全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 3期，2004 年 6 月 385
收稿 2003-07-08 修定 　 2003-12-01
资助　 暨南大学引进人才启动基金(692016和 692017)。
* E-mail:tmsm@jnu.edu.cn, Tel:020-85228476
高等植物叶绿体基因组的转化
马三梅* 王永飞
暨南大学生物工程学系，广州 510632
The Chloroplast Genome Transformation in Higher Plants
MA San-Mei*, WANG Yong-Fei
Department of Bioengineering, Jinan University, Guangzhou 510632
提要 介绍了高等植物叶绿体基因组转化技术的原理和优点，外源基因导入叶绿体基因组的方法，外源基因与叶绿体基
因组的整合及其表达，常用的叶绿体基因组转化的筛选标记基因及其去除的研究进展。
关键词 叶绿体基因组转化；转基因植株；筛选标记基因
自从植物转基因技术诞生以来，采用农杆菌
介导法或基因枪等方法将外源基因导入细胞核一直
是其主要的研究方向[1]。目前，细胞核转基因技
术已经相当成熟，并且已被广泛用于基础研究和
应用研究[2]。然而，随着研究的不断深入，人们
逐渐认识到细胞核转基因技术有其难以克服的缺
点。例如由于细胞核基因组大，遗传背景复杂，
外源基因的整合位点和拷贝数难以人为控制，造
成外源基因表达效率低，在后代中表达不稳定，
以及容易出现“基因沉默”(gene silence)和“位
置效应”(position effect)等现象[3]。另外由于核基
因容易随花粉扩散，其所带来的生态安全性问
题，正在全球范围内引起人们的关注[4]。为了克
服细胞核转基因技术的缺点，叶绿体基因组转化
已成为植物转基因技术的另外一个目标。本文对
高等植物叶绿体基因组转化技术的原理、优点和
发展等进行介绍。
1 叶绿体基因组转化的原理
1988 年，Boynton 等[5]采用基因枪轰击法，
首次成功地将外源基因导入单细胞的莱茵衣藻
(Chlamydomonas reinbardii)中，并获得外源基因
稳定表达的转基因单细胞藻类。其后，Svab 等[6]
将此项技术应用于高等植物，并获得烟草的叶绿
体转基因植株。到目前为止，已在烟草、拟南
芥、马铃薯、油菜、番茄和水稻等植物中实现
了叶绿体基因组转化[7]。这一转化体系的建立有
可能为植物基因转化提供一种新的有效途径。
叶绿体基因组转化技术之所以能够实现，主
要是基于以下原理和方法：(1)利用了同源重组
(homologous recombination)机制，将外源基因定
点整合到叶绿体基因组。在构建叶绿体表达载体
时，一般都在外源基因的两侧各连接一段叶绿体
的 DNA 序列，这两个片段称为同源重组片段或定
位片段(targeting fragment)。当载体导入叶绿体
后，通过这两个片段与叶绿体基因组上的同源片
段发生重组，外源基因就可以整合到叶绿体基因
组的特定位点[8]。 (2)采用筛选标记基因实现叶绿体
基因组的同质化(homogenization)。由于叶绿体基
因组通常以高拷贝数存在，一般每个细胞有成千
上万个叶绿体基因组，因而同时转化这么多基因
组几乎是不可能的，极易出现转化的和未转化的
叶绿体组成的异质体(heteroplasmon)，无法保证
获得的性状稳定遗传下去。因此叶绿体基因组转
化所面临的一个关键问题就是去除未转化的基因组
和未转化的叶绿体。这个问题的解决是通过向叶
绿体表达载体中加入筛选标记基因，转化后进行
抗性筛选，淘汰未转化的叶绿体，以实现转化叶
绿体基因组的同质化[9]。 (3)采用叶绿体特异的启动
子和终止子实现外源基因的高效表达。为了使外
源基因整合进叶绿体基因组后能够高效表达，在
构建转化载体时，一般选用叶绿体来源的启动子
和终止子。例如常用的启动子为叶绿体的
植物生理与分子生物学Plant Physiology and Molecular Biology
