全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 689
高效的‘大红’甜橙实生苗上胚轴离体培养与植株再生体系的建立
敖小平 1，熊兴耀 1,* ，胡新喜 1，冯鹄峻 1，邓子牛 1,2
湖南农业大学 1园艺园林学院，2细胞工程实验室，长沙 410128
提要：以‘大红’甜橙实生苗上胚轴为外植体，研究其离体培养和植株再生技术的结果表明，MS+1.0 mg·L-1 6-BA的
培养基诱导不定芽的效果最好，30 d时诱导率达97.5%。外植体抗性筛选出最适kanamycin浓度为50 mg·L-1。IBA和NAA
都促进不定芽生根。1/2MS+4.0 mg·L-1 IBA和1/2MS+1.5 mg·L-1 NAA诱导根的效果最佳，生根率和根数分别达到76.92%、
0.81和 92.31%、1.88。
关键词：‘大红’甜橙；离体培养；植株再生；不定芽
Establishment for Culture in Vitro and Plant Regeneration System from Epi-
cotyl of ‘Dahong’ Sweet Orange Seedlings
AO Xiao-Ping1, XIONG Xing-Yao1,*, HU Xin-Xi1, FENG Hu-Jun1, DENG Zi-Niu1,2
1College of Horticulture and Landscape, 2Key Lab of Cell Engineering, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
Abstract: The technique of plant regeneration in vitro from epicotyl segments of ‘Dahong’ sweet orange was
studied. The results showed that the best medium for adventitious buds induction was MS+1.0 mg·L-1 6-BA, the
induction rate was 97.5% in 30 d. The suitable concentration of kanamycin from the selection was 50 mg·L-1.
Both IBA and NAA could accelerate the rooting of adventitious buds. The best media for the rooting were
1/2MS+4.0 mg·L-1 IBA and 1/2MS+1.5 mg·L-1 NAA. The rooting frequency and the average root number per
shoot were 76.92%, 0.81 and 92.31%, 1.88 respectively.
Key words: ‘Dahong’ sweet orange; culture in vitro; plant regeneration; adventitious shoots
收稿 2007-05-21 修定 2007-06-18
资助 国家转基因项目(YJ04-B-02)和湖南省科学技术厅重大
科技专项(04 NK1 00 5)。
致谢 本文工作在湖南农业大学细胞工程重点实验室完成。
* 通讯作者(E-ma il：xiongxingya o@1 2 6.com；T el：
07 31 -4 63 52 95 )。
‘大红’甜橙是湖南省种植面积最大的地方
柑桔品种之一，具有丰产、稳产，汁多、渣少、
皮色深红、有香气、耐贮藏等优良品质。由于
柑桔存在的世代周期(童期)长、杂合性高、种子
多胚性、遗传上的不亲和性、单性结实等现象，
常规育种很难满足生产要求。自从遗传转化技术
应用以后，植物的物种改良更有方向性，从而为
柑桔育种带来了广阔的前景。要进行遗传转化工
作，首先要建立一个高效再生体系。本文旨在探
索诱导‘大红’甜橙离体培养和植株再生的较佳
条件，以便为‘大红’甜橙遗传转化工作建立
基础。
材料与方法
采用的‘大红’甜橙(Citrus sinensis Osbeck)
果实取自湖南省洪江市和江永县的生产园，种子
剥去种皮。用 70%乙醇浸泡 30 s，接着在 0.1%
的升汞溶液中浸泡10 min，然后用无菌水冲洗3~4
次，最后接种于 1/2MS (大量元素减半)培养基
上，每天光照 16 h，光强为 40~60 µmol·m-2·s-1，
