02 210 0090 )。
* 通讯作者(E -ma i l：xin j i a n@ 3 7 1 .n et；T e l：0 3 7 1 -
6 3 5 5 4 9 6 0 )。
染色体步行是指以生物基因组或基因组文库
中的已知序列为依据逐步探知其侧翼未知序列的技
术，此方法适合于长距离步行，但必须进行酶切
和连接反应，比较烦琐；而基于 PCR 方法改进
的染色体步行技术比较简单，但必须在特殊的
PCR条件下进行，且无法识别 PCR产物中“特
异条带”(Ochman等 1988；Rosenthal和 Jones
1990；Lagerstrom等 1991；Sarkar等 1993)，从
而影响了这些技术的应用。
Mazars等(1991)提出热不对称 PCR (thermal
asymmetric PCR，TA-PCR)技术克隆基因侧翼序
列；在此基础上 Liu和Whittier (1995)采用交错改
变退火温度的方法改变 PCR的“严谨性”即热
不对称交错 PCR (thermal asymmetric interlaced
PCR，TAIL-PCR)技术，增加“特异带”的产
量，消除 "非特异带 "的干扰，巧妙的解决了“非
特异带”的识别问题。其主要原理是：根据已
知DNA序列，分别设计 3条同向且退火温度较高
的特异引物(specific primer，SP)和 4种退火温度
较低的兼并引物(arbitrary degenerate primer，
AP)，然后进行 3次巢式的热不对称 PCR反应即
可获得某基因的侧翼序列。该技术具有简单快
速、高效特异、并能对产物直接测序等优点，已
成为分子生物学研究中非常实用的基因侧翼序列克
隆技术(Benkel和 Fong 1996；Jones和Winistorfer
1992，1997；Yan等 2003；Parker等 1991；Qin
等 2003；Antal等 2004)，在克隆基因、寻找已
知基因的启动子和调控元件、研究基因的内含子
和外显子边界、探知特定位点的上游和下游序
列、分析转基因生物基因组中外源基因的插入位
点等方面已有广泛应用。
但在实际工作中我们感到 Liu 和Whit t i er
(1995)的方法仍有需改进的地方，如第 1次TAIL-
PCR前的 10个降低等严谨度的 PCR循环可以省
去；3次 PCR循环中的变性时间和延伸时间应该
延长；3 次循环中应该都增设不同的退火温度，
这样会更有利于特异目的片段的富集。
小麦GLP3 (germin like protein 3)是小麦萌发
过程中的一种蛋白质，具有 SOD和OXO双重活
性，并且具有加固细胞壁的功能，与植物抵御生
物和非生物胁迫有密切关系(Caliskan等 2004；
Carter和 Thornburg 1999；Chen等 2006；Woo等
2000；Kim和 Triplett 2004)。研究表明，Germin
技术与方法 Techniques and Methods
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的生理作用是多方面的，但对其启动子的克隆还
未见报道。本文以小麦品种豫麦18的基因组DNA
为模板，采用改良的热不对称交错 PCR技术，成
功克隆到了 GLP3基因启动子的全长序列。
材料与方法
1 材料
小麦(Triticum aestivum L.)品种‘豫麦 18’。
2 提取基因组DNA
选取 200粒饱满的麦粒，置于铺有 2层湿润
滤纸的发芽盒中，于室温下发芽。幼苗长至 10
cm高时取叶片，用CTAB法提取其基因组DNA作
为扩增未知侧翼序列的模板。
3 引物设计
以已知基因序列为基础设计了退火温度较高
(60 ℃)的3个特异引物SP1 (GTAGAGCTTGTTCC-
C-AGAGTCGAG)、SP2 (TCACCTTTCAACAC-
GATGCCAATG)和 SP3(GCTTGCATGGATG-
CCCGTTCACAG)，引物方向为需要扩增的未知
区域方向。AP1 [TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)-
AGA]、AP2 [AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)-
AGG]、AP3 [CA(A/T)CGICNGGAIA(G/C)GAA
(I：次黄嘌呤腺苷酸)]和AP4 [TC(G/C)TICGNAC-
IT(A/T)GGA]为经过独特设计且退火温度较低(44
℃)的简并引物，Tm为 47~48 ℃，按公式 69.3+0.41
(%GC)-650/l算出(l为引物长度)。同时设计测序
引物 SEQR1 (AGCAAGCTTAGCTAGCACTG)、
SEQR2 (TTCAGTTTTAAGAACGATTA)、SEQR3
( TAC CC ACAACTATCAATTC A)、S EQ R 4
(TTAGC ATGATCG GCGC ATTT)和 SEQ R5