植物生理学通讯 第 40 卷 第 3期，2004 年 6 月386
16SrRNA基因的启动子Prrn和光系统Ⅱ作用中心
的启动子PpsbA; 常用的终止子为叶绿体的psaA基
因的终止子TpsbA和rps16基因的终止子Trps16[10]。
由于使用了叶绿体来源的启动子和终止子，从而
可以保证外源基因在叶绿体中的正常表达。
2 叶绿体基因组转化的优点
与细胞核转基因技术相比，叶绿体基因组转
化具有下列优点：(1)表达量高。植物细胞中含有
多个叶绿体，而每个叶绿体中又含有多个基因组
拷贝。例如以显花植物为例，每个叶肉细胞中约
有数个甚至 100 多个叶绿体颗粒，而每个叶绿体
中又含有100 多个基因组拷贝[11]。由于叶绿体基
因组的拷贝数非常大，所有整合在其中的外源基
因也会以高拷贝数存在，这就必然为外源基因的
高效表达提供了条件。例如McBride等[12]将 Bt毒
素蛋白基因转入烟草叶绿体，Bt毒素蛋白的表达
量高达叶子总蛋白的 3%~5%，而通常的核转化技
术只能达到0.001%~0.6%。 (2)原核基因无需修饰
改造就能直接表达。由于叶绿体大多数基因的结
构、转录和翻译系统均与原核生物类似[13]，因此
对于来源于原核生物的外源基因(例如Bt毒素蛋白
基因，固氮的nif基因)无需修饰改造就可直接在叶
绿体内高效表达。侯丙凯和陈正华[14]采用苏云芽
孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中得到的野生型Bt蛋
白基因cry1Aa10，以油菜叶绿体rps7基因和ndhB
基因作为同源重组片段、烟草叶绿体 16SrRDNA
基因的启动子Prrn 和 psb 基因的终止子TpsbA3，
构建了油菜叶绿体基因组转化载体 pNRAB。用基
因枪法将其导入油菜“H16 5”的子叶柄中，实
现了抗虫基因对油菜叶绿体基因组的定点整合。
所获得的叶绿体转基因植株具有抑制幼虫生长和杀
虫的作用。 (3)便于遗传操作。叶绿体基因组小，
结构简单，烟草、水稻等许多高等植物的叶绿体
全序列已被测定[15]，遗传背景比较清楚，便于遗
传操作。 (4)可以实现定点整合。外源基因可通过
同源重组定点整合进叶绿体基因组，这方面已有
许多成功的报道[16], 定点整合有利于控制外源基因
的正确表达，维持植物基因的正常功能，对植物
的生长发育也不会造成任何不利影响。 (5)易于保
持纯系、后代不分离。一旦得到纯合的叶绿体基
因组转化体，由于叶绿体的母性遗传特征[17]，不
会因为有性杂交而发生分离，因此这种纯系可以
得到保持。 (6)导入的外源基因性状稳定性高。外
源基因的定点整合可以避免基因的“位置效应”
(position effect)和“基因沉默”(gene silence)以及
有害转基因植株的出现，因此增加了外源基因表
达的稳定性[18]。 (7)多个基因可以同时表达。由于
大多数叶绿体基因都以多顺反子(polycitron)为转录
单位[19]，产生多顺反子 mRNA 来合成蛋白质，所
以由一个启动子引导下的多个外源基因可以同时在
叶绿体中得到表达。例如De Cosa等[20]把控制内
毒素合成的cry2Aa2基因的操纵子(cry2Aa2 operon)
一次导入烟草的叶绿体中，通过PCR 和 Southern
杂交证实cry2Aa2 操纵子已稳定地整合到了烟草的
叶绿体基因组。在成熟叶片中外源蛋白的积累可
以达到总可溶蛋白的 45.3%，在老的叶片中可稳
定地保持在46.1%, 因此在整个生长季节增加了转
基因植株的安全性和功效。这是目前报道的转基
因植株最高的外源基因表达水平。正常情况下比
较难控制的害虫(例如十龄日的棉铃虫和甜菜的粘
虫)，当喂食转基因叶片后，会被 100% 杀死。电
子显微镜观察发现，杀虫蛋白折叠成了立方形的
晶体。外源蛋白晶体的形成增加了其稳定性，保
护其不受细胞蛋白酶的消化。这也表明，在转基
因植株中表达一个操纵子的方式，为通过一次转
化把多个基因导入植物开辟了一种新的途径。 (8)
可降低外源基因产物对细胞的影响。由于表达出
来的蛋白质和细胞质隔离，因此可以避免对细胞
质生化代谢所造成的不良影响。 (9)叶绿体基因组