培养室温度为(25±1) ℃。
诱导不定芽时，取 25 d左右苗龄的无菌苗上
胚轴，切成约 1.0 cm长小段，接种在MS基本培
养基中，外加不同浓度的生长调节剂 6-BA。6-BA
浓度分别为 0、1、2、3、4、5、6 m g · L - 1，
试验重复 3次，取平均值。按不定芽诱导率(%)
=芽诱导外植体(个)/外植体(个)×100%，计算培养
15和 30 d时的诱导率。
以抗生素筛选不定芽时，取无菌实生苗的上
胚轴，放在较佳的不定芽诱导培养基中，加入经
过过滤灭菌的卡那霉素(kanamycin，Kan)进行抗
性筛选。Kan浓度分别为 0、25、50、100、150
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mg·L- 1。
不定芽离体生根培养时，取 1.0 cm左右的上
胚轴，接种到生根培养基中。生根培养基以 1/2
M S 为基本培养基，加不同浓度的生长调节剂
IBA和 NAA，pH为 5.7。设有 13个处理，试验
重复 3次，取平均值。按不定芽生根率(%)=生
根外植体(个)/外植体(个)×100%，计算生根率；
按生根数=外植体总根数 /总外植体数，计算生根
数。
实验结果
1 6-BA对不定芽的诱导
上胚轴接种后 15 d和 30 d分别观测 6-BA诱
导不定芽的结果(图 1)显示，接种后 30 d的诱导率
明显高于 15 d。30 d后，6-BA为 1 mg·L-1的最
高诱导率为 97.5%，此时外植体两端愈伤组织明
显膨大，并再分化出多数芽，丛芽生长势强(图
2-a); 6-BA为 6 mg·L-1的最高诱导率为 17.5%，此
时，仅外植体的一端愈伤组织稍膨大，不定芽生
长势极弱，40% 的外植体完全黄化；6-BA为 0
mg·L-1的诱导率为 75.0%，各外植体均一端膨大，
并且大多数外植体只分化出一个不定芽，但这些
单芽的生长势很强(图 2-b)。
分化的不定芽生长势强(图 2-a) ；Kan为 25 mg·L-1
浓度的不定芽诱导率为 12%，多数外植体只有一
端膨大，并且逐渐变黄，少数诱导的抗性芽生长
势较弱；Kan浓度超过 50 mg·L-1的外植体两端几
乎不膨大，抗性芽诱导率为 0，绝大部分外植体
逐渐枯黄。
3 IBA和NAA对‘大红’甜橙不定芽和抗性芽
生根的影响
先在预备试验为MS+1.0 mg·L-1 6-BA培养基
中，分别加 3 mg·L-1 IBA和NAA后，加NAA的
不定芽基部显著膨大，生根慢，白色根粗壮而短
小，叶片逐渐枯亡。这与王任翔等(2003)和吴金
寿等(2003)的柑桔试管苗生根结果有所不同。而
加 IBA的不定芽基部基本上不膨大，生根良好，
根黄绿色、叶片绿色。这与韩美丽等(2001)和黄
涛等(2002)分别在沙田柚和‘欧林达’夏橙中的
结果基本相同。进一步的试验证明，诱导‘大
红’甜橙生根对 IBA和NAA的浓度高低要求正好
相反，高浓度的 NAA 抑制‘大红’甜橙生根。
另外，参照预备试验，又设计了 13个处理
(1/2MS；1/2MS+ IBA 0.5 mg·L-1 (单位下同); 1/2
MS+IBA 1.0；1/2MS+IBA 1.5；1/2MS+IBA 2.0；
1/2MS+IBA 3.0；1/2MS+IBA 4.0；1/2MS+NAA
0.5；1/2MS+NAA 1.0；1/2MS+NAA 1.5；1/2MS+
NAA 2.0；1/2MS+NAA 3.0；1/2MS+NAA 4.0)，
统计不定芽接种 30 d后生根的结果(图 3)表明，
IBA和NAA对‘大红’甜橙上胚轴不定芽的生根
影响较大。随着 IBA浓度的升高，不定芽生根率
和根数均增加；IBA浓度达到最高(4.0 mg·L-1)时，
生根率和根数也达到最高。此外，植株叶片翠
绿，根细长、黄绿色(图 2-c-②)。NAA对不定
芽生根的影响则有所不同。随着 NAA浓度的增
图 1 6-BA对不定芽诱导的影响
Fig.1 Effect of 6-BA on the inducement of adventitious buds
2 不定芽的抗性筛选
考虑到今后遗传转化工作的需要，在诱导不
定芽的同时也筛选了合适的选择压。采用的抗生
素为卡那霉素(Kan)。上胚轴接种在MS+1.0 mg·L-1 6-
BA+Kan (浓度见表 1)培养基中，30 d后观测的结
果(表 1)表明，选择压为 0时，不定芽诱导率为
97.14%，外植体两端愈伤组织再分化能力强，脱
表 1 不定芽的Kan筛选
Table 1 Adventitious buds selection by Kan