(CCAGCGAAGCAACGAAAACA)。
4 TAIL-PCR过程(图 1)
第 1次 PCR：用 TaKaRa LA TaqTM DNA
聚合酶，以获得的基因组 DNA为模板，分别以
SP1/AP1、SP1/AP2、SP1/AP3和 SP1/AP4为引
物对，PCR扩增目的片段。分别取 5 µL PCR产
物进行琼脂糖凝胶电泳检测，其余作为第2次PCR
的模板。
第 2次 PCR：以第 1次 PCR产物为模板，分
别以 SP2/AP1、SP2/AP2、SP2/AP3和 SP2/AP4
为引物对，PCR扩增目的片段。取 5 µL PCR产
物进行电泳检测，其余作为第 3次 PCR的模板。
第 3次 PCR：以第 2次 PCR产物为模板，分
别以 SP3/AP1、SP3/AP2、SP3/AP3和 SP3/AP4
为引物对，PCR扩增目的片段。取 5 µL PCR产
物进行电泳检测。
3次扩增的反应体系、温度条件和循环数见
表 1 。
5 产物回收和测序
用 TaKaRa琼脂糖胶 DNA片段回收试剂盒
(Code No. D301)回收第 3次 PCR产物较长片段，
然后取 1 µL进行琼脂糖凝胶电泳，并用 SEQR1、
SEQR2和 SEQR4引物对回收产物测序。
图 1 TAIL-PCR的原理(Liu和Whittier 1995)
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6 侧翼序列验证克隆
用 TaKaRa LA TaqTM DNA聚合酶，以小麦
基因组DNA为模板，以 SEQR5/SEQR3为引物，
PCR扩增目的基因，用琼脂糖胶DNA片段回收试
剂盒回收 PCR产物片段，取 1 µL进行琼脂糖凝
胶电泳。
用TaKaRa DNA Ligation Kit (Code No. D6022)
中的溶液 I，将回收产物与 pMD18-T样品载体连
接后，热转化至大肠杆菌JM109感受态细胞(Code
No. D9052)，涂布平板，37℃过夜培养。挑选
阳性菌落扩大培养，提取质粒后取 1 µL进行琼脂
糖凝胶电泳。用 BacBEST引物 RV-M、M13-47
和 SEQR1、SEQR3引物对质粒进行测序。
实验结果
1 三次PCR产物的电泳分析
图 2为 3次 PCR产物电泳图。结果表明，不
同 PCR所得到的产物在大小和丰度方面存在明显
差异，片段最小为 100 bp，最大为 10 000 bp。
第 1次 PCR产物中 SP1分别与AP1和AP2组成的
引物对未检测到有扩增产物(泳道 1、2)，SP1分
别与AP3和AP4组成的引物对分别检测到有2条扩
增产物(泳道 3、4)，大小在 750~2 000 bp之间，
其中SP1与AP3组成的引物对检测到扩增产物丰度
最大(图 2-a)。第 2次 PCR产物中SP2与AP1组成
的引物对未检测到有扩增产物(泳道 1)，SP2分别
与AP2、AP3和AP4组成的引物对分别检测到有5
条、6 条、7 条扩增产物(泳道 2、3、4)，大小
均在 200 bp以上，其中 SP2与AP3组成的引物对
检测到扩增产物中大约 2 000 bp的片段丰度最大
(图 2-b)。第 3次 PCR产物中 SP3分别与 AP1、
AP2、AP3和AP4组成的引物对分别检测到有 1、
5、5 和 6 条扩增产物(泳道 1、2、3 和 4)，其
中以 SP3与AP3为引物检测到扩增产物中有大约
5 000、2 000、1 100、750和 600 bp的片段(图 2-c)。
2 目的片段的回收和测序
切胶回收图 2-c泳道 3中最富集的PCR产物，
其大小为 5 000 bp左右的特异片段，重新进行琼
脂糖凝胶电泳(图 3-a)。以上述片断为模板，以
表 1 TAIL-PCR的扩增体系、温度条件和循环数
　 　 反应 循环体系中物质含量 /µL 温度条件 循环数
　　初次反应 10×LA PCR缓冲液 II (加Mg2+) 5 93 ℃ (1 min)，95 ℃ (1 min) 1
DNTP混合物(2.5 mmol·L-1) 8 94 ℃ (30 s)，60 ℃ (1 min)， 72 ℃ (2 min) 5
SP1 (20 pmol·L-1) 1 94 ℃ (30 s)，25 ℃ (3 min)，72 ℃ (2 min) 1
AP (1~4) (20 pmol·L-1) 1 94 ℃ (30 s)，60 ℃ (1 min)，72 ℃ (2 min) 1 5
基因组 DNA 1 94 ℃ (30 s)，60 ℃ (1 min)，72 ℃ (2 min) 1 共 15次
TaKaRa LA Taq (5 U·L-1) 0.5 94 ℃ (30 s)，44 ℃ (1 min)，72 ℃ (2 min) 1
加双蒸水到 5 0 72 ℃ (10 min) 1
　　二次反应 10×LA PCR缓冲液 II (加Mg2+) 5 94 ℃ (30 s)，60 ℃ (1 min)，72 ℃ (2 min) 1
DNTP混合物(2.5 mmol·L-1) 8 94 ℃ (30 s)，60 ℃ (1 min)，72 ℃ (2 min) 1 共 15次