转化的外源基因表达具有组织特异性。通过此种
技术得到的转基因植物叶子中的杀虫蛋白质的含量
高，可以提高植物的抗虫性。这对以叶子为生物
反应器来生产外源蛋白是非常有利的。 (10)安全性
好。外源基因整合进叶绿体基因组后，由于在受
精过程中，只有花粉细胞核穿过胚珠，花粉的细
胞质一般不向后代传递[21]，因此通过叶绿体基因组
转化获得的转基因作物可以避免外源基因的扩散，
降低了由于外源基因扩散而引起的生态风险。例如
利用叶绿体基因组转化技术得到的转基因烟草和番
茄已经成功地避免外源基因的扩散[22,23]; 并且叶绿体
基因组转化可以避免外源基因的扩散已得到大田中
试验的证实。Scott和Wilkinson[24]在英国泰晤士河
沿岸的 34 km 地区，研究叶绿体转基因油菜外源
基因扩散的情况。3 年的结果表明，叶绿体转基
因油菜不像核基因转化油菜那样外源基因可以随花
粉而扩散。叶绿体转基因油菜外源基因扩散的可
能性非常小，这就保证了基因工程的安全性。
3 高等植物叶绿体基因组转化技术
随着研究的不断深入，叶绿体基因组转化技
术在外源基因的导入、外源基因的整合与表达、
转基因植株的筛选等方面都取得了长足的发展。
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3.1 外源基因导入叶绿体基因组的方法 目前外源
基因导入叶绿体的方法主要有花粉管导入法、农
杆菌介导转化法、PEG 介导转化法、显微注射及
激光注射法、基因枪转化法和转运肽介导的叶绿
体间接转化法等。
3.1.1 花粉管导入法 刘博林等[25]采用花粉管导入
法，在子房发育的合子期，将含有atrazine基因
psbA的pBR322质粒导入对atrazine敏感的大豆子
房中，直接用atrazine涂抹叶片检测子代植株，筛
选获得了抗atrazine的植株。进一步经分子杂交检
测证实，pBR322 质粒 DNA 已存在于大豆的叶绿
体中，但未证明外源 DNA 是否已整合进大豆的叶
绿体基因组中。
3.1.2 农杆菌介导转化法 用农杆菌Ti质粒系统介
导植物转化是核基因组转化的常用方法。但这一
技术用于叶绿体基因组的转化并不多见。早在
1985年，De Block等就采用农杆菌介导法将构建
在Ti质粒上的CAT基因转化烟草，获得氯霉素抗
性植株，并证明抗性符合母系遗传规律，表明
CAT 基因已整合进叶绿体基因组。但在无氯霉素
的培养基上，转化植株很快失去 CAT 基因。因此
他们的研究结果引起了人们的很大争议[26]。此后
Venkateswarlu和Nazar[27]采用T-DNA载体，在npt
Ⅱ基因两端加上叶绿体的 5srDNA 序列，采用叶
盘法转化烟草的结果表明，npt Ⅱ基因已整合到叶
绿体基因组上，并得到卡那霉素抗性植株。但由
于农杆菌法转化成功的例子较少，此法是否真正
适用于叶绿体转化，还待进一步研究。
3.1.3 PEG介导转化法 Golds等[28]采用PEG介导
的方法实现了烟草的叶绿体转化。随后Koop[29]利
用 PEG介导法将aadA基因导入烟草的叶绿体基因
组。但总的来说，PEG 介导法的转化效率较低，
并且原生质体的制备和再生比较困难，从而限制
了这一方法的普遍应用。
3.1.4 显微注射及激光注射法 通过显微注射及激
光注射(microinjection and laser-injection)法将外源
基因直接导入叶绿体腔，可以克服叶绿体双层膜
的障碍，是叶绿体基因组转化的一种有用的方
法。Weber[30]用波长为 343 nm 的激光照射处于
DNA 溶液中的油菜离体叶绿体后，观察到叶绿体
膜上即出现持续时间为1.2 s的小洞，并证明外源
D N A 已进入叶绿体中。
Knoblauch 等[31]研究开发出了一种称为“毫
微注射技术”(femtojection technique)的叶绿体基因
组转化方法。此法用一种亚显微直径为0.1 mm的
微型注射器(femtosyringe)可以将 10-15 L(fL，
femtoliter)的外源DNA直接导入完整植物细胞的叶
绿体。此种注射器是根据镓(gallium,Ga)、铟