Kan浓度 /mg·L-1 外植体数 /个 芽诱导数 /个 诱导率 /%
0 3 5 3 4 97.14
25 3 7 3 1 2
50 3 7 0 0
100 3 5 0 0
150 3 2 0 0
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要从 2个方面着手，直接生根成苗和通过茎尖嫁
接间接成苗。在抗性芽直接生根的预备试验中，
采用 1/2MS+IBA (3、4、5 mg·L-1)和 1/2MS+NAA
(0.1、0.2、0.3 mg·L-1)进行诱导的结果表明，加
IBA的抗性芽极难生根，并逐渐黄化死亡(图 2-d-
④); 加 NAA的抗性芽生根量少，抗性芽基部略
膨大，根较粗壮，呈黄绿色，植株生长良好。
NAA浓度为 0.3 mg·L-1时，抗性芽生根效果最好
(图 2-d-⑤)。
4 试管苗移栽
试管苗移栽前，在组培室里先半敞开培养瓶
的盖，48 h后盖完全敞开。再经过 3 d左右，小
心取出试管苗，用自来水洗净根系上的培养基，
然后栽培到直径约 25 cm的花盆中。基质由白沙
土和棉籽壳对半组成。之后将花盆移到温室中，
用半透明薄膜覆盖，薄膜上钻几个小洞以适当通
风，防止膜中空气湿度过大，一个月后去掉薄
膜。移栽成活率达到 9 5% 以上。
图 2 ‘大红’甜橙实生苗上胚轴离体培养和植株再生
Fig.2 Culture in vitro and plant regeneration from epicotyl of ‘Dahong’sweet orange seedlings
　　a. 6-BA浓度为 1 mg·L-1的不定芽诱导；b. 6-BA浓度为 0 mg·L-1的上胚轴不定芽诱导；c. IBA和 NAA对不定芽根的诱导(①
NAA浓度为 4.0 mg·L-1的根生长；② IBA浓度为 4.0 mg·L-1的根生长；③ NAA浓度为 1.5 mg·L-1的根生长); d. IBA和NAA对抗
性芽根的诱导(④ IBA浓度为 4.0 mg·L-1的根生长；⑤ NAA浓度为 0.3 mg·L-1的根生长)。
图 3 IBA和NAA对根诱导率和生根数的影响
Fig.3 Effects of IBA and NAA on the rooting rate and
number of roots
加，不定芽生根率和平均根数逐渐增加，当浓度
达到 1.5 mg·L-1时，两者值最大，分别为 92.31%和
1 .8 8 条根。此时，植株叶色翠绿，基部膨大，
根粗壮、黄绿色(图 2-c-③)。NAA浓度继续上升
时，生根率和根数反而下降，植株叶片变黄，基
部膨大及其明显，根较粗、黄白色(图 2-c-①)。
此外，为了解决抗性芽成苗问题，我们又主
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讨　　论
柑桔大都具有多胚性，同一颗种子常存有性
胚和珠心胚，珠心胚能重现母珠的性状。本文采
用的‘大红’甜橙实生苗多由珠心胚发育而来。
‘大红’甜橙上胚轴在不加生长调节剂的情
况下，不定芽诱导率为 75%，当 6-BA浓度高于
4 mg·L-1，诱导率低于 47.5%。推测上胚轴可能
含有一定量的内源生长素。当外源生长素浓度过
高，反而会抑制不定芽的萌发。在不加 6-BA时，
主要形成单芽，加入低浓度的6-BA则会增加单个
外植体的成芽数。这个与董高峰等(2001)诱导沙
田柚不定芽的结果基本上一致。
IBA和 NAA 均能促进‘大红’甜橙生根，
‘大红’甜橙实生苗生根的最佳 IBA浓度可能高
于 4.0 mg·L-1。NAA浓度超过 1.5 mg·L-1则抑制生
根。IBA和 NAA对‘大红’甜橙抗性芽根的诱
导有显著差异。前者表现抑制生根，后者浓度低
促进生根。不同外植体的根诱导速度不一样。
前人的研究表明，柑桔再生率比较低(伊华
林等 2001)。从本文结果来看，‘大红’甜橙实
生苗的上胚轴再生比较容易，在适当条件下可以
获得较高的再生率，比一般柑桔的再生率高出
2.5%~20.5%。
近年来，随着生物技术的发展，通过遗传转
化技术培养优良的柑桔新品种已成为一种趋势，
Yang等(2000)、Costa等(2002)、Kayim等(2004)、
石玮等(2002)和敖小平等(2005)先后采用农杆菌介
导法将目的基因导入柑桔中，并取得一定成效。
因此，本文建立的‘大红’甜橙的组织培养和
植株再生体系，可能会有助于这方面工作的开
展。
参考文献
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