SP2 (20 pmol·L-1) 1 94 ℃ (30 s)，44 ℃ (1 min)，72 ℃ (1 min) 1
AP (1~4) (20 pmol·L-1) 1 72 ℃ (10 min) 1
初次 PCR产物 1
TaKaRa LA Taq (5 U·L-1) 0.5
加双蒸水到 5 0
　　三次反应 10×LA PCR 缓冲液 II (加Mg2+) 5 94 ℃ (30 s)，60 ℃ (1 min)，72 ℃ (2 min) 1 2
DNTP混合物(2.5 mmol·L-1) 8 94 ℃ (30 s)，60 ℃ (1 min)，72 ℃ (2 min) 1 共 12次
SP3 (20 pmol·L-1) 1 94 ℃ (30 s)，44 ℃ (1 min)，72 ℃ (1 min) 1
AP (1~4) (20 pmol·L-1) 1 72 ℃ (10 min) 1
二次 PCR产物 1
TaKaRa LA Taq (5 U·L-1) 0.5
加双蒸水到 5 0
｝
｝
｝
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SEQR5/SP3为引物对侧翼序列进行 PCR验证，扩
增产物片段大小接近 2 000 bp (图 3-b)，说明该
片段为目的片段。
将目的片段装入大小为 2 692 bp的克隆载体
pMD18-T中(图3-c)，用测序引物SEQR1、SEQR2
和 SEQR4对回收产物进行测序。结果表明，回
收的目的片段全长 1 748 bp。根据启动子的结构
特征，对 CAAT-box和 TATA-box等启动子元件
进行分析表明，它们分别位于基因转录起始位点
CAT-box上游-163 bp和-27 bp处，ATG位于CAT-
box下游 94 bp处，5UTR (非编码区)序列全长 93
bp，说明该序列确为小麦GLP3启动子序列。测
序结果已登录于GenBank，登录号为AY864922。
其结构示意见图 4。
讨　　论
虽然用随机引物进行染色体步行的技术提出
较早，但由于无法有效地控制由随机引物引发的
非特异产物的产生，这种方法一直未能得到广泛
应用。Liu和Whittier (1995)提出的 TAIL-PCR具
有过程简单、快速省时、高效特异和直接测序等
优点，于是这个问题便得到了解决。
图 2 TAIL-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
　　a、b、c 分别代表第 1、2、3 次 PCR 产物电泳结果。M1：D N A 分子量标准 D L20 0 0 ; M2：D N A 分子量标准 λ -H in dI I I；
1~4 分别代表不同泳道中特异引物与随意引物 AP1~ 4 组合的 PCR 产物。
图 3 目的片段回收(a，泳道 1)、侧翼序列验证(b，泳道 1)与克隆(c，泳道 1和 2)
M1：D N A 分子量标准 D L2 0 0 0；M2：D N A 分子量标准 λ -H in dI I I。
图 4 GLP3启动子序列示意
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本文采用的方法是在Liu和Whittier (1995)方
法的基础上作了如下改进：(1)省去第 1次 TAIL-
PCR前的10个低严谨度的PCR循环，可以节省时
间；(2) 3次 PCR循环中的变性时间由 5 s延长至
30 s，这对DNA彻底解链有利；(3) 3次 PCR循
环中的延伸时间由 5 min延长至 10 min，可以获
得较长的侧翼序列；(4)第 3次循环中增加热不对
称交错 PCR，便于特异目的片段的富集，这也是
与 Liu和Whittier (1995)方法的最大不同之处。只
须经过 1次反应(约 12 h)就可克隆到GLP3基因启
动子的全长序列(1 748 bp)。
McCubbin等(1987)最初在小麦中鉴定出
Germin基因，Rahman等(1988)相继分离出全长
Germin的 cDNA序列；之后，Dratewka等(1989)
又进行 cDNA的测序。Lane等(1991)用全长的
Germin cDNA探针在小麦DNA文库中同时克隆到
小麦Germin的 2个基因，二者mRNA的同源性为
87%。并观察到Germin在不同生长发育阶段(如花
期诱导、胚胎发生、次生木质部的形成)或在生
物或非生物胁迫条件下都会表达，并表现出生物
学功能(Fry等 1998；Caliskan等 2004)。Chen等
(2006)报道Germin活性与小麦愈伤组织的形成和
分化有关，其生理作用是多方面的，但对其启动
子的研究较少。本文用 TAIL-PCR的方法成功克
隆到GLP3基因启动子的全长序列(1 748 bp)，对
相关问题的研究可能有一定的参考价值。
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