(indium,In)和锡(tin,Sn)组成的液态合金
“galinstan”的热膨胀原理制造的。由于这种合
金具有很好的热传导性，热诱导的galinstan 膨胀
可以很好地控制注射速率，注射器不会对叶绿体
细胞器造成明显的损伤。因此，此种技术可能是
叶绿体基因组转化的一种有效的方法。但此技术
能否取代其它方法，仍有待进一步实验。
3.1.5 基因枪转化法 基因枪是目前叶绿体基因组
转化采用最多、转化效率最高的方法[32]。大多数
已经成功的叶绿体基因组转化都是用这种方法实现
的[33]。例如任延国等[34]用基因枪转化法将Bt毒素
蛋白基因导入烟草叶绿体基因组，转基因植株对
鳞翅目害虫即表现出较高的抗虫性。基因枪转化
法具有转化效率高、转化后的组织可以迅速再生
成植株的特点，并且这一方法适合于不同种类的
植物，其缺点是成本较高。
3.1.6 转运肽介导的叶绿体间接转化法 这方法是
在构建植物表达载体时，把目的基因和叶绿体的
转运肽编码序列相连，然后用细胞核转化技术把
外源基因导入植物细胞。这样目的基因编码的蛋
白质就有可能在转运肽的引导下输送到叶绿体颗粒
中去，从而克服叶绿体 D N A 多拷贝的问题，并
且在很大程度上还可缓解转化体的分离。例如
Bogorad[35]将 psbA同转运肽序列融合后，通过Ti
质粒导入烟草的核基因组后，在细胞质中合成的
融合蛋白基因产物在转运肽的作用下输入到叶绿体
腔内，间接地实现叶绿体的转化。
采用转运肽介导目的基因的方法虽然没有整
合到叶绿体基因组，但可以使目的基因的产物蛋
白定位到叶绿体。由于细胞核转基因技术已经相
当成熟，因此，这种间接的采用转运肽介导叶绿
体转化的方法可能是一条有希望的途径。
3.2 外源基因与叶绿体基因组的整合及其表达 当
载体导入叶绿体后，外源基因就利用同源重组机
制定点整合进叶绿体基因组。由于叶绿体基因组
小，结构简单，遗传背景比较清楚，这就为外
源基因利用同源重组机制定点整合进叶绿体基因组
奠定了基础。在以研究基因功能为目的的叶绿体
基因组转化中，通常以所研究基因的两端序列作
为同源重组片段，报告基因就插入在这两段序列
之间，当同源重组发生以后，报告基因即可插入
目的基因的内部，造成了插入失活，从而可从植
物的表型来了解被破坏基因的功能[36~38]。在以作
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物改良为目的的叶绿体基因组转化中，要求同源
重组发生以后，外源基因的插入既不引起叶绿体
基因原有序列的丢失，又不至于破坏原有基因的
功能。为满足这一要求，已有的工作都选用了
相邻的两个基因作为同源重组片段，例如：
rbcL/aacD、16strnV/rps2rps7、psbA/trnK、
rps7/-ndhB[39,40]。当同源重组发生以后，外源基
因定点插入在两个相邻基因的间隔区，从而保证
原有基因的功能不受影响。
目前, 叶绿体表达载体基本上都具有植物特异
性，也就是说，特异重组片段来自哪种植物，所
构建的载体就适用于那种植物[ 9 , 1 1 ] 。最近，
Dianiell和Dhingra[41]用烟草叶绿体基因trnA和trnI
作为同源重组片段，构建了可用于多种不同植物
叶绿体基因组转化的通用载体(universal vector)。
由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度
保守的，例如，在烟草和水稻中，trnA和trnI两
个基因的同源性均为100%，这就为构建实用的新
型叶绿体表达载体提供了一个很好的思路。
3.3 叶绿体基因组转化的筛选标记基因
3.3.1 常用的叶绿体基因组转化的筛选标记基因 目
前，在叶绿体的转化过程中，主要用突变型的
16srDNA、npt Ⅱ和 aadA 基因作为筛选标记基因。
突变型的16srDNA来自烟草的突变细胞系，可以使
转化的细胞具有抗壮观霉素(spectinomycin)、链霉
素(streptomycin)和林可霉素(licomycin)的能力[42]。
在早期的叶绿体基因组转化中都应用了此种筛选标
记[9]，但转化频率较低。
nptⅡ基因编码新霉素磷酸转移酶(neomycin
phosphotransferase)，能赋予转化细胞抗卡那霉素
(kanomycin)的能力。这是细胞核转基因中常用的
一种筛选标记。1993年，Carrer等[43]首次将其作
为叶绿体基因组转化的筛选标记。结果发现，在
50 mg.mL-1卡那霉素的选择压力下，能同时筛选到
叶绿体基因组转化体和细胞核转化体。但在 500
mg.mL-1 卡那霉素的选择压力下，由于细胞核转化
体不能抗如此高的浓度而被淘汰掉，因此 npt Ⅱ
基因也可以作为质体转化的筛选标记。
aadA可以编码合成氨基糖苷-3-腺苷酸转移酶
(aminoglycoside-3-adenyltransferase)，使转化植株
具有抗壮观霉素和链霉素的能力。所以在筛选的
过程中能将绿色的转化细胞和随时间逐渐白化的非
转化细胞区分开[44]。但是由于每个植物细胞含有
的叶绿体基因组拷贝数很大(3 000~10 000拷贝)，
所以常有嵌合型组织出现的情况，也就是转化细
胞和正常细胞交错，进而造成筛选的困难。特别
是在转化非绿色组织的叶绿体时，对转化细胞的
筛选就更加困难。此外，有许多单子叶植物本身
对壮观霉素具有抗性，也使得筛选比较困难。在
有些植物中，壮观霉素可造成不可逆的白化和叶
绿体基因组的缺失，也是导致叶绿体基因组转化
技术在这些植物中失败的原因。
另外，Lutz等[45]将 bar基因转入烟草的叶绿
体基因组中，bar基因可以合成草丁膦乙酰转移酶
(phosphinothricin acetyltransferase)，进而把除草剂
草丁膦(phosphinothricin, PPT) 分解，使得转化植
株对 PPT 具有抗性，因此可采用 PPT 进行筛选。
Huang 等[46]用基因枪轰击法和 PEG 介导转化法将
来自Acinetobacter baumannii 的氨基糖苷磷酸转移
酶(aminoglycoside phosphotransferase)基因aphA-6
导入烟草的叶绿体基因组，用卡那霉素进行筛
选，也获得了叶绿体转基因植株。
最近 Kn a n 和 Ma l i g a [4 7]报道了一种称为
“FLARE-S”的筛选标记方法，即把 aadA 基因
和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基
因gfp同时构建在叶绿体表达载体中。当转化叶绿
体后，被转化的叶绿体即产生出两种基因的融合
蛋白。这样转化植株即同时既具有抗壮观霉素和
链霉素的能力，又有发散荧光的能力，所以研究
者能够很方便地从嵌合组织中挑选出被转化的组织
块，可用来筛选及追踪转化叶绿体的分离情况。
此法特别适用于禾谷类作物非绿色胚性细胞系的叶
绿体基因组转化研究，应用这样的方法可能会加
快非绿色组织的叶绿体基因组转化的筛选过程。
3.3.2 筛选标记基因去除 用筛选标记基因筛选是
叶绿体基因组转化的必要手段。但是，一旦完成
筛选而得到所需要的转化植株之后，筛选标记基
因就不需要了。由于叶绿体基因组的拷贝数非常
大，因此也使得筛选标记基因会同步放大。为避
免筛选标记基因例如抗生素基因aadA等转移到环
境而造成对生态环境的破坏，以及为降低大众对
转基因植物的疑虑，在获得转基因植株之后，应
将筛选标记基因去除。目前已有一些报道。
Fischer等[48]根据同源重组的原理，在aadA基因两
端加上重复序列(direct repeats)，在没有选择压的
生长条件下，经过几代的细胞分裂后可以将aadA
基因从叶绿体中除去。
Cre-lox是噬菌体P1(P1 bacteriophage)的一类
位点特异的重组(site specific recombination)系统，
Cre基因编码一个38.5 kD的重组酶，此种重组酶
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催化由34 bp组成的 Lox位点间的DNA相互交换。
Corneille等[49]用Cre-lox 系统去除叶绿体基因组中
的标记基因,具体是在最初设计转化载体时，于标
记基因的两端放入 Lox 序列，得到转化植株后，
再用转化植株作母本和含有Cre基因的细胞核转基
因植物的花粉进行杂交，即可把标记基因去除，
而细胞核的 Cre 基因，则可在下一代中分离而去
除。Hajdukiewicz等[50]采用同样的方法也得到了
类似的效果。
改用其它安全性较高的标记基因，也是避免
外源转化基因对生态环境造成潜在危害性的另一种
研究方向。例如Daniell等[51]用菠菜的甜菜醛脱氢
酶(betaine aldehyde dehydrogenase, BADH)基因作
为烟草叶绿体基因组转化的筛选标记基因，可以
避免去除 aadA 基因的问题。在筛选过程中 BADH
可以把有毒性的甜菜醛(betaine aldehyde, BA)转化
为没有毒性的甘氨酸甜菜碱(glycine betaine, GA)。
BA 作为选择标记与传统的用抗生素壮观霉素进行
筛选的方法相比，其转化效率明显提高；GA 作
为一种渗透保护剂，也显著提高转基因植株的再
生率。例如在 BA 选择作用下，12 d 内有 80% 的
转化叶盘出现转基因芽，每个叶盘平均达到23个
转基因芽；而用壮观霉素选择， 45 d内只有15%
的转化叶盘出现转基因芽，每个叶盘平均只有
1~2个芽。进一步的Southern杂交证实，外源基
因 BADH 已稳定整合到叶绿体基因组。转基因烟
草植株的 BADH 活性在不同的发育阶段比未经转
基因的高出 15~18 倍。此种性状在后代中可以稳
定遗传。这是没有使用抗生素筛选的高等植物叶
绿体转基因的首例报道。采用菠菜中本身就具有
的自然基因作为选择标记基因，可减轻人们对转
基因作物的担心。
4 结论和展望
迄今为止，叶绿体基因组转化技术只在拟
南芥、烟草、油菜、番茄、马铃薯和水稻等
少数植物中获得成功。主要是由于在其它作物
中还没有建立起良好的筛选和再生体系，而且
在一些非绿色组织例如果实、块根等储藏器官
中的表达量很低。随着技术的不断进步，最近
番茄的叶绿体基因组转化已有成功的例子。例
如Ruf等[52]建立了一个良好的番茄叶绿体基因组
转化体系，能够使外源蛋白基因在果实的特化
叶绿体——有色体(chromoplast)内大量表达。他
们获得的转基因番茄，外源基因在其果实有色
体内的表达量为叶子叶绿体表达量的 50%。这
是叶绿体基因组转化在果实中高效表达的首例报
道。马铃薯也是一个叶绿体基因组转化在非绿
色组织中高效表达的成功例子。Sidorov等[53]用
GF P 作为可视性的选择标记，也得到高效表达
的马铃薯叶绿体转基因植株。
采用gus或gfp作为报告基因转化其它一些植
物(如辣椒、萝卜、万寿菊)后，外源基因在这些
植物的叶绿体中也可瞬时表达[54]。只有外源基因
整合进叶绿体的基因组中，并可稳定遗传后，才
可以获得叶绿体转基因植株。但在这些作物中尚
未获得叶绿体转基因植株[55]。
我国叶绿体基因组转化研究才刚刚开始。今
后尚应建立高效、快速的叶绿体基因组转化体
系，以扩大其应用的范围。如在早期农杆菌转化
技术只能在双子叶植物中应用，而目前则已广泛
应用到各种植物中。深信不久叶绿体基因组转化
技术将为植物基因工程研究带来新的生机和活力，
也将更广泛地应用到叶绿体基因组的基础研究和作
物遗传改良的实践中去。
参考文献
1 闫新甫. 转基因植物. 北京：科学出版社, 2003.81~116
2 Nap JP, Metz PLJ, Escaler M et al. The release of genetically
modified crops into the environment. Plant J, 2003,33:1~18
3 林忠平. 走向21世纪的植物分子生物学. 北京：科学出版
社，2000.446~454
4 吴志平，徐步进. 转基因植物释放后在环境中成为杂草的风
险性. 生物工程进展，1999,19(1):9~13
5 Boynton JE, Gillham NW, Harris EH et al. Chloroplast transfor-
mation in Chlamydomonas with high velocity microprojection.
Science, 1988,240:1534~1538
6 Svab Z, Hajdukiewicz P, Maliga P. Stable transformation of plas-
tids in higher plants. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87:
8526~8530
7 張清俊. 高等植物葉綠體的基因轉殖與植物生物技術. 科學農
業, 2002,50(5,6):243~248
8 Staub JM, Maliga P. Long region of homologous DNA are in-
corporated into the tobacco plastid genome. Plant Cell, 1992,4:
39~45
9 侯丙凯，陈正华. 高等植物的质体基因转化. 生物工程进展，
2000,20(1):70~73
10 侯丙凯，于慧敏，夏光敏. 用于叶绿体遗传转化的表达载
体. 遗传，2002,24(1):100~103
11 范国昌，张中林，沈桂芳. 叶绿体遗传转化的研究. 细胞生
物学杂志，1998,20(4):169~174
12 McBride KE, Svab Z, Schaaf DF et al. Amplification of a chi-
meric Bacillus gene in chloroplasts leads to an extraordinary
level of an insecticidal protein in tobacco. BioTechniques, 1995,
13: 362~365
13 李瑞雪，黄粤，李宝健. 叶绿体基因表达调控的研究进展.
生命科学, 1998,10(1):13~17
植物生理学通讯 第 40 卷 第 3期，2004 年 6 月390
14 侯丙凯，陈正华. 苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因克隆及油菜
叶绿体遗传转化研究. 遗传，2001,23(1):39~40
15 曹仪植. 植物分子生物学. 北京：高等教育出版社, 2002.
18~33
16 Heifetz BP. Genetic engineering of the chloroplast. Biochimie,
2000,82(6,7):655~666
17 Hurst LD. Cytoplasmic genetics under inbreeding and out
breeding. Proc Roy Soc Lond B, 1994,258:287~298
18 朱建明. 叶绿体的遗传转化. 中山大学研究生学刊(自然科学
版), 1999,20(4):5~10
19 余叔文，汤章城. 植物生理与分子生物学. 第2版. 北京：
科学出版社, 2001.155~170
20 De Cosa B, Moar W, Lee SB et al. Overexpression of the Bt
cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal
crystals. Nat Biotechnol, 2001,19:71~74
21 Hageman R, Schroeder M. The cytological basis of plastid in-
heritance in angiosperms. Protoplasma, 1989,152:57~64
22 Daniell H, Datta R, Varma S et al. Containment of herbicide
resistance through genetic engineering of the chloroplast genome.
Nat Biotechnol, 1998,16:345~348
23 Henry D. Molecular strategies for gene containment in transgenic
crops. Nat Biotechnol, 2002,20:581~586
24 Scott SE, Wilkinson MJ. Risks of transgene escape from
transplastomic oilseed rape. Nat Biotechnol, 1999,17:390~392
25 刘博林, 岳绍先, 胡乃璧等.龙葵Atrazine抗性基因向大豆叶
绿体的转移及在转基因植株中的表达.中国科学( B 辑)，
1989,7:699~705
26 吴乃虎. 基因工程原理.第2版. 北京：科学出版社, 2001.
356~360
27 Venkateswarlu H, Nazar RN. Evidence for T-DNA mediated gene
targeting to tobacco chloroplasts. BioTtechniques, 1991,9:1103～
1105
28 Golds T, Maliga P, Koop HU. Stable plastid transformation in
PEG-treated protoplasts of Nicotiana tabaccum. BioTtechniques,
1993,11:95~97
29 Koop HU. Integration of foreign sequences into the tobacco plas-
tid via PEG-mediated protoplast transformation. Planta, 1996,
199:193~201
30 Weber G . Uptake of DNA in chloroplast Brassica napus facili-
tated by a UV-laser microbeam. Eur J Cell Biol, 1989,49:73～
79
31 Knoblauch M, Julian MH, John CG et al. A galinstan expansion
femtosyringe for microinjection of eukaryotic organelles and
prokaryotes. Nat Biotechnol, 1999,17:906~909
32 李宏韬, 赵淑青, 赵彦修等. 叶绿体基因工程简介. 遗传, 2003,
25(4):495~498
33 黎昊雁, 王玮. 新一代转基因植物研究进展. 中国生物工程杂
志, 2003,23(6):22~26
34 任延国, 邹竹荣, 张中林等. 基因枪微弹轰击烟草叶绿体遗传
转化体系的建立. 农业生物技术学报, 1997,5(1):47~53
35 Bogorad L. Engineering chloroplasts: an alternative site for for-
eign genes, proteins, reactions and products. Trends Biotechnol,
2000, 18:257~263
36 Shikanai T, Endo T, Hashimoto T et al. Directed disruption of
the tobacco ndh gene impairs cyclic electron flow around photo-
system I. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95:9705~9707
37 Hager M, Biehler K, Illerhaus J et al. Targeted inactivation of
the smallest plastid genome-encoded open reading frame reveals
a novel and essential subunit of the cytochrome b6/f complex.
EMBO J, 1999,18:5834~5842
38 Burrows PA, Leonid A, Svab Z et al. Identification of a func-
tional respiratory complex in chloroplasts through analysis of
tobacco mutants containing disrupted plastid ndh genes. EMBO
J, 1998,17:868~876
39 Zoubenko OV, Allison LA, Svab Z et al. Efficient targeting of
foreign genes into the tobacco plastid genome. Nucleic Acids
Res, 1994,22:3819~3824
40 Daniell H, Khan MS, Allison L. Milestones in chloroplast ge-
netic engineering: an environmentally friendly era in
biotechnology. Trends Plant Sci, 2002,7:84~91
41 Daniell H, Dhingra A. Multiple gene engineering: dawn of an
exiting new era in biotechnology. Curr Opin Biotechnol, 2002,
13:136~141
42 Moll B, Polsby L, Maliga P. Streptomycin and licomycin resis-
tance are selective plastid markers in cultured Nicotiana cell.
Mol Gen Genet, 1990,221:245~250
43 Carrer H, Hockenberry TN, Svab Z et al. Kanamycin resistance
as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Mol
Gen Genet, 1993,241:49~56
44 Svab Z, Maliga P. High-frequency plastid transformation in to-
bacco by selection for a chimeric aadA gene. Proc Natl Acad Sci
USA, 1993,90:913~917
45 Lutz KA, Knapp JE, Maliga P. Expression of bar in the plastid
genome confers herbicide resistance. Plant Physiol, 2001,125:
1585~1590
46 Huang F-C, Klaus SMJ, Herz S et al. Efficient plastid transfor-
mation in tobacco using the aphA-6 gene and kanamycin
selection. Mol Gen Genet, 2002,268:19~27
47 Khan MS, Maliga P. Fluorescent antibiotic resistance marker
for tracking plastid transformation in higher plants. Nat
Biotechnol, 1999,17:910~915
48 Fischer N, Stampacchia O, Kevin R et al. Selectable marker re-
cycling in the chloroplast. Mol Gen Genet, 1996,251:373~380
49 Corneille S, Lutz K, Svab Z et al. Efficient elimination of select-
able marker genes from the plastid genome by the Cre-lox site-
specific recombination system. Plant J, 2001,27:171~178
50 Hajdukiewicz PTJ, Gilbertson L, Staub JM. Multiple pathways
for Cre/lox-mediated recombination in plastids. Plant J, 2001,
27:161~170
51 Daniell H, Muthukumar B, Lee SB. Marker free transgenic plants:
engineering the chloroplast genome without the use of antibi-
otic selection. Curr Genet, 2001,39:109~116
52 Ruf S, Hermann M, Berger IJ et al. Stable genetic transforma-
tion of tomato plastids and expression of a foreign protein in
fruit. Nat Biotechnol, 2001,19:870~875
53 Sidorov VA, Kasten D, Pang SZ et al. Stable chloroplast trans-
formation in potato: use of green fluorescent protein as a plastid
marker. Plant J, 1999,19:209~216
54 Sikdar SR, Serino G, Chaudhuri S et al. Plastid transformation
in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Rep, 1998,18:20~24
55 Maliga P. Progress towards commercialization of plastid trans-
formation technology. Trends Biotechnol, 2003,21(1):20